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要約

求心性シナプス構造および有毛細胞を免疫標識し、加齢組織における自己蛍光を消光し、蝸牛の長さを解剖および推定し、共焦点イメージングで得られた画像スタック中のシナプスを定量することによって、若年成人および加齢スナネズミ蝸牛を処理するためのプロトコールが提示される。

要約

内有毛細胞と求心性聴覚神経線維をつなぐリボンシナプスの喪失は、加齢性難聴の原因の一つと考えられています。リボンシナプスの喪失を検出する最も一般的な方法は、個々の蝸牛のいくつかの鼻トピック位置からの定量的サンプリングを可能にするため、免疫標識である。しかし、関心のある構造は骨の蝸牛の奥深くに埋もれています。スナネズミは加齢性難聴の動物モデルとして使用されています。ここでは、固定、スナネズミ蝸牛全体マウントの免疫標識、共焦点画像化、およびリボンシナプス数および体積の定量化のための日常的なプロトコールが記載されている。さらに、貴重な高齢の個人から良好な材料を得ることに関連する特定の課題が強調される。

スナネズミは安楽死させられ、心臓血管に灌流されるか、鼓膜水疱が頭蓋骨から慎重に解剖されます。蝸牛は頂点と基部で開き、固定液に直接移されます。最初の方法に関係なく、蝸牛は後固定され、続いて脱灰される。次いで、組織は、シナプス前およびシナプス後構造および有毛細胞に対する一次抗体で標識される。次に、蝸牛を、それぞれの一次抗体に対して特異的な二次蛍光タグ付き抗体と共にインキュベートする。その後、老化したスナネズミの蝸牛を自己蛍光消光剤で処理して、高齢動物の組織の典型的に実質的なバックグラウンド蛍光を減少させる。

最後に、蝸牛を6〜11個のセグメントに解剖する。蝸牛全体の長さは、特定の蝸牛の位置が個人間で確実に決定されるように再構築される。連続して取得される共焦点画像スタックは、選択された位置の有毛細胞およびシナプスを視覚化するのに役立つ。共焦点スタックは畳み取り解除され、シナプスはImageJを使用して手動でカウントされるか、またはシナプス構造のより広範な定量化がMatlabでカスタム記述された画像解析手順で実行されます。

概要

加齢性難聴は、65歳以上の世界人口の3分の1以上が罹患する世界で最も普及している疾患の1つです1。根本的な原因はまだ議論中であり、積極的に調査中ですが、内部有毛細胞(IHC)と求心性聴覚神経線維2をつなぐ特殊なシナプスの喪失が含まれる可能性があります。これらのリボンシナプスは、神経伝達物質グルタミン酸で満たされた小胞がそれにつながれたシナプス前構造、ならびにシナプス後α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸(AMPA)グルタミン酸受容体3,4,5を含む。スナネズミでは、〜20個の求心性聴覚神経線維が1つのIHC6、7、8に接触する。モディオラスに面したIHC上の線維は大きなシナプスリボンに対向し、IHCの柱側で接続する線維は小さなシナプスリボンに対向している(すなわち、ネコ9、スナネズミ7、モルモット10、およびマウス3、11、12、13、14)。さらに、スナネズミでは、シナプス前リボンおよびシナプス後グルタミン酸パッチのサイズは正の相関がある7,14。IHCのモディオラー側の大きなリボンに対向する繊維は口径が小さく、自発速度が低く、閾値が高い15。低自発速度繊維は、IHCs15の柱側に位置する高自発的低閾値繊維よりも、騒音曝露10および耳毒性薬物16に対してより脆弱であるという証拠がある。

リボンシナプスの喪失は、蝸牛神経加齢性難聴における最も初期の変性事象であるが、螺旋状神経節細胞およびその求心性聴覚神経線維の喪失は17,18に遅れをとっている。電気生理学的相関は、聴覚脳幹応答17および化合物活動電位8の記録を含み;しかし、これらはシナプス損失の微妙さを反映していない、なぜなら低い自発速度繊維はこれらの尺度に寄与しないからである16。より有望な電気生理学的測定基準は、質量電位誘導神経指数19および刺激周囲時間応答20である。しかしながら、これらは、動物が聴覚神経線維喪失を超えて、残りの聴覚神経線維8の活動に影響を及ぼす他の蝸牛病理を有していない場合にのみ信頼できる。さらに、スナネズミにおける行動学的に評価された閾値は、シナプス数21と相関していなかった。したがって、生存しているリボンシナプスの信頼できる定量化、したがって、機能的な聴覚神経線維の数は、蝸牛組織の直接検査によってのみ可能である。

