Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Riepilogo

Viene presentato un protocollo per l'elaborazione di coclee di gerbillo giovani adulti e invecchiati immunomarcando le strutture sinaptiche afferenti e le cellule ciliate, spegnendo l'autofluorescenza nei tessuti invecchiati, sezionando e stimando la lunghezza delle coclee e quantificando le sinapsi in pile di immagini ottenute con l'imaging confocale.

Abstract

Si presume che la perdita di sinapsi a nastro che collegano le cellule ciliate interne e le fibre nervose uditive afferenti sia una delle cause della perdita dell'udito legata all'età. Il metodo più comune per rilevare la perdita di sinapsi del nastro è l'immunolabeling perché consente il campionamento quantitativo da diverse posizioni tonotopiche in una singola coclea. Tuttavia, le strutture di interesse sono sepolte in profondità all'interno della coclea ossea. I gerbilli sono usati come modello animale per la perdita dell'udito legata all'età. Qui vengono descritti i protocolli di routine per la fissazione, l'immunolabeling dei gerbilli cocleari interi mount, l'imaging confocale e la quantificazione dei numeri e dei volumi delle sinapsi del nastro. Inoltre, vengono evidenziate le particolari sfide associate all'ottenimento di buon materiale da individui invecchiati di valore.

I gerbilli vengono eutanasizzati e perfusi per via cardiovascolare, o le loro bolle timpaniche vengono accuratamente sezionate fuori dal cranio. Le coclee vengono aperte all'apice e alla base e trasferite direttamente al fissativo. Indipendentemente dal metodo iniziale, le coclee vengono postfisse e successivamente decalcificate. Il tessuto viene quindi etichettato con anticorpi primari contro le strutture pre- e postsinaptiche e le cellule ciliate. Successivamente, le coclee vengono incubate con anticorpi secondari marcati con fluorescenza che sono specifici contro i rispettivi primari. Le coclee dei gerbilli invecchiati vengono quindi trattate con un quencher di autofluorescenza per ridurre la fluorescenza di fondo tipicamente sostanziale dei tessuti degli animali più anziani.

Infine, le coclee vengono sezionate in 6-11 segmenti. L'intera lunghezza cocleare viene ricostruita in modo tale che specifiche posizioni cocleari possano essere determinate in modo affidabile tra gli individui. Le pile di immagini confocali, acquisite in sequenza, aiutano a visualizzare le cellule ciliate e le sinapsi nei luoghi scelti. Le pile confocali sono deconvolte e le sinapsi vengono contate manualmente utilizzando ImageJ, oppure viene eseguita una quantificazione più estesa delle strutture sinaptiche con procedure di analisi delle immagini scritte su misura in Matlab.

Introduzione

La perdita dell'udito legata all'età è una delle malattie più diffuse al mondo che colpisce più di un terzo della popolazione mondiale di età pari o superiore a 65 anni e¹. Le cause sottostanti sono ancora in discussione e attivamente indagate, ma possono includere la perdita delle sinapsi specializzate che collegano le cellule ciliate interne (IHC) con le fibre nervose uditive afferenti². Queste sinapsi a nastro comprendono una struttura presinaptica che ha vescicole piene del neurotrasmettitore glutammato legato ad esso, così come i recettori del glutammato postsinaptico α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA) ^3,4,5. Nel gerbillo, ~ 20 fibre nervose uditive afferenti contattano un IHC ^6,7,8. Le fibre sull'IHC di fronte al modiolo si oppongono ai grandi nastri sinaptici, mentre le fibre che si collegano sul lato del pilastro dell'IHC affrontano piccoli nastri sinaptici (cioè nei gatti⁹, gerbilli⁷, porcellini d'India¹⁰ e topi ^{3,11,12,13,14}). Inoltre, nel gerbillo, la dimensione dei nastri presinaptici e dei cerotti di glutammato postsinaptico sono positivamente correlati ^7,14. Le fibre che si oppongono ai grandi nastri sul lato modiolare dell'IHC sono di piccolo calibro e hanno bassi tassi spontanei e soglie elevate¹⁵. Ci sono prove che le fibre a basso tasso spontaneo sono più vulnerabili all'esposizione al rumore¹⁰ e ai farmaci ototossici¹⁶ rispetto alle fibre a bassa soglia ad alta spontaneità, che si trovano sul lato del pilastro degli IHC¹⁵.

