Explante retiniano de la retina de ratón adulto como modelo ex vivo para el estudio de enfermedades neurovasculares retinianas

Resumen

Este protocolo presenta y describe los pasos para el aislamiento, disección, cultivo y tinción de explantes de retina obtenidos de un ratón adulto. Este método es beneficioso como modelo ex vivo para estudiar diferentes enfermedades neurovasculares de la retina como la retinopatía diabética.

Resumen

Uno de los desafíos en la investigación de la retina es estudiar la diafonía entre diferentes células de la retina, como las neuronas de la retina, las células gliales y las células vasculares. Aislar, cultivar y mantener las neuronas de la retina in vitro tiene limitaciones técnicas y biológicas. El cultivo de explantes de retina puede superar estas limitaciones y ofrecer un modelo ex vivo único para estudiar la diafonía entre varias células de la retina con parámetros bioquímicos bien controlados e independientes del sistema vascular. Además, los explantes de retina son una herramienta de cribado eficaz para estudiar nuevas intervenciones farmacológicas en diversas enfermedades vasculares y neurodegenerativas de la retina, como la retinopatía diabética. Aquí, describimos un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo de explantes de retina durante un período prolongado. El manuscrito también presenta algunos de los problemas técnicos durante este procedimiento que pueden afectar los resultados deseados y la reproducibilidad del cultivo de explante de retina. La inmunotinción de los vasos retinianos, las células gliales y las neuronas demostró capilares retinianos intactos y células neurogliales después de 2 semanas desde el comienzo del cultivo de explante retiniano. Esto establece los explantes de retina como una herramienta confiable para estudiar los cambios en la vasculatura retiniana y las células neurogliales en condiciones que imitan enfermedades de la retina como la retinopatía diabética.

Introducción

Se han presentado diferentes modelos para estudiar enfermedades de la retina, incluyendo modelos tanto in vivo como in vitro. El uso de animales en la investigación sigue siendo un tema de continuo debate ético y traslacional¹. Los modelos animales que involucran roedores como ratones o ratas se utilizan comúnmente en la investigación de la retina ^2,3,4. Sin embargo, han surgido preocupaciones clínicas debido a las diferentes funciones fisiológicas de la retina en roedores en comparación con los humanos, como la ausencia de la mácula o las diferencias en la visión del color⁵. El uso de ojos postmortem humanos para la investigación de la retina también tiene muchos problemas, incluyendo pero no limitado a las diferencias en los antecedentes genéticos de las muestras originales, el historial médico de los donantes y los entornos o estilos de vida previos de los donantes⁶. Además, el uso de modelos in vitro en la investigación de la retina también tiene algunos inconvenientes. Los modelos de cultivo celular utilizados para estudiar enfermedades de la retina incluyen la utilización de líneas celulares de origen humano, células primarias o células madre⁷. Se ha demostrado que los modelos de cultivo celular utilizados tienen problemas en términos de contaminación, identificación errónea o desdiferenciación 8,9,10,11. Recientemente, la tecnología de organoides retinianos ha mostrado un progreso significativo. Sin embargo, la construcción de retinas altamente complejas in vitro tiene varias limitaciones. Por ejemplo, los organoides retinianos no tienen las mismas características fisiológicas y bioquímicas que las retinas maduras in vivo. Para superar esta limitación, la tecnología de organoides retinianos debe integrar más características biológicas y celulares, incluidas las células musculares lisas, la vasculatura y las células inmunes como la microglía^12,13,14,15.