モンゴルのスナネズミ(Meriones unguiculatus)は、加齢性難聴を研究するのに適した動物モデルです。それは短い寿命を有し、ヒトに似た低周波聴力を有し、維持が容易であり、加齢性難聴に関連するヒト病理との類似性を示す2,22,23,24。スナネズミは、生後36ヶ月に達すると老化したとみなされ、平均寿命の終わり近くになります22。重要なことに、リボンシナプスの加齢に伴う喪失は、静かな環境で飼育され老化したスナネズミで実証されている8,21。

ここでは、若年成人から加齢までの異なる年齢のスナネズミからの蝸牛を免疫標識、解剖、および分析するためのプロトコールが提示される。シナプス前部(CtBP2)、シナプス後グルタミン酸受容体パッチ(GluA2)、およびIHC(myoVIIa)の成分に対する抗体が使用される。老化した蝸牛のバックグラウンドを減少させ、蛍光シグナルをそのまま残す自己蛍光消光剤が適用されます。また、感覚上皮と線条体血管の両方を調べるために蝸牛を解剖する方法について説明する。蝸牛の長さは、特定の最良の周波数25に対応する別個の蝸牛位置の選択を可能にするために測定される。シナプス数の定量化は、自由に入手可能なソフトウェアImageJ26を用いて行われる。個々のHC内のシナプスボリュームと位置の追加定量化は、Matlabで書かれたソフトウェアカスタムで実行されます。このソフトウェアは、著者が専門的なドキュメントとサポートを提供するためのリソースが不足しているため、一般に公開されていません。

プロトコル

すべてのプロトコルと手順は、ドイツのニーダーザクセン州の関連当局によって承認され、許可番号AZ 33.19-42502-04-15/1828および33.19-42502-04-15/1990で承認されました。このプロトコルは、両性のモンゴルスナネズミ(M. unguiculatus)のためのものです。ヤングアダルトは3〜12ヶ月齢を指し、スナネズミは36ヶ月以上で老化していると考えられています。特に明記されていない場合、緩衝液および溶液を調製し、冷蔵庫に最大数ヶ月間(4〜8°C)保存することができる。使用前に、バッファーと溶液が沈殿していないことを確認してください。

1. 固定と臓器収集

注:蝸牛のみが必要な場合は、浸漬による固定のやや簡単な手順を実行することをお勧めします。しかし、よく保存された脳も必要な場合は、経心膜灌流が唯一の選択肢です。いずれの場合も固定液は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)である。これは作りたてにする必要がありますが、使用時まで冷凍保存することができます。経心膜灌流には〜300mLのアリコートを使用し、浸漬による固定には蝸牛あたり約50〜100mLのアリコートを使用する。