La perdita di sinapsi del nastro è il primo evento degenerativo nella perdita dell'udito correlata all'età neurale cocleare, mentre la perdita delle cellule gangliari a spirale e delle loro fibre nervose uditive afferenti è in ritardo rispetto a^17,18. I correlati elettrofisiologici includono registrazioni delle risposte uditive del tronco cerebrale¹⁷ e dei potenziali d'azione composti⁸; tuttavia, questi non riflettono le sottigliezze della perdita di sinapsi, poiché le fibre a basso tasso spontaneo non contribuiscono a queste misure¹⁶. Metriche elettrofisiologiche più promettenti sono l'indice neurale derivato dal potenziale di massa¹⁹ e la risposta temporale peristimulo²⁰. Tuttavia, questi sono affidabili solo se l'animale non ha altre patologie cocleari, oltre alla perdita di fibre nervose uditive, che influenzano l'attività delle restanti fibre nervose uditive⁸. Inoltre, le soglie valutate comportamentalmente nel gerbillo non erano correlate con i numeri di sinapsi²¹. Pertanto, una quantificazione affidabile delle sinapsi del nastro sopravvissute e, quindi, del numero di fibre nervose uditive funzionali è possibile solo mediante l'esame diretto del tessuto cocleare.

Il gerbillo mongolo (Meriones unguiculatus) è un modello animale adatto per lo studio della perdita dell'udito legata all'età. Ha una breve durata della vita, ha un udito a bassa frequenza simile agli esseri umani, è facile da mantenere e mostra somiglianze con patologie umane legate alla perdita dell'udito legata all'età 2,22,23,24. I gerbilli sono considerati invecchiati quando raggiungono i 36 mesi di età, che è vicino alla fine della loro vita media^{di 22} anni. È importante sottolineare che una perdita di sinapsi del nastro legata all'età è stata dimostrata in gerbilli allevati e invecchiati in ambienti tranquilli ^8,21.

Qui viene presentato un protocollo per immunolabel, sezionare e analizzare le coclee da gerbilli di diverse età, dai giovani adulti agli anziani. Vengono utilizzati anticorpi diretti contro i componenti della presinapsi (CtBP2), i cerotti del recettore postsinaptico del glutammato (GluA2) e gli IHC (myoVIIa). Viene applicato un quencher ad autofluorescenza che riduce lo sfondo nelle coclee invecchiate e lascia intatto il segnale di fluorescenza. Inoltre, viene fornita una descrizione di come sezionare la coclea per esaminare sia l'epitelio sensoriale che la stria vascolare. La lunghezza cocleare viene misurata per consentire la selezione di posizioni cocleari distinte che corrispondono a specifiche migliori frequenze²⁵. La quantificazione dei numeri delle sinapsi viene effettuata con il software liberamente disponibile ImageJ²⁶. Un'ulteriore quantificazione dei volumi e delle posizioni delle sinapsi all'interno del singolo HC viene eseguita con un software personalizzato scritto in Matlab. Questo software non è reso disponibile al pubblico, in quanto gli autori non hanno le risorse per fornire documentazione e supporto professionali.

Protocollo

Tutti i protocolli e le procedure sono stati approvati dalle autorità competenti della Bassa Sassonia, Germania, con numeri di permesso AZ 33.19-42502-04-15/1828 e 33.19-42502-04-15/1990. Questo protocollo è per i gerbilli mongoli (M. unguiculatus) di entrambi i sessi. Il giovane adulto si riferisce all'età di 3-12 mesi, mentre i gerbilli sono considerati di età pari o superiore a 36 mesi. Se non diversamente specificato, tamponi e soluzioni possono essere preparati e conservati in frigorifero per un massimo di diversi mesi (4-8 °C). Prima dell'uso, assicurarsi che i tamponi e le soluzioni non siano precipitati.

1. Fissazione e raccolta di organi

NOTA: Se sono necessarie solo le coclee, si consiglia di eseguire la procedura un po 'più semplice di fissazione per immersione. Tuttavia, se è necessario anche un cervello ben conservato, la perfusione transcardica è l'unica opzione. Il fissativo in entrambi i casi è il 4% di paraformaldeide (PFA) nella soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Questo dovrebbe essere appena fatto ma può essere conservato congelato fino all'uso. Utilizzare aliquote di ~ 300 mL per una perfusione transcardica o ~ 50-100 mL per coclea per la fissazione per immersione.

ATTENZIONE: il PFA è una sostanza pericolosa; gestirlo secondo le procedure generali di sicurezza del laboratorio.