Los explantes organotípicos de retina se han convertido en una herramienta confiable para el estudio de enfermedades retinianas como la retinopatía diabética y las enfermedades degenerativas de la retina^16,17,18,19. En comparación con otras técnicas existentes, el uso de explantes retinianos apoya tanto los cultivos celulares de retina in vitro como los modelos animales in vivo actuales al agregar una característica única para estudiar la diafonía entre varias células de la retina bajo los mismos parámetros bioquímicos e independientes de variables sistémicas. Los cultivos de explante permiten que diferentes células de la retina se mantengan juntas en el mismo ambiente, permitiendo la preservación de las interacciones intercelulares retinianas^20,21,22. Además, un estudio previo mostró que los explantes retinianos fueron capaces de preservar la estructura morfológica y la funcionalidad de las células retinianas cultivadas²³. Por lo tanto, los explantes de retina pueden proporcionar una plataforma decente para investigar posibles dianas terapéuticas para una amplia variedad de enfermedades de la retina^24,25,26. Los cultivos de explantes retinianos proporcionan una técnica controlable y son un sustituto muy flexible de los mothods existentes que permiten numerosas manipulaciones farmacológicas y pueden descubrir varios mecanismos moleculares²⁷.

El objetivo general de este trabajo es presentar la técnica de explante de retina como un sistema modelo intermedio razonable entre cultivos celulares in vitro y modelos animales in vivo . Esta técnica puede imitar las funciones de la retina de una mejor manera que las células disociadas. Como varias capas retinianas permanecen intactas, las interacciones intercelulares retinianas pueden ser evaluadas en el laboratorio bajo condiciones bioquímicas bien controladas e independientes del funcionamiento del sistema vascular²⁸.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Oakland, Rochester, MI, EE.UU. y siguieron las pautas establecidas por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de la Visión.

1. Preparación de animales

1. Mantenga a los animales alojados bajo una temperatura constante en un ambiente con luz controlada. Los ajustes de temperatura para la sala de alojamiento de animales deben seguir las pautas establecidas por la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio". El rango de temperatura para ratones está entre 18 °C y 26 °C. Mantenga los niveles de humedad controlados y establecidos en aproximadamente 42%.
2. Para este experimento, use ratones machos C57BL / 6J (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) que tengan más de 12 semanas de edad (se usó un ratón adulto para este protocolo).
   NOTA: Se utilizó una cepa de tipo salvaje en este protocolo para la demostración, ya que no tenía ninguna anomalía genética que afectara a la retina. Sin embargo, se podrían usar otras cepas, incluidas las cepas manipuladas genéticamente, para el cultivo de explante de retina.
3. Proporcione ciclos de luz/oscuridad de 12 h a través del control de iluminación en las habitaciones de alojamiento de animales.
4. Inspeccione la salud de cada animal y la ingesta adecuada de alimentos y agua dos veces al día durante la semana y una vez al día los fines de semana. Asegúrese de proporcionarles alimentos frescos y agua limpia.
5. Si los niveles de comida y agua son bajos durante la semana, enjuague la botella de agua y vuelva a llenarla. Agregue alimentos frescos cuando sea necesario. Cambie las jaulas sucias diariamente o según sea necesario para la salud de los animales.
   NOTA: Para estudiar los fotorreceptores y los cambios inducidos por la luz en la retina, adapte la oscuridad de los ratones durante la noche en una caja oscura especial ubicada en una habitación oscura en la instalación de animales.
6. Eutanasia de los animales en su jaula doméstica por sobredosis de inhalación de CO2 utilizando gas CO₂ comprimido en cilindros conectados a una cámara de_CO2. Llevar a cabo la confirmación de la muerte utilizando un método secundario de eutanasia, como la luxación cervical.
7. Después de completar el procedimiento, confirme la muerte del animal mediante un método apropiado, como confirmar un paro cardíaco y respiratorio u observar las pupilas fijas y dilatadas del animal.

2. Preparación del tejido

1. Una vez que el animal es sacrificado, limpie el área con etanol al 70%. Luego, abra los párpados con una mano para que el ojo sea visible. Aplique presión a las partes superior e inferior de la órbita con la mano opuesta usando pinzas curvas hasta que el globo sobresalga.
2. Para enuclear el ojo, cierre suavemente los fórceps en la porción posterior del ojo y eléjelos en un movimiento continuo. Con fórceps, sostenga el globo ocular del nervio óptico. Asegúrese de usar herramientas de disección esterilizadas para todos los pasos y de trabajar en condiciones asépticas completas.
3. Sumerja cada globo ocular en un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de HBSS helado con penicilina-estreptomicina (10,000 U/ml). Lave el globo ocular en HBSS dos veces durante 5 minutos cada una.
4. Transfiera el globo ocular a un tubo de 1.5-2 ml que contenga medios completos (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutamina y 1% penicilina y estreptomicina).