警告: PFA は有害物質です。一般的なラボの安全手順に従って処理します。

  1. 経心経灌流による固定
    1. チューブに気泡がなくなるまで灌流セットアップを洗い流します。血液凝固を防ぐために、ヘパリンを含むPBS(100mLのPBS中の0.2mL)で灌流チューブを満たします。チューブがPBSで満たされ、流体貯蔵ボトルが空になったら、流れを停止します。解凍したPFA200mLをその中に注ぐ。
      注:これで、動物のセットアップの準備が整いました。チューブ内の残りのPBSは血液を洗い流すのに十分であり、流れが再開されると自動的に固定液が続きます。
    2. PFAの流出のための廃棄物収集システムが整っていることを確認してください。新鮮なカニューレ(19G)を使用し、大きなはさみ、鉗子(先端が平らになっている)、止血剤、メスまたは鋭いカニューレ、ピン付きのゴムマットを手元に置いてください。
    3. ペントバルビタールの腹腔内過剰摂取(160mg / mL、動物1匹あたり0.3mL、体重範囲:50〜120g)でスナネズミを安楽死させる。動物をケージに戻します。呼吸停止が30秒以上の間隔で不規則になるように設定したら、スナネズミを背中に乗せてゴムマットの上に置き、前足と片方の後足の両方をピンで固定します(灌流の成功をよりよく判断するために、片方の後足が自由に動けるようにしてください;ステップ1.1.7の後の注を参照)。
    4. 胸腔を開くには、鉗子で胸骨の上の皮膚を持ち上げ、白い色の プロセススxiphoideus が見えるまで、胸骨の約0.5cm下の皮膚をはさみで切断する。胸骨を鉗子で胸骨を保持し、横隔膜に沿って切断して 胸 腔を良好に見渡せるようにします。心臓への良好なアクセスがあるまで、両側で肋骨を横方向に切断する。はさみの角度がスナネズミの体に対して平行で平らであることを確認し、臓器への損傷を避け、したがって、閉じた循環器系を確保する。
    5. 胸骨に止血を締め付け、胸郭を持ち上げ、血流を妨げないように、血流を妨げないように、胸郭を身体の部分に当てずにスナネズミの肩の上に止血剤を置きます。
    6. 約2秒ごとに1滴のPBSがカニューレ(19G)から流出するまで、流体の流れをわずかに開きます。鉗子で心臓を持ち、左心室がはっきりと見えるように少し左に回します。カニューレを中隔の貫通を避ける角度で左心室に挿入する。針を手で、または別の止血剤で所定の位置に保持します。
      注:左心室と右心室は、異なる色相によって区別することができます。左心室は、心臓組織の他の部分よりも色が明るく見える。
    7. 流体の流れの圧力をゆっくりと上げ、細かいはさみ、メス、または別のカニューレのいずれかで右心房を開きます。ドリップチャンバーで約2〜3滴/秒が観察されるまで流体の流れをさらに開くか、ポンプに4mL/分の流れを設定します。心臓の固定が始まったら、灌流カニューレがそれ以上保持されずに所定の位置にとどまることを確認してください。
      注:灌流が成功した兆候は、遅い筋肉の収縮、首と四肢の硬直、肝臓の青白さ、バラ色の肺です。灌流が成功しない兆候は肺の白化であり、これは中隔の穿刺のために肺循環が灌流されていることを示す。
    8. 灌流が失敗した場合は、カニューレをさらに上に、大動脈に移動し、止血剤で所定の位置にクランプしてください。
    9. スナネズミを斬首する。水疱を取り除き、ステップ1.2.2で説明されているように骨を切り取って壊します。
      注:組織が十分に固定されていない場合、感覚上皮は解剖中にコルティの器官から脱落する。
    10. 灌流が5〜10分以内に固定の兆候を示さない場合は、それを中止し、直ちに浸漬による固定のために以下の手順に従ってください。そのために、蝸牛をステップ1.2.2のように処理し、8°Cの2Dシェーカー上で1〜2日間、スクリューキャップ容器内の約50〜80mLの4%PFAで組織を後固定する。
      注:灌流中の固定の質を最終的に評価することは困難である可能性があるため、説明されているように蝸牛を定期的に後置することをお勧めします。
  2. 組織浸漬による固定
    1. ペントバルビタールの腹腔内過剰摂取(160mg / mL、動物1匹あたり0.3mL、体重範囲:50〜120g)でスナネズミを安楽死させる。スナネズミが呼吸を止めたら、動物を斬首します。
    2. 水疱を取り除き、それぞれはさみと鉗子で骨を切って壊して蝸牛に届きます。マエリュス、インカス、半円形の運河を取り除きます。鉗子で蝸牛骨を慎重に引っ掻いて、頂点と基底に小さな穴を開けます。直ちに水疱を過剰の低温固定液(少なくとも50mL)に移し、穏やかな攪拌(2Dシェーカー[100rpm])下で2日間、寒さ(4〜8°C)で組織を固定する。
      注:組織を固定した後、蝸牛はすぐに処理するか、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBSに保存することができます。警告: アジ化ナトリウムは有毒です。保存の長さは染色の品質に悪影響を及ぼす可能性があることに注意してください。限られた試験では、組織をアジ化ナトリウムで保存してから2年後に免疫染色が弱くなったことが示唆されている。