1. Fissazione per perfusione transcardica
   1. Lavare la configurazione della perfusione fino a quando il tubo non è privo di bolle d'aria. Riempire il tubo di perfusione con PBS contenente eparina (0,2 ml in 100 ml di PBS) per prevenire la coagulazione del sangue. Interrompere il flusso una volta che il tubo è stato riempito con PBS e la bottiglia di stoccaggio del fluido si è appena svuotata; versare 200 ml di PFA scongelato in esso.
      NOTA: la configurazione è ora pronta per l'animale. Il PBS rimanente nel tubo è sufficiente per scovare il sangue e sarà automaticamente seguito dal fissativo una volta ripreso il flusso.
   2. Garantire che sia in atto un sistema di raccolta dei rifiuti per il deflusso di PFA. Usa una cannula fresca (19 G) e avere grandi forbici, pinze (con una punta appiattita), emostati, bisturi o cannula affilata e un tappetino di gomma con spilli a portata di mano.
   3. Eutanasia del gerbillo con sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital (160 mg / mL, 0,3 mL per animale, intervallo di peso corporeo: 50-120 g). Rimetti l'animale nella sua gabbia. Quando l'arresto respiratorio si manifesta in modo tale che la respirazione diventi irregolare con intervalli di 30 s o più, posizionare il gerbillo sul dorso sul tappetino di gomma e fissare sia le zampe anteriori che una zampa posteriore con gli spilli (lasciare una zampa posteriore libera di muoversi per un migliore giudizio del successo della perfusione; vedere nota dopo il passaggio 1.1.7).
   4. Per aprire la cavità toracica, sollevare la pelle sopra lo sterno con una pinza e tagliare la pelle a circa 0,5 cm sotto lo sterno con le forbici fino a quando il processus xiphoideus di colore bianco è visibile. Tenere lo sterno al processus xiphoideus con una pinza e tagliare lungo il diaframma per ottenere una buona visione nella cavità toracica. Tagliare le costole lateralmente su entrambi i lati fino a quando non c'è un buon accesso al cuore. Assicurarsi che l'angolo delle forbici sia parallelo e piatto rispetto al corpo del gerbillo per evitare danni agli organi e, quindi, garantire un sistema circolatorio chiuso.
   5. Bloccare un emostato sullo sterno, sollevare la gabbia toracica e posizionare l'emostato sopra la spalla del gerbillo senza appoggiare l'emostato su nessuna parte del corpo per evitare di bloccare il flusso sanguigno.
   6. Aprire leggermente il flusso del fluido fino a quando una goccia di PBS fuoriesce dalla cannula (19 G) circa ogni 2 s. Tieni il cuore con una pinza e giralo un po 'a sinistra in modo che il ventricolo sinistro possa essere visto chiaramente. Inserire la cannula nel ventricolo sinistro con un angolo che evita di penetrare nel setto. Tenere l'ago in posizione a mano o con un altro emostato.
      NOTA: I ventricoli sinistro e destro possono essere differenziati per le loro diverse tonalità di colore; il ventricolo sinistro appare di colore più chiaro rispetto al resto del tessuto cardiaco.
   7. Aumentare lentamente la pressione del flusso del fluido e aprire l'atrio destro con forbici fini, un bisturi o un'altra cannula. Aprire ulteriormente il flusso del fluido fino a quando non si osservano circa 2-3 gocce/s nella camera di gocciolamento o impostare un flusso di 4 ml / min per la pompa. Una volta che la fissazione del cuore si instaura, assicurarsi che la cannula di perfusione rimanga in posizione senza essere tenuta ulteriormente.
      NOTA: I segni di perfusione di successo sono contrazioni muscolari lente, irrigidimento del collo e delle estremità, fegato pallido e polmoni rosei. Il segno di perfusione infruttuosa è lo sbiancamento dei polmoni, che indica che la circolazione polmonare è perfusa a causa della puntura del setto.
   8. In caso di perfusione infruttuosa, provare a spostare la cannula più in alto, nell'aorta, e bloccarla in posizione con un emostato.
   9. Decapitare il gerbillo. Rimuovere le bolle e tagliarle e romperne l'osso come descritto al punto 1.2.2.
      NOTA: Se il tessuto non è sufficientemente fisso, l'epitelio sensoriale si sposterà dall'organo di Corti durante la dissezione.
   10. Se la perfusione non mostra segni di fissazione entro 5-10 minuti, interromperla e seguire immediatamente la procedura riportata di seguito per la fissazione per immersione. Per questo, trattare la coclea come nel passaggio 1.2.2 e postfiggere il tessuto in circa 50-80 ml di PFA al 4% in contenitori con tappo a vite per 1-2 giorni su uno shaker 2D a 8 °C.
       NOTA: Poiché può essere difficile valutare la qualità della fissazione durante la perfusione, si consiglia di postfissare regolarmente le coclee come descritto.
2. Fissazione per immersione tissutale
   1. Eutanasia dei gerbilli con sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital (160 mg / mL, 0,3 mL per animale, intervallo di peso corporeo: 50-120 g). Quando il gerbillo ha smesso di respirare, decapitare l'animale.
   2. Rimuovere le bolle e tagliare e rompere il suo osso con forbici e pinze, rispettivamente, per raggiungere le coclee. Rimuovere il maellus, l'incus e i canali semicircolari. Fai piccoli fori all'apice e nel giro basale grattando attentamente l'osso cocleare con una pinza. Trasferire immediatamente le bolle in un eccesso di fissativo freddo (almeno 50 ml) e fissare il tessuto al freddo (4-8 °C) sotto agitazione delicata (2D-shaker [100 rpm]) per 2 giorni.
      NOTA: Dopo aver fissato il tessuto, le coclee possono essere lavorate immediatamente o conservate in PBS con sodio azide allo 0,05%. ATTENZIONE: l'azide di sodio è tossico. Si noti che la durata della conservazione può influenzare negativamente la qualità della colorazione. Studi limitati hanno suggerito che l'immunocolorazione appariva più debole dopo 2 anni di conservazione del tessuto in azide di sodio.

