망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

요약

이 프로토콜은 성인 마우스로부터 수득한 망막 외식편의 분리, 해부, 배양 및 염색을 위한 단계를 제시하고 설명한다. 이 방법은 당뇨병 성 망막증과 같은 다양한 망막 신경 혈관 질환을 연구하기위한 생체 외 모델로서 유익합니다.

초록

망막 연구의 과제 중 하나는 망막 뉴런, 신경교 세포 및 혈관 세포와 같은 서로 다른 망막 세포 간의 혼선을 연구하는 것입니다. 시험관 내에서 망막 뉴런을 분리, 배양 및 유지하는 것은 기술적, 생물학적 한계가 있습니다. 망막 체외이식편을 배양하면 이러한 한계를 극복하고 잘 제어된 생화학적 매개변수를 가지고 있고 혈관계와 무관하게 다양한 망막 세포 간의 혼선을 연구할 수 있는 고유한 생체 외 모델을 제공할 수 있습니다. 또한, 망막 체외이식편은 당뇨병성 망막병증과 같은 다양한 망막 혈관 및 신경퇴행성 질환에 대한 새로운 약리학적 개입을 연구하기 위한 효과적인 스크리닝 도구입니다. 여기에서는 망막 체외이식편의 분리 및 장기간 배양을 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 원고는 또한이 절차 동안 망막 체외 이식편 배양의 원하는 결과와 재현성에 영향을 미칠 수있는 기술적 문제 중 일부를 제시합니다. 망막 혈관, 신경교 세포 및 뉴런의 면역 염색은 망막 체외이식편 배양 시작으로부터 2주 후에 손상되지 않은 망막 모세혈관 및 신경교세포를 입증했습니다. 이것은 망막 외식편을 당뇨병성 망막병증과 같은 망막 질환을 모방하는 조건에서 망막 혈관 및 신경교세포의 변화를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 도구로 설정합니다.

서문

생체 내 및 시험관 내 모델 모두를 포함하여 망막 질환을 연구하기 위해 다양한 모델이 제시되었습니다. 연구에서 동물의 사용은 여전히 지속적인 윤리적 및 번역 적 논쟁의 문제입니다¹. 생쥐 또는 쥐와 같은 설치류를 포함하는 동물 모델은 망막 연구 ^2,3,4에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 황반의 부재 또는 색각의 차이와 같이 인간과 비교하여 설치류에서 망막의 생리적 기능이 다르기 때문에 임상 적 문제가 발생했습니다⁵. 망막 연구를 위한 인간 사후 눈의 사용은 또한 원본 샘플의 유전적 배경, 기증자의 병력, 기증자의 이전 환경 또는 생활 방식의 차이를 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 문제를 가지고^{있습니다6.} 또한 망막 연구에서 체외 모델을 사용하는 데에도 몇 가지 단점이 있습니다. 망막 질환을 연구하기 위해 사용되는 세포 배양 모델에는 인간 기원의 세포주, 일차 세포 또는^{줄기 세포의 활용}이 포함됩니다7. 사용된 세포 배양 모델은 오염, 오식별 또는 역분화 측면에서 문제가 있는 것으로 나타났습니다 8,9,10,11. 최근 망막 오가노이드 기술은 상당한 발전을 보이고 있습니다. 그러나 시험관 내에서 매우 복잡한 망막의 구성에는 몇 가지 한계가 있습니다. 예를 들어, 망막 오가노이드는 성숙한 생체 내 망막과 동일한 생리학적 및 생화학적 특성을 갖지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 망막 오가노이드 기술은 평활근 세포, 혈관 및 미세아교세포^12,13,14,15와 같은 면역 세포를 포함하여 더 많은 생물학적 및 세포 기능을 통합해야 합니다.