2. 組織調製と免疫標識

  1. エチレンジアミン四酢酸(EDTA)粉末をPBSに溶解し、pH8で0.5 M溶液を生成する。このために、ビーカーをマグネチックスターラーの上に置き、PBSの全量の約半分で満たし、適量のEDTA粉末を加えると、酸性懸濁液が得られる。pHメーターでpHを監視しながら、濃水酸化ナトリウム溶液(NaOH)を慎重に加えます。PBSで所望の最終容量まで満たし、微生物汚染を防ぐために溶液を濾過する。
    注:EDTA粉末は、懸濁液が中性pH値に達した後にのみ完全に溶解します。
  2. 脱灰のために、蝸牛をPBS中の80mLの0.5M EDTAに移す。組織を低温(4〜8°C)で2Dシェーカー(100rpm)上で穏やかな攪拌下で2日間インキュベートする。
    注:脱灰工程の後、組織はPBSに数日間保存して3週間まで保存してから、残りの処理工程を続けることができます。線条体血管を標識する抗体の場合、この時点で(すなわち、免疫染色の前に)蝸牛をモディオラー軸に沿って半分に切断して、それぞれの標的への抗体の均一なアクセスを保証することをお勧めします。これは抗体依存性であり、シナプス構造およびIHCを標識するためにここで使用される抗体には適用されない。切断には、壊れやすいカミソリ刃とブレードホルダー(ステップ4.2で説明)を使用してください。
  3. 以下のステップ (ステップ 3.2 まで) を 2 mL のセーフシール反応管で実行します。ティッシュピースが大きすぎてチューブ内に収まらない場合は、余分なティッシュをハサミでトリミングします。抗体の浸透を改善するために、まず、室温で1時間、2Dシェーカー(100rpm)上のPBS中の1%トリトン(Triton X-100)の1mL中の組織を透過処理する。2Dシェーカー(100rpm)上のPBS中の0.2%トリトン(Triton X-100)1mLで組織3xを室温でそれぞれ5分間洗浄する。
  4. 非特異的抗原をブロックするには、蝸牛を1 mLのブロッキング溶液(3%ウシ血清アルブミン[BSA]、0.2%トリトン、PBS中)中の2Dシェーカー(100rpm)上で室温で1時間インキュベートする。
    注:ブロッキング溶液は事前に調製することができますが、〜10日以上経過してはなりません。
  5. 以下の一次抗体をブロッキング溶液の同じアリコート中で新たに希釈する:抗myoVIIa(ミオシンVIIa)を標識してIHC(IgGポリクローナルウサギ)を標識し、1:400に希釈する;シナプス前リボンを標識する抗CtBP2(C末端結合タンパク質2)(IgG1モノクローナルマウス)、1:400に希釈;シナプス後受容体パッチを標識する抗GluA2(IgG2aモノクローナルマウス)を、1:200に希釈した。蝸牛が抗体溶液(通常0.4mL)で完全に覆われていることを確認し、37°Cで24時間インキュベートします。
  6. 次に、組織5xをPBS中の0.2%トリトンで室温で2Dシェーカー(100rpm)でそれぞれ5分間洗浄する。一次抗体の宿主種と一致するように二次抗体を選択し、PBS中の3%BSA、0.2%トリトンでそれらを再び新たに希釈する:ヤギ抗マウス(IgG1)-Alexaフルオロフォア(AF)488、希釈1:1,000;ヤギ抗マウス(IgG2a)-AF568、希釈1:500;ロバ抗ウサギAF647(IgG)を、1:1,000に希釈した。チューブをアルミ箔で包み、蛍光の漂白を防ぎます。蝸牛を0.4 mLの二次抗体溶液中で37°Cで24時間インキュベートする。
    注:限定的な試験では、蝸牛組織を37°Cで24時間、一次抗体および二次抗体と共にインキュベートすると、より低温でより短い持続時間でより一般的なインキュベーション手順に従うよりも明るい免疫染色がもたらされたことが示されている。
  7. 蝸牛2xをPBS中の0.2%トリトン1mLでそれぞれ5分間、PBSで3xを2Dシェーカー(100rpm)上でそれぞれ5分間洗浄する。
    注:これらの洗浄ステップの後、蝸牛は〜4°Cの冷蔵庫内のPBSに数日間留まることができます。