2. Preparazione dei tessuti e immunolabeling

1. Sciogliere la polvere di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS per produrre una soluzione da 0,5 M a pH 8. Per questo, posizionare un becher su un agitatore magnetico, riempirlo con circa la metà della quantità totale del PBS e aggiungere la quantità appropriata di polvere di EDTA, con conseguente sospensione acida. Aggiungere con attenzione la soluzione concentrata di idrossido di sodio (NaOH) durante il monitoraggio del pH con un pHmetro. Riempire con PBS fino al volume finale desiderato e filtrare la soluzione per prevenire la contaminazione microbica.
   NOTA: La polvere di EDTA si dissolverà completamente solo quando la sospensione avrà raggiunto un valore di pH neutro.
2. Per la decalcificazione, trasferire le coclee a 80 ml di 0,5 M EDTA in PBS. Incubare il tessuto al freddo (4-8 °C) sotto una leggera agitazione sullo shaker 2D (100 giri / min) per 2 giorni.
   NOTA: Dopo la fase di decalcificazione, il tessuto può essere conservato in PBS per diversi giorni fino a 3 settimane prima di continuare con le restanti fasi di lavorazione. Per gli anticorpi che etichettano la stria vascolare, è consigliabile tagliare le coclee a metà lungo l'asse modiolare in questo punto (cioè prima dell'immunocolorazione) per garantire un accesso uniforme degli anticorpi ai rispettivi bersagli. Questo è anticorpo-dipendente e non si applica agli anticorpi utilizzati qui per etichettare le strutture sinaptiche e IHC. Utilizzare un pezzo di lama di rasoio frangibile e un supporto per lama (come descritto al punto 4.2) per il taglio.
3. Eseguire i seguenti passaggi (fino al passaggio 3.2) in tubi di reazione a tenuta sicura da 2 ml. Se il pezzo di tessuto è troppo grande per adattarsi all'interno del tubo, tagliare il tessuto in eccesso con le forbici. Per migliorare la penetrazione degli anticorpi, prima permeabilizzare il tessuto in 1 mL di tritone all'1% (Triton X-100) in PBS sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare il tessuto 3x con 1 mL di tritone allo 0,2% (Triton X-100) in PBS sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuno.
4. Per bloccare antigeni non specifici, incubare le coclee in 1 mL di soluzione bloccante (3% albumina sierica bovina [BSA], 0,2% tritone, in PBS) sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente per 1 ora.
   NOTA: la soluzione di blocco può essere preparata in anticipo, ma non deve essere più vecchia di ~ 10 giorni.
5. Diluire i seguenti anticorpi primari appena nella stessa aliquota di soluzione bloccante: anti-mioVIIa (miosina VIIa) per etichettare IHC (coniglio policlonale IgG), diluito 1:400; anti-CtBP2 (C-terminal binding protein 2) per etichettare nastri presinaptici (topo monoclonale IgG1), diluiti 1:400; e anti-GluA2 per etichettare i cerotti del recettore postsinaptico (topo monoclonale IgG2a), diluiti 1:200. Assicurarsi che le coclee siano completamente coperte con la soluzione anticorpale (in genere 0,4 ml) e incubarle a 37 °C per 24 ore.
6. Quindi, lavare il tessuto 5x con lo 0,2% di tritone in PBS sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuno. Scegliere gli anticorpi secondari per abbinare le specie ospiti delle loro controparti primarie e di nuovo diluirli nuovamente in 3% BSA, 0,2% tritone, in PBS: capra anti-topo (IgG1)-Alexa fluoroforo (AF) 488, diluito 1:1.000; capra anti-topo (IgG2a)-AF568, diluito 1:500; e asino anti-coniglio-AF647 (IgG), diluito 1:1.000. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento della fluorescenza. Incubare le coclee in 0,4 mL di soluzione di anticorpi secondari a 37 °C per 24 ore.
   NOTA: Studi limitati hanno indicato che l'incubazione del tessuto cocleare a 37 °C per 24 ore con anticorpi primari e secondari ha portato a immunocolorazione più brillante rispetto alla procedura di incubazione più comune con temperature più basse e durate più brevi.
7. Lavare le coclee 2x con 1 mL di tritone allo 0,2% in PBS per 5 minuti ciascuna e 3x con PBS per 5 minuti ciascuna sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente.
   NOTA: Dopo queste fasi di lavaggio, le coclee possono rimanere in PBS in frigorifero a ~ 4 ° C per diversi giorni.