기관형 망막 외식편은 당뇨병성 망막증 및 퇴행성 망막 질환^16,17,18,19와 같은 망막 질환을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 도구로 부상했습니다. 기존의 다른 기술과 비교하여 망막 체외이식편의 사용은 동일한 생화학적 매개변수 하에서 전신 변수와 무관하게 다양한 망막 세포 간의 혼선을 연구하는 고유한 기능을 추가하여 체외 망막 세포 배양과 현재의 생체 내 동물 모델을 모두 지원합니다. 체외이식편 배양은 상이한 망막 세포가 동일한 환경에서 함께 유지되도록 하여 망막 세포간 상호작용의 보존을 가능하게 한다(^20,21,22). 더욱이, 이전의 연구는 망막 체외이식편이 배양된 망막 세포의 형태학적 구조 및 기능성을 보존할 수 있음을 보여주었다(²³). 따라서, 망막 외식편은 매우 다양한 망막 질환에 대한 가능한 치료 표적을 조사하기 위한 적절한 플랫폼을 제공할 수 있다(^24,25,26). 망막 체외이식편 배양은 제어 가능한 기술을 제공하며 수많은 약리학적 조작을 허용하고 여러 분자 메커니즘을 밝힐 수 있는 기존 모토드에 대한 매우 유연한 대체물입니다²⁷.

이 논문의 전반적인 목표는 망막 체외 이식편 기술을 시험관 내 세포 배양과 생체 내 동물 모델 사이의 합리적인 중간 모델 시스템으로 제시하는 것입니다. 이 기술은 해리 된 세포보다 더 나은 방식으로 망막 기능을 모방 할 수 있습니다. 다양한 망막 층이 손상되지 않은 상태로 유지됨에 따라 망막 세포 간 상호 작용은 잘 제어 된 생화학 적 조건 하에서 실험실에서 평가할 수 있으며 혈관계 기능과 무관하게 평가할 수 있습니다²⁸.

프로토콜

모든 동물 실험은 미국 미시건 주 로체스터에있는 오클랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서에서 제정 한 지침을 따랐습니다.

1. 동물 준비

1. 빛이 조절되는 환경에서 동물을 일정한 온도로 보관하십시오. 동물 사육실의 온도 설정은 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드"에 명시된 지침을 따라야합니다. 마우스의 온도 범위는 18 ° C에서 26 ° C 사이입니다. 습도 수준을 제어하고 약 42 %로 설정하십시오.
2. 이 실험에서는 12주령 이상인 수컷 C57BL/6J 마우스(자세한 내용은 재료 표 참조)를 사용합니다(이 프로토콜에는 성인 마우스를 사용함).
   참고: 망막에 영향을 미치는 유전적 이상이 없었기 때문에 시연을 위해 이 프로토콜에서 야생형 균주가 사용되었습니다. 그러나 망막 체외이식편 배양을 위해 유전자 조작 균주를 포함한 다른 균주를 사용할 수 있습니다.
3. 동물 사육실의 조명 제어를 통해 12시간의 명/암 주기를 제공합니다.
4. 모든 동물의 건강과 적절한 음식 및 물 섭취량을 주중에는 하루에 두 번, 주말에는 하루에 한 번 검사하십시오. 신선한 음식과 깨끗한 물을 제공하십시오.
5. 주중에 음식과 수위가 낮 으면 물병을 헹구고 다시 채우십시오. 필요할 때마다 신선한 음식을 추가하십시오. 더러워진 케이지를 매일 또는 동물의 건강을 위해 필요에 따라 교체하십시오.
   참고: 망막의 광수용체와 빛으로 인한 변화를 연구하려면 동물 시설의 어두운 방에 위치한 특수 어두운 상자에서 밤새 마우스를 어둡게 적응시킵니다.
6. _CO2 챔버에 연결된 실린더에서 압축된_CO2 가스를 사용하여_CO2 흡입 과량투여에 의해 그들의 홈 케이지에서 동물을 안락사시킨다. 자궁 경부 탈구와 같은 안락사의 2 차 방법을 사용하여 사망 확인을 수행하십시오.
7. 절차를 완료 한 후 심장 및 호흡 정지를 확인하거나 동물의 고정 및 확장 된 동공을 관찰하는 것과 같은 적절한 방법으로 동물의 죽음을 확인하십시오.