3. 自己蛍光消光剤による治療(オプション)

注:中年および高齢のスナネズミ由来の蝸牛は、広範なバックグラウンド自己蛍光を示す。若年成人組織では、自己蛍光消光剤による治療は必要ない。原理的には、免疫染色手順の前に自家蛍光消光剤を適用することが可能であり、これにより、所望の抗体蛍光の不注意な低下が回避される。しかし、メーカーのデータシートによると、洗剤(現在のプロトコルのTriton X-100など)の使用は、組織からクエンチャーを除去するため、もはや不可能です。

  1. ステップ4.2で説明したように、実体顕微鏡下で蝸牛を半分に切断する。
  2. 自家蛍光消光剤を70%エタノールと混合して5%溶液を得、この溶液中の蝸牛を2Dシェーカー上で室温で1分間インキュベートする。蝸牛3xを2Dシェーカー上の1mLのPBSで室温でそれぞれ5分間洗浄する。
    警告: 自己蛍光消光器は危険で有害です。この物質を取り扱うときは手袋を着用してください。

4. 最終的な精密解剖

  1. 実体顕微鏡下で蝸牛を解剖する。ポリスチロールペトリ皿とその蓋にPBSを入れ、2つの細かい鉗子、バンナススプリングハサミ、ブレードホルダー、壊れやすいカミソリブレードを手元に置いてください。カミソリ刃から破片を破って、解剖工程に応じて〜2〜4mmの切断面を得る。3滴のマウント媒体を一列に並べて顕微鏡スライドを作製する。
    注:カミソリの刃の切断面はすぐに磨耗します。ブレードは、蝸牛の約2個ごとに解剖して取り付けた後に交換する必要があります。
  2. ステップ3.1でまだ行われていない場合は、まず実体顕微鏡下で蝸牛をモディオラスに沿って半分に切断する。このためには、蝸牛のコイル状の長さよりも長い剃刀の刃片をブレードホルダーに入れます。蝸牛をペトリ皿に入れ、カミソリの刃で余分な組織を切り取ります。蝸牛を細かい鉗子で所定の位置に保持し、モディオラスに沿って半分に切ります。
  3. 半分から始めて、残りの半分もペトリ皿に残します。蝸牛の半分を鉗子で慎重に固定し、刃先が上を向くようにします。細かい春のはさみを使って、腱鞘の上の蝸牛の骨を切り取り、頂点を覆います。
  4. 蝸牛片の分離を開始するには、上(スカラ前庭)と下(スカラティンパニ)のモディオラスと聴覚神経をはさみで切断して、中間のターンを分離します。
  5. 蝸牛管内の線条体血管を覆う蝸牛骨を切断する。蝸牛骨の両側をコルティの器官の上と線条体血管に沿って2回切り込み、カミソリ刃を使用して最終的に蝸牛片を分離します。
    注:線条体血管炎は暗い縞模様として容易に見えます。線条体血管に沿って切断すると、コルティの器官はそのまま残る。
  6. オプション:線条体血管を採取するには、コルティの器官と線条体血管の間を慎重に切断して2つを分離します。線条体血管を螺旋靭帯(蝸牛の外表面を覆う骨に付着)に接続したままにし、鉗子を使用して脱灰した骨を除去する。線条体側を上にして顕微鏡スライドの上に置いたピースを、マウント媒体の滴の中に置きます。
    メモ: 集めたピースの湾曲が強すぎる場合は、スライドに取り付けるのに十分なほど平らにするために、ピースを小さなピースに分割する必要がある場合があります。
  7. 蝸牛片をポリスチロールペトリ皿のPBS充填蓋に移し、蝸牛全体のマウントがスライド上にできるだけ平らになるようにします。腹部側の螺旋状の靭帯の一部や神経側の螺旋状の辺縁部の一部などの余分な組織を除去します。超微細鉗子でテクトリアル膜を慎重に取り除きます。
  8. 蝸牛片をスライドの上に置き、マウント媒体の滴に入れます。コルティの器官をスライドの上に向けて蝸牛全体のマウントを配置し、イメージングのために光路内のIHCを覆い隠さないようにします。IHCのすぐ近くに渦巻き状の縁肢の侵入を探し、蝸牛片を矢状面にシフトして上を向く側を特定することによって見える。
    注:さらなる処理中に個々の部分から完全な蝸牛をデジタルで再構築するには、作品のスケッチを文書化し、ランドマークに注意することを強くお勧めします。さらに、理想的には、ピースはスライド上で正しい順序で配置する必要があります。
  9. 蝸牛全体が顕微鏡スライドに移されるまで、手順4.3~4.8を繰り返します。必要に応じて、さらに取り付け用具を追加し、スライドをカバースリップし、エッジの周りに黒いマニキュアを塗ってカバースリップを所定の位置に密封します。室温で暗所で乾燥させ、スライドを4°Cの暗所に保管します。
    注:感覚上皮自体の一部が誤って失われた場合でも、正しい長さ推定のために蝸牛片の残りを取り付けることが重要です。