3. Trattamento con quencher ad autofluorescenza (opzionale)

NOTA: Le coclee di gerbilli di mezza età e invecchiati mostrano un'ampia autofluorescenza di fondo. Nel tessuto giovane adulto, il trattamento con un quencher ad autofluorescenza non è necessario. In linea di principio, è possibile applicare il quencher di autofluorescenza prima della procedura di immunocolorazione, che quindi evita qualsiasi riduzione involontaria della fluorescenza anticorpale desiderata. Tuttavia, secondo la scheda tecnica del produttore, l'uso di detergenti (come Triton X-100 nel protocollo attuale) non è più possibile in quanto rimuovono il quencher dal tessuto.

1. Tagliare le coclee a metà sotto uno stereomicroscopio, come descritto al punto 4.2.
2. Mescolare il quencher ad autofluorescenza con etanolo al 70% per ottenere una soluzione al 5% e incubare le coclee in questa soluzione sullo shaker 2D a temperatura ambiente per 1 minuto. Lavare le coclee 3x con 1 mL di PBS sullo shaker 2D a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna.
   ATTENZIONE: Il quencher ad autofluorescenza è pericoloso e dannoso. Indossare guanti quando si maneggia questa sostanza.

4. Dissezione fine finale

1. Seziona la coclea sotto uno stereomicroscopio. Riempi una capsula di Petri in polistirolo e il suo coperchio con PBS e tieni a portata di mano due pinze sottili, le forbici a molla Vannas, un supporto per lame e una lama di rasoio frangibile. Rompere i pezzi dalla lama di rasoio per ottenere una superficie di taglio di ~ 2-4 mm a seconda della fase di dissezione. Preparare un vetrino per microscopio posizionando tre gocce di terreno di montaggio in fila.
   NOTA: la superficie di taglio della lama del rasoio svanisce rapidamente. La lama deve essere sostituita dopo aver sezionato e montato circa ogni secondo pezzo della coclea.
2. Se non è già stato fatto nel passaggio 3.1, prima tagliare la coclea a metà lungo il modiolo sotto uno stereomicroscopio. Per questo, posizionare un pezzo di una lama di rasoio più lungo della lunghezza arrotolata della coclea in un supporto per lame. Metti la coclea nella capsula di Petri e taglia via il tessuto in eccesso con il pezzo di lama di rasoio. Tenere la coclea in posizione con una pinza fine e tagliarla a metà lungo il modiolo.
3. Inizia con una metà, ma lascia anche l'altra metà nella capsula di Petri. Fissare con cura la metà cocleare con una pinza in modo tale che il tagliente sia rivolto verso l'alto. Utilizzare forbici a molla fine per tagliare via l'osso della coclea sopra l'elicotrema, coprendo l'apice.
4. Per iniziare la separazione dei pezzi cocleari, isolare il giro centrale tagliando con le forbici attraverso il modiolo e il nervo uditivo, sopra (scala vestibuli) e sotto (scala tympani).
5. Tagliare l'osso cocleare che copre la stria vascolare all'interno del dotto cocleare. Fai due tagli su entrambi i lati dell'osso cocleare sopra l'organo di Corti e lungo la stria vascolare e usa la lama del rasoio per separare eventualmente i pezzi cocleari.
   NOTA: La stria vascolare è facilmente visibile come una striscia scura. Il taglio lungo la stria vascolare lascia intatto l'organo di Corti.
6. Facoltativo: Per raccogliere la stria vascolare, tagliare con cura tra l'organo di Corti e la stria vascolare per separare i due. Lasciare la stria vascolare collegata al legamento a spirale (attaccato all'osso che copre la superficie esterna della coclea) e rimuovere l'osso decalcificato usando una pinza. Posizionare il pezzo con il lato stria verso l'alto sul vetrino del microscopio in una goccia di mezzo di montaggio.
   NOTA: se il pezzo raccolto è curvo troppo forte, potrebbe essere necessario dividerlo in pezzi più piccoli in modo che sia abbastanza piatto per il montaggio sulla slitta.
7. Trasferire i pezzi cocleari sul coperchio riempito di PBS della capsula di Petri in polistirolo, assicurandosi che i supporti interi cocleari si trovino il più piatti possibile sulla diapositiva. Rimuovere il tessuto in eccesso, come parti del legamento a spirale sul lato abneurale e parti del limbus a spirale sul lato neurale. Rimuovere con cura la membrana tectoriale con una pinza super fine.
8. Posizionare i pezzi cocleari sulla diapositiva in una goccia di mezzo di montaggio. Posizionare i supporti cocleari interi con l'organo di Corti rivolto verso l'alto sul vetrino per evitare di oscurare gli IHC nel percorso ottico per l'imaging. Cerca l'invaginazione del limbus a spirale in prossimità degli IHC, che è visibile spostando il pezzo cocleare nel piano sagittale per identificare il lato rivolto verso l'alto.
   NOTA: Per ricostruire digitalmente la coclea completa dai suoi singoli pezzi durante l'ulteriore lavorazione, si consiglia vivamente di documentare gli schizzi dei pezzi e annotare i punti di riferimento. Inoltre, i pezzi dovrebbero idealmente essere disposti nell'ordine corretto sulla diapositiva.
9. Ripetere i passaggi da 4,3 a 4,8 fino a quando l'intera coclea non viene trasferita sul vetrino del microscopio. Se necessario, aggiungere altro mezzo di montaggio, coprire la slitta e sigillare il coperchio in posizione con smalto nero dipinto attorno ai bordi. Lasciare asciugare al buio a temperatura ambiente e poi conservare il vetrino al buio a 4 °C.
   NOTA: Anche se parti dell'epitelio sensoriale stesso vengono accidentalmente perse, è importante montare comunque ciò che rimane del pezzo cocleare per una corretta stima della lunghezza.