2. 조직 준비

1. 동물이 안락사되면 70 % 에탄올로 해당 부위를 청소하십시오. 그런 다음 눈이 보이도록 한 손으로 눈꺼풀을 엽니 다. 지구본이 튀어 나올 때까지 구부러진 집게를 사용하여 반대쪽 손으로 궤도의 상후부에 압력을가하십시오.
2. 눈을 핵을 제거하려면 눈의 뒤쪽 부분에 있는 집게를 부드럽게 닫고 연속적인 동작으로 들어 올립니다. 집게를 사용하여 시신경에서 안구를 잡으십시오. 모든 단계에 멸균 된 해부 도구를 사용하고 완전한 무균 조건에서 작업하십시오.
3. 각 안구를 페니실린-스트렙토마이신(10,000U/mL)이 함유된 얼음처럼 차가운 HBSS 1mL가 들어 있는 1.5mL 튜브에 담그십시오. HBSS에서 안구를 각각 5분 동안 두 번 씻습니다.
4. 안구를 완전한 배지(10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신)가 들어 있는 1.5-2mL 튜브로 옮깁니다.

3. 조직 해부

1. 그림 1과 같이 작동 현미경으로 망막을 조심스럽게 해부합니다.
   1. 안구를 열기 위해 윤부 주위를 원주 절개하십시오. 각막의 경계를 따라 원형으로 해부하여 각막을 제거하고 (윤부) 절개한 다음 전방 분절, 렌즈 및 유리체를 제거하고 빈 안안컵을 남깁니다.
   2. 시신경 머리 부위를 미세한 집게로 잡고 눈의 바깥 쪽 코트를 부드럽게 벗겨냅니다. 신경 망막을 손상시키지 않고 망막이 완전히 손상되지 않도록 외부 코트를 제거하는 동안 세심한주의를 기울이십시오.
      참고: 망막은 망막 색소 상피(RPE)에서 조심스럽게 벗겨야 하며, 시신경두에서 망막을 분리하려면 시신경 두를 한 번 절개해야 합니다. 시신경 (시신경 머리)이 남긴 구멍을 식별하여이를 시각적으로 확인하십시오.
   3. 망막을 방사상으로 4 개의 동일한 크기의 조각으로 해부합니다.
2. 망막 배양의 적절한 방향을 보장하기 위해 망막의 작은 조각을 다루려면 아래 단계를 따르십시오.
   1. 해부 가위 날을 사용하여 망막 조각 (재료 표) 바로 아래를 엽니 다.
   2. 열린 가위 날의 끝으로 망막 조각을 천천히 들어 올려 배양 접시에 부드럽게 옮깁니다.
3. 분리된 망막에서 유래한 체외이식편을 각각 망막 신경절 세포(뉴로레티나) 쪽이 위를 향하도록 각각 300μL의 망막 체외이식편이 들어 있는 12웰 플레이트의 세포 배양 삽입물에 옮깁니다.
   참고: 미디어가 N2 및 B27 보충제가 포함된 DMEM 미디어인지 확인합니다. 페니실린-스트렙토 마이신 (10,000 U / mL)을 배지에 추가하십시오 (재료 표). 망막은 시냅스를 통해 상호 연결된 여러 층의 신경 세포로 형성되며 해부 중에 제거 된 검은 색 층 인 망막 색소 상피의 색소 층에 의해 외부에서지지됩니다.
4. 착색 된 상피의 잔해를 제거하십시오. 그러나 이러한 잔류물은 체외이식편의 적절한 방향을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 착색된 부분이 아래를 향하고 착색되지 않은 부분이 위를 향하고 있는지 확인하십시오.
5. 망막 체외이식편 배양물을 37°C 및 5%_CO2의 가습 배양기에서 배양한다.
6. 망막 표면이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. 망막 조각이 뒤집히거나 접힌 경우 올바른 방향으로 부드럽게 조정하십시오.
   참고: 배양 플레이트에서 망막 외식편의 올바른 방향에 큰 주의를 기울이십시오. 배양 용기에서 체외이식편이 뒤집히거나 접히면 배양에서 망막 세포의 적절한 성장이 실패할 수 있으므로 피하십시오.