5. 蝸牛長測定

  1. 落射蛍光顕微鏡システムおよび関連するソフトウェアを使用して、その断片の明視野画像から蝸牛の長さを測定する。すべての蝸牛片から低倍率画像(4倍レンズ)を保存し、顕微鏡ソフトウェアの なげなわ測定ツールを使用して 、各画像のIHCの列に沿って線を引きます。すべてのピースの長さを加算して、全長を計算します。
    注: 感覚上皮の一部が蝸牛片内に欠けている場合は、線を補間します。
  2. 個々の蝸牛で解析する必要がある蝸牛の位置を定義するには、ミュラー25によって与えられた式を使用して、頂点からの対応する距離を計算します。たとえば、これらの場所に蝸牛の断片のプリントアウトに印を付けます。

6. 共焦点顕微鏡による画像取得

  1. 油浸型40倍の対物レンズ(開口数1.3)を備えた共焦点顕微鏡と、高解像度イメージングに適した油を使用してください。
    メモ: 共焦点顕微鏡の光路が反転している場合は、スライドを逆さまに配置する必要があります。この場合、試料を約30分間沈め、カバースリップ上で安定して置いてから、最終スキャンを開始してください。あるいは、解剖の期間を通して流動的であるが、後で固化し、同時に蛍光を保存するマウント媒体を使用する。
  2. 適切なレーザーをアクティブにします:このプロトコルでは、波長がλ = 488 nmおよびλ = 522 nmの2つの光学的に励起された半導体レーザーと、波長がλ = 638 nmのダイオードレーザーが使用されます。蛍光タグの発光範囲を選択します(AF488:499-542 nm、AF568:582-621 nm、AF647:666-776 nm)。ハイブリッド検出器が放出された光子をカウントするように、レーザーラインを発光曲線から少なくとも10nm離れたところに配置します。
    メモ:選択した検出器の帯域幅がカラーチャンネルをきれいに分離していることを確認するために、単一ラベルの組織で予備チェックを実行することが重要です(つまり、チャンネルクロストークにつながらない)。電波はハイブリッド検出器に干渉し、最大光子数をもたらし、スタック内に人工的な縞模様を引き起こします。そのため、顕微鏡の近くで携帯電話を使用しないでください。
  3. 画像が10個のIHCにまたがるまで組織を拡大します。ナイキストサンプリングに従って画像の解像度を選択します(通常は〜40〜60 nm /ピクセル)。z方向の刻み幅を0.3μm、イメージング速度を400~700Hzに設定します。
    メモ:これらの設定(ステップサイズとイメージング速度)はどちらも、最適なイメージングパラメータの使用とスキャン時間の節約との間の妥協点です。
  4. 双方向サンプリングを実行して、イメージング時間を短縮します。488 nmおよび638 nmチャネル3xおよび522 nmチャネル6xのフレームを蓄積する。さらに、各チャネルのライン 3x を平均します。スタックの始点と終点を Z 次元で選択します。
  5. ハイブリッド検出器(カウントモード)を使用する場合はゲインを100に設定して、信号対雑音比の低下を回避します。レーザー出力を設定して、関心領域でピクセルが飽和しないようにしますが、構造は主に8ビット範囲全体をカバーします。0.5%の低レーザー出力から始めて、構造が見えるまで増やします。
    注:良好な染色には、通常、0.1%〜5%のレーザーパワーが必要です。
  6. 画像スタックのポストホック処理にデコンボリューションソフトウェアを使用して、理論的な点像分布関数を使用して小さな蛍光構造の周りのぼやけたハローを除去します。実験内の各スタックに同じ設定を使用します。デコンボリューションされたイメージを.tifまたは.icsとして保存します。
    注:myoVIIaラベル(IHC)はデコンボリューションの恩恵を受けず、時間を節約するために省略することができます。ソフトウェアは、画像ファイルのメタデータを使用します。ただし、光路、埋め込み媒体、浸漬媒体などのいくつかのパラメータを指定する必要があります。