5. Misurazione della lunghezza cocleare

1. Misurare la lunghezza della coclea dalle immagini in campo luminoso dei suoi pezzi utilizzando un sistema di microscopio a epi-fluorescenza e il software associato. Salva immagini a basso ingrandimento (obiettivo 4x) da ogni pezzo cocleare e utilizza lo strumento di misurazione lazo del software del microscopio per tracciare una linea lungo la fila di IHC in ciascuna delle immagini. Calcola la lunghezza totale aggiungendo le lunghezze di tutti i pezzi.
   NOTA: quando mancano parti dell'epitelio sensoriale all'interno di un pezzo cocleare, interpolare la linea.
2. Per definire le posizioni cocleari che dovrebbero essere analizzate in una singola coclea, calcolare le distanze corrispondenti dall'apice usando l'equazione data da Müller²⁵. Segna queste posizioni, ad esempio, su una stampa dei pezzi cocleari.

6. Acquisizione di immagini con un microscopio confocale

1. Utilizzare un microscopio confocale con un obiettivo 40x ad immersione in olio (apertura numerica 1.3) e l'olio appropriato per l'imaging ad alta risoluzione.
   NOTA: Se il microscopio confocale ha un percorso luminoso invertito, il vetrino deve essere posizionato a testa in giù. In questo caso, dare al campione circa 30 minuti per affondare e riposare stabilmente sul coperchio prima di iniziare la scansione finale. In alternativa, utilizzare un mezzo di montaggio che sia fluido per tutta la durata della dissezione ma si solidifichi in seguito e contemporaneamente conservi la fluorescenza.
2. Attivare i laser appropriati: in questo protocollo vengono utilizzati due laser a semiconduttore pompati otticamente con lunghezze d'onda di λ = 488 nm e λ = 522 nm e un laser a diodi con una lunghezza d'onda di λ = 638 nm. Scegli l'intervallo di emissione dei tag di fluorescenza (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Poiché un rivelatore ibrido conta i fotoni rilasciati, posizionare la linea laser ad almeno 10 nm di distanza dalla curva di emissione.
   NOTA: è importante effettuare controlli preliminari con tessuto monomarcato per garantire che le larghezze di banda del rilevatore scelte separino in modo pulito i canali di colore (cioè, non portino alla diafonia del canale). Le onde radio interferiscono con il rivelatore ibrido, con conseguente numero massimo di fotoni, e quindi causano strisce artefatte nella pila. Pertanto, evitare di utilizzare un telefono cellulare vicino al microscopio.
3. Ingrandisci il tessuto fino a quando l'immagine si estende su 10 IHC. Scegli la risoluzione dell'immagine in base al campionamento Nyquist, che in genere è ~ 40-60 nm / pixel. Impostare la dimensione del passo nella direzione z su 0,3 μm e la velocità di imaging su 400-700 Hz.
   NOTA: entrambe queste impostazioni (dimensioni del passo e velocità di imaging) sono compromessi tra l'utilizzo di parametri di imaging ottimali e il risparmio di tempo di scansione.
4. Eseguire campionamenti bidirezionali per ridurre i tempi di imaging. Accumulare il telaio per il canale 3x da 488 nm e 638 nm e per il canale 6x da 522 nm; inoltre, media le linee 3x per ogni canale. Scegliete l'inizio e la fine della pila nella dimensione z.
5. Impostare il guadagno su 100 quando si utilizza il rilevatore ibrido (modalità di conteggio) per evitare una diminuzione del rapporto segnale-rumore. Imposta la potenza del laser in modo che nessun pixel sia saturo nella regione di interesse, ma le strutture coprono principalmente l'intera gamma di 8 bit. Inizia con una bassa potenza laser dello 0,5% e aumentala fino a quando le strutture sono visibili.
   NOTA: una buona colorazione richiede in genere una potenza laser compresa tra lo 0,1% e il 5%.