3. Disección tisular

1. Diseccionar la retina cuidadosamente bajo un microscopio quirúrgico, como se ilustra secuencialmente en la Figura 1.
   1. Haga una incisión circunferencial alrededor del limbo para abrir el globo ocular. Retire la córnea diseccionando circularmente a lo largo del borde de la córnea y la incisión (limbal), seguido de la extracción del segmento anterior, el cristalino y el cuerpo vítreo, dejando un ocular vacío.
   2. Al sostener la región de la cabeza del nervio óptico con pinzas finas, retire suavemente la capa externa del ojo. Preste mucha atención durante la extracción de la capa externa para no lesionar la retina neural y asegurarse de que la retina permanezca totalmente intacta.
      NOTA: La retina debe separarse cuidadosamente del epitelio pigmentario de la retina (EPR), y se debe realizar un solo corte en la cabeza del nervio óptico para separar la retina del nervio óptico. Asegúrese visualmente de esto identificando el agujero dejado por el nervio óptico (la cabeza del nervio óptico).
   3. Diseccionar la retina radialmente en cuatro piezas de igual tamaño.
2. Siga los pasos a continuación para manipular los pequeños trozos de la retina para garantizar la orientación adecuada del cultivo de retina.
   1. Usando una hoja de tijera de disección, abra justo debajo de la pieza retiniana (Tabla de materiales).
   2. Levante lentamente la pieza retiniana con la punta de una hoja de tijera abierta y transfiérala suavemente a la placa de cultivo.
3. Transfiera los explantes derivados de la retina aislada por separado a los insertos de cultivo celular en una placa de 12 pocillos, cada uno con 300 μL de medios de explante retinianos, con el lado de la célula ganglionar de la retina (neuroretina) hacia arriba.
   NOTA: Asegúrese de que el medio sea DMEM con suplementos N2 y B27. Agregue penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) a los medios también (Tabla de materiales). La retina está formada por múltiples capas de células neuronales interconectadas a través de sinapsis y apoyadas desde el exterior por la capa pigmentada del epitelio pigmentario de la retina, que es la capa negra que se eliminó durante la disección.
4. Retire cualquier remanente del epitelio pigmentado; Sin embargo, estos restos pueden ayudar a identificar la orientación adecuada del explante. Asegúrese de que la parte pigmentada esté hacia abajo y que la parte no pigmentada esté hacia arriba.
5. Incubar el cultivo de explante retiniano en incubadoras humidificadas a 37 °C y 5% de_CO2.
6. Asegúrese de que la superficie de la retina esté orientada hacia arriba. Si la pieza retiniana está volteada o doblada, intente ajustarla suavemente a la orientación correcta.
   NOTA: Preste mucha atención a la orientación correcta del explante retiniano en la placa de cultivo. Evite cualquier volteo o plegado del explante en la placa de cultivo, ya que esto resultará en el fracaso del crecimiento adecuado de las células de la retina en cultivo.

4. Cultivo de explante retiniano

1. Mantener los cultivos de explante retiniano (preparados en los pasos 3.2-3.3) en incubadoras humidificadas a 37 °C y 5% de_CO2.
2. Cambie la mitad de los medios de cada pozo cada dos días durante 2 semanas. Haga esto pipeteando 150 μL del pozo con cuidado. Luego, agregue 150 μL de medios frescos al pozo. Evite voltear el explante al cambiar el medio.
3. Revise el explante cuidadosamente bajo el microscopio antes de volver a colocar la placa de cultivo en la incubadora. Examinar la integridad de las células y la arquitectura de la retina bajo un microscopio de campo claro. Asegúrese de que el explante todavía está orientado correctamente. Utilice las lentes de objetivo 4x y 20x para examinar el explante.
   NOTA: Evitar la inmersión completa del explante en el medio.