7. シナプス定量化

  1. 自由にアクセスできるソフトウェアImageJで、追加のBiovoxxelプラグインでデコンボリューションされたスタックのコピーを開き、ウェブサイトでも入手できます。
  2. チャンネルを分割して個々のチャンネルの色を調整する(画像|カラー|チャンネルの分割)とマージ(画像|カラー|チャンネルをマージ)をもう一度表示し、異なる色を割り当てます。画像をRGBスタックに変換する(画像|カラー|RGBにスタック)し、明るさとコントラストを調整します(画像||を調整する明るさ/コントラスト|必要に応じて、最大値に関する自動またはスライダーのいずれかを使用して、シナプス前後の構造とIHCラベルが背景と快適に区別されるようにします。
  3. 5 つの IHC を選択し、スタック内の目的の場所をクリックして 、テキスト ツール (IHC1-IHC5) でラベルを付けます。ROI マネージャーを開く (分析|ツールの|ROIマネージャー);チェックボックス 「ラベル」 を有効にして、ポイントに番号のラベルを付けます。目的の IHC を拡大します。
  4. マルチポイントモードでポイント/マルチポイントツールを使用します(ツールを右クリックしてポイントモードまたはマルチポイントモードを選択します)。機能的なリボンシナプス(すなわち、シナプス後グルタミン酸パッチに密接に並置されたシナプス前リボン)をクリックし、z次元をスクロールする。
    メモ: オーバーラップの量と各チャンネルで選択したカラーに応じて、共有ピクセルは混合カラーで表示されます。通常、個々の機能的シナプスの区別は、互いに十分に離れているため、単純である。
  5. 関心のあるすべての構造がチェックされたら、ROIマネージャのグラフィカルユーザーインターフェイスで [追加 ]をクリックします。任意の名前をクリックし、[ 名前の変更]を選択します。
    メモ: ポイントツールのオプションメニューで [ すべて表示] チェックボックスが選択されている場合 ( ポイントツール アイコンをダブルクリック)、 同じ リボンシナプスを複数回カウントするのを防ぐことができます。
  6. カウントする次の IHC を選択するときは、 ハンド ツールで次の IHC を完全に表示するように画像を調整して、誤ってカウントを追加しないようにします。 マルチ ポイントツールから ポイントツール に変更して、以前に保存したデータに句読点を追加しないようにします。次の IHC 内で目的の構造をクリックし、 マルチポイント ツールに戻ります。対象の IHC がすべて評価されるまで、手順 7.4 ~ 7.5 を繰り返します。
  7. データを保存するには、ROI マネージャーでデータセットをクリックし、 次にメジャーをクリックします。測定されたデータポイントを一覧表示する新しいウィンドウが表示されるのを待ちます。このリストをスプレッドシート ファイルとして保存する (ファイル |として保存)。ROI マネージャーで [すべて表示] を有効にして、イメージを保存します。[ 平坦化] をクリックして、ポイントラベルをスタックに永続的に追加します。イメージ スタックを閉じるときは、変更を保存する ことに同意し てください。