6. Utilizzare un software di deconvoluzione per l'elaborazione post hoc delle pile di immagini per rimuovere l'alone di sfocatura attorno a piccole strutture fluorescenti utilizzando una funzione teorica di diffusione puntuale. Utilizzare le stesse impostazioni per ogni stack all'interno di un esperimento. Salvare le immagini deconvolte come .tif o .ics.
   NOTA: L'etichetta myoVIIa (IHC) non beneficia della deconvoluzione e può essere omessa per risparmiare tempo. Il software utilizza i metadati dei file di immagine; tuttavia, è necessario specificare diversi parametri come il percorso della luce, il mezzo di incorporamento o il mezzo di immersione.

7. Quantificazione delle sinapsi

1. Apri una copia degli stack deconvolti nel software liberamente accessibile ImageJ con il plugin aggiuntivo Biovoxxel, disponibile anche sul loro sito web.
2. Regola i colori dei singoli canali dividendo i canali (Immagine | | colore Split Channels) e unione (Image | | colore Unisci canali) di nuovo, assegnando colori diversi. Convertire l'immagine in uno stack RGB (Image | | colore Impila su RGB) e regola la luminosità e il contrasto (Image | Regolare | | luminosità/contrasto Auto o slider per quanto riguarda il massimo), se necessario, in modo che le strutture pre e postsinaptiche e l'etichetta IHC siano piacevolmente distinte dallo sfondo.
3. Scegli cinque IHC ed etichettali con lo strumento di testo (IHC1-IHC5) facendo clic sulla posizione desiderata all'interno dello stack. Apri il ROI manager (Analizza | Strumenti | ROI Manager); attivare la casella di controllo Etichette per etichettare i punti con un numero. Ingrandisci l'IHC di interesse.
4. Utilizzare lo strumento punto/multipunto in modalità multipunto (fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento per scegliere tra la modalità punto o multipunto). Fare clic su una sinapsi del nastro funzionale (ad esempio, un nastro presinaptico in stretta giustapposizione a un cerotto glutammato postsinaptico) mentre si scorre attraverso la dimensione z.
   NOTA: a seconda della quantità di sovrapposizione e del colore scelto per ciascun canale, i pixel condivisi vengono visualizzati in colore misto. Di solito, la distinzione tra le singole sinapsi funzionali è semplice perché sono sufficientemente distanti l'una dall'altra.
5. Quando tutte le strutture di interesse sono spuntate, fai clic su Aggiungi nell'interfaccia utente grafica del ROI manager. Fare clic sul nome arbitrario e scegliere Rinomina.
   NOTA: le etichette dei punti rimangono ancora su tutti i piani dello stack quando la casella di controllo Mostra tutto è selezionata nel menu delle opzioni dello strumento punto (fare doppio clic sull'icona dello strumento punto ), che consente di evitare di contare più volte la stessa sinapsi della barra multifunzione.
6. Quando si sceglie l'IHC successivo da contare, evitare di aggiungere inavvertitamente conteggi regolando l'immagine per visualizzare completamente l'IHC successivo con lo strumento manuale. Passare dallo strumento multipunto allo strumento punto per evitare di aggiungere più puncta ai dati memorizzati in precedenza. Fare clic su una struttura di interesse all'interno del prossimo IHC e tornare allo strumento multipunto. Ripetere i passaggi da 7,4 a 7,5 fino a quando non vengono valutati tutti gli IHC di interesse.
7. Per salvare i dati, fare clic su un set di dati nel roi manager e quindi su misura. Attendi che venga visualizzata una nuova finestra che elenca i punti dati misurati. Salva questo elenco come file di foglio di calcolo (File | Salva con nome). Salva l'immagine attivando Mostra tutto nel roi manager. Fare clic su Appiattisci per aggiungere in modo permanente le etichette puntiformi allo stack. Quando chiudi la pila di immagini, accetta di salvare le modifiche.