5. Inmunohistoquímica

1. Después de 2 semanas, arregle el explante de retina retirando el medio. Haga esto lavando primero una vez con 200 μL de 1x PBS y luego agregando 300 μL de paraformaldehído al 4% en PBS 0.1 M, pH 7.4, al pocillo que contiene el explante y dejándolo toda la noche.
   NOTA: Este paso se puede realizar sin quitar los insertos de cultivo de la placa. Los explantes también se pueden transferir a un tubo cónico de 500 μL, y el lavado y la fijación se pueden hacer dentro del tubo.
2. Transfiera el explante a un tubo cónico de 500 μL que contenga 300 μL de 1x PBS-2,5% Tritón X para lavado.
3. Lave los explantes fijos en el tubo tres veces durante 5 minutos cada una usando velocidad media en un agitador (25 rpm).
4. Bloquear las reacciones inespecíficas esperadas incubando el explante con 300 μL de tampón de bloqueo 1x que contiene timerosal al 0,02% durante 1 h a temperatura ambiente antes de la incubación de anticuerpos.
5. Incubar los explantes fijos con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C utilizando velocidad media en un agitador.
   NOTA: Detectar las células endoteliales de la retina en el explante fijo mediante tinción con anticuerpos GSL I, BSL I (lectina) (7:1.000). Detectar las células gliales en los explantes de retina mediante tinción con anticuerpos contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de conejo (1:250). Detectar las neuronas retinianas teñiendo el explante con el anticuerpo NeuN de conejo (1:250)^29,30. Incubar s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explante con la lectina, combinación NeuN, e incubar otros con la lectina, combinación GFAP.
6. Al día siguiente, retire el anticuerpo primario de los tubos por aspiración con una pipeta. Lave los explantes con 1x PBS-2.5% Triton X tres veces durante 5 minutos cada una usando velocidad media en una coctelera.
7. Agregue los anticuerpos secundarios: IgG anti-conejo de cabra (1:500) (secundaria para GFAP y NeuN) y Texas Red (7:1,000) (para la lectina). Incubar durante 1 h a temperatura ambiente utilizando velocidad media en un agitador.
   NOTA: Los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz, así que cubra el tubo con papel de aluminio.
8. Retire los anticuerpos secundarios por aspiración, y luego lave tres veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS-2.5% Triton X.
9. Transfiera el explante del tubo a un portaobjetos de vidrio utilizando una pipeta de transferencia. Retire cualquier exceso de líquido en la diapositiva y luego agregue una gota de medios de montaje con DAPI a la diapositiva.
10. Cubra el pañuelo con un cubreobjetos. No permita que haya burbujas de aire entre el cubreobjetos y el pañuelo de papel.
11. Lleve los portaobjetos teñidos al microscopio de fluorescencia y comience a tomar las imágenes. Es importante cubrir los portaobjetos teñidos con una caja portaobjetos, ya que la tinción de fluorescencia es sensible a la luz.

Resultados

Supervivencia de las células retinianas neuronales y vasculares del explante retiniano en medios de cultivo ex vivo durante un tiempo prolongado
Al cultivar un explante de retina utilizando nuestro protocolo, tuvimos éxito en el mantenimiento de diferentes células de la retina que eran viables hasta por 2 semanas. Para verificar la presencia de diferentes células retinianas, se realizó una tinción de inmunofluorescencia del explante retiniano utilizando...

Discusión

Nuestro laboratorio ha estado estudiando los cambios fisiopatológicos que promueven la disfunción microvascular retiniana durante años 31,32,33,34,35,36. Los explantes de retina son una de las técnicas que pueden ser de gran valor para utilizar como modelo para estudiar enfermedades de la retina como la retinopatía diab?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407