8. 有毛細胞上のシナプス体積と位置の解析

注:著者らは、Matlabに基づいてカスタムプログラムされた手順を使用しました。一般には公開されていないため、ここでは大まかな用語でのみ概説しています(7も参照してください)。使用にご興味のある方は、対応作者までお問い合わせください。この手順では、TIFF 形式のトリプル ラベル付き (IHC、シナプス前およびシナプス後) イメージ スタックを入力として想定し、グラフィカル インターフェイスを介して分析のさまざまな手順をユーザーに案内し、スプレッドシート形式で結果を広範囲に出力します。

  1. シナプス構造の位置を、柱-モディオラ軸および蝸牛頂頂基底軸およびIHCの上部(キューティキュラープレート)から下部(シナプス極)軸上の個々のIHCの範囲によって定義される3D座標系に正規化する。
    注:シナプス要素の体積(シナプス前部とシナプス後部の両方、および機能的シナプスの合計体積)はμm 3で提供され、それぞれの中央値3に正規化される。

結果

蝸牛は、動物全体の固定液による心血管灌流後に採取するか、または動物を安楽死させて浸漬固定した後に急速に解剖した。後者の方法では、IHCは解剖中に所定の位置にとどまり、一方、灌流が失敗し、したがって組織が十分に固定されていない場合、感覚上皮はしばしば破壊された。著者らは、経心経脈灌流後の蝸牛の固定が不十分である一方で、脳の固定がまだ十分であった症例に遭遇?...

ディスカッション

このプロトコールに概説されている方法を用いると、若年成人および高齢のスナネズミ由来の蝸牛におけるIHCおよびシナプス構造を免疫標識し、シナプス前およびシナプス後要素の共局在化によって推定された機能的シナプスを同定し、それらを個々のIHCに割り当て、それらの数、体積、および位置を定量することができる。このアプローチで用いた抗体はまた、外側有毛細胞(OHC;myoVIIa)およ...

開示事項

著者は宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

著者らは、Lichun Zhangがイメージング施設の使用のために、この方法とOldenburgのCarl von Ossietzky University of Oldenburgの蛍光顕微鏡サービスユニットの確立を支援したことを認めている。この研究は、ドイツの卓越性戦略-EXC 2177/1の下でドイツ研究財団(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin Fraction V biotin-freeCarl Roth0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)BD Biosciences, Eysins612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)MilliporeMAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488Molecular Probes Inc.A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)Proteus Biosciences25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat JawsFine Science Tools10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball TipFine Science Tools14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mmCarl RothLH26.1
Disposable Surgical BladeHenry Schein0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647Life Technologies-Molecular ProbesA-31573
Dumont #5 - Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF ForcepsFine Science Tools11252-00
Ethanol, absolute 99.8%Fisher Scientific12468750
Ethylenediaminetetraacetic acidCarl Roth8040.2
ExcelMicrosoft Corporation
Feather Double Edge BladePLANO112-9
G19 CannulaHenry Schein9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568InvitrogenA-21134
HeparinRatiopharmN68542.04
Huygens EssentialsScientific Volume Imaging
ImageJFiji
Immersol, Immersion oil 518FCarl Zeiss10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)Braun4062957E
ISM596DIsmatecperistaltic pump
KL 1600 LEDSchott150.600light source for stereomicroscope
Leica Application suite XLeica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 systemLeica Microsystem CMS GmbH
MatlabThe Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCutFine Science Tools14512-17
Mini-100 Orbital-GenieScientific IndustriesSI-M100for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital)Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-EiNikon
NIS ElementsNikon Europe B.V.
ParaformaldehydeCarl Roth0335.3
Petri dish without ventsAvantor VWR390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphateAppliChemA1046
Monopotassium phosphateCarl Roth3904.1
Potassium chlorideCarl Roth6781.1
Sodium chlorideSigma Aldrich31434-M
Screw Cap ContainersSarstedt75.562.300
Sodium azideCarl RothK305.1
Student Adson ForcepsFine Science Tools91106-12
Student Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools91308-12
Superfrost Adhesion Microscope SlidesEprediaJ1800AMNZ
Triton  XCarl Roth3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence QuencherBiotium23007
Vannas Spring Scissors, 3mmFine Science Tools15000-00
Vectashield Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
Vibrax VXR basicIKA0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basicIKA953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)Wild Heerbruggnot available anymore

参考文献

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