8. Analisi del volume e della posizione delle sinapsi sulla cellula ciliata

NOTA: gli autori hanno utilizzato una procedura programmata su misura basata su Matlab. Poiché non è disponibile al pubblico, è qui delineato solo in termini generali (cfr. anche⁷). Si prega di contattare l'autore corrispondente se interessati a usarlo. La procedura prevede uno stack di immagini a tripla etichetta (IHC, pre e postsinaptico) in formato TIFF come input, guida l'utente attraverso le varie fasi di analisi tramite un'interfaccia grafica e fornisce un ampio output dei risultati in formato foglio di calcolo.

1. Normalizzare la posizione delle strutture sinaptiche in un sistema di coordinate 3D definito dall'estensione del singolo IHC sull'asse pilastro-modiolare e sull'asse cocleare apicale-basale e sull'asse superiore (piastra cuticolare) dell'IHC verso il basso (polo sinaptico).
   NOTA: I volumi degli elementi sinaptici (sia pre- che postsinaptici, e il volume combinato di sinapsi funzionali) sono forniti in μm³ e normalizzati al rispettivo valore mediano³.

Risultati

Le coclee sono state raccolte dopo perfusione cardiovascolare con fissativo dell'intero animale o rapidamente sezionate dopo l'eutanasia dell'animale e fissate per immersione. Con quest'ultimo metodo, gli IHC sono rimasti in posizione durante la dissezione, mentre, in caso di perfusione infruttuosa e quindi tessuto non sufficientemente fissato, l'epitelio sensoriale è stato spesso distrutto. Si noti che gli autori hanno riscontrato casi in cui la fissazione delle coclee dopo la perfusione transcardica era insufficiente ...

Discussione

Con il metodo delineato in questo protocollo, è possibile immunostare IHC e strutture sinaptiche nelle coclee da gerbilli giovani adulti e anziani, identificare presunte sinapsi funzionali mediante co-localizzazione di elementi pre- e postsinaptici, assegnarle a singoli IHC e quantificare il loro numero, volume e posizione. Gli anticorpi utilizzati in questo approccio hanno anche etichettato le cellule ciliate esterne (OHC; mioVIIa) e i loro nastri presinaptici. Inoltre, una valida alternativa per l'immunolabeling sia ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V biotin-free	Carl Roth	0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)	BD Biosciences, Eysins	612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)	Millipore	MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488	Molecular Probes Inc.	A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)	Proteus Biosciences	25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat Jaws	Fine Science Tools	10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm	Carl Roth	LH26.1
Disposable Surgical Blade	Henry Schein	0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647	Life Technologies-Molecular Probes	A-31573
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol, absolute 99.8%	Fisher Scientific	12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid	Carl Roth	8040.2
Excel	Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade	PLANO	112-9
G19 Cannula	Henry Schein	9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568	Invitrogen	A-21134
Heparin	Ratiopharm	N68542.04
Huygens Essentials	Scientific Volume Imaging
ImageJ	Fiji
Immersol, Immersion oil 518F	Carl Zeiss	10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)	Braun	4062957E
ISM596D	Ismatec		peristaltic pump
KL 1600 LED	Schott	150.600	light source for stereomicroscope
Leica Application suite X	Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system	Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab	The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut	Fine Science Tools	14512-17
Mini-100 Orbital-Genie	Scientific Industries	SI-M100	for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital)	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei	Nikon
NIS Elements	Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
Petri dish without vents	Avantor VWR	390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate	AppliChem	A1046
Monopotassium phosphate	Carl Roth	3904.1
Potassium chloride	Carl Roth	6781.1
Sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-M
Screw Cap Containers	Sarstedt	75.562.300
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
Student Adson Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton  X	Carl Roth	3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher	Biotium	23007
Vannas Spring Scissors, 3mm	Fine Science Tools	15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Vibrax VXR basic	IKA	0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic	IKA	953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)	Wild Heerbrugg		not available anymore