4. 망막 체외이식편 배양

1. 망막 체외이식편 배양물(3.2-3.3단계에서 제조)을 37°C 및 5%_CO2의 가습 인큐베이터에서 유지한다.
2. 2 주 동안 격일로 각 우물에서 미디어의 절반을 교체하십시오. 웰에서 150 μL를 조심스럽게 피펫팅하여 이를 수행합니다. 그런 다음 150μL의 새 배지를 웰에 다시 추가합니다. 미디어를 변경할 때 체외이식편을 뒤집지 마십시오.
3. 배양 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣기 전에 현미경으로 체외이식편을 주의 깊게 확인하십시오. 명시야 현미경으로 세포의 무결성과 망막 구조를 검사합니다. 체외이식편의 방향이 여전히 올바른지 확인하십시오. 4x 및 20x 대물 렌즈를 모두 사용하여 외이식편을 검사합니다.
   알림: 체외이식편이 미디어에 완전히 잠기지 않도록 하십시오.

5. 면역조직화학

1. 2 주 후, 미디어를 제거하여 망막 체외 이식편을 고정하십시오. 먼저 200μL의 1x PBS로 한 번 세척한 다음 0.1M PBS, pH 7.4 중 300μL의 4% 파라포름알데히드를 체외이식편이 포함된 웰에 첨가하고 밤새 방치함으로써 이를 수행합니다.
   알림: 이 단계는 플레이트에서 배양 삽입물을 제거하지 않고 수행할 수 있습니다. 체외이식편은 또한 500μL 원추형 튜브로 옮겨질 수 있으며 세척 및 고정은 튜브 내부에서 수행할 수 있습니다.
2. 세척을 위해 체외이식편을 300μL의 1x PBS-2.5% 트리톤 X를 함유하는 500μL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
3. 튜브에 고정된 체외이식편을 셰이커에서 중간 속도(25rpm)를 사용하여 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
4. 항체 인큐베이션 전에 실온에서 1시간 동안 0.02% 티메로살을 함유하는 300μL의 1x 블로킹 완충액과 함께 체외이식편을 인큐베이션함으로써 예상되는 비특이적 반응을 차단하였다.
5. 고정된 체외이식편을 1차 항체와 함께 4°C에서 중간 속도를 사용하여 밤새 진탕기에서 인큐베이션합니다.
   참고: GSL I, BSL I 항체(렉틴)로 염색하여 고정된 체외이식편에서 망막 내피 세포를 검출합니다(7:1,000). 토끼 신경교 섬유소 산성 단백질(GFAP) 항체로 염색하여 망막 외식편에서 신경교 세포를 검출합니다(1:250). 토끼 NeuN 항체 (1:250)^29,30으로 체외이식편을 염색하여 망막 뉴런을 검출합니다. 인큐베이트 s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome은 렉틴, NeuN 조합으로 체외이식편을 배양하고 나머지는 렉틴, GFAP 조합으로 배양합니다.
6. 다음날, 피펫으로 흡인하여 튜브에서 1 차 항체를 제거하십시오. 체외이식편을 1x PBS-2.5% 트리톤 X로 셰이커에서 중간 속도를 사용하여 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
7. 2 차 항체를 추가하십시오 : 염소 항 토끼 IgG (1 : 500) (GFAP 및 NeuN의 경우 보조) 및 텍사스 레드 (7 : 1,000) (렉틴의 경우). 셰이커에서 중간 속도를 사용하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 2차 항체는 빛에 민감하므로 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
8. 흡인에 의해 2차 항체를 제거한 다음, 1x PBS-2.5% 트리톤 X로 각각 5분 동안 3회 세척하였다.
9. 이송 피펫을 사용하여 튜브에서 유리 슬라이드로 체외이식편을 옮깁니다. 슬라이드에서 여분의 액체를 제거한 다음 DAPI가 있는 장착 미디어 한 방울을 슬라이드에 추가합니다.
10. 커버 슬립으로 티슈를 덮으십시오. 커버 슬립과 티슈 사이에 기포가 생기지 않도록하십시오.
11. 염색된 슬라이드를 형광 현미경으로 가져가 이미지 촬영을 시작합니다. 형광 염색은 빛에 민감하므로 슬라이드 상자를 사용하여 염색된 슬라이드를 덮는 것이 중요합니다.

결과

생체 외 배양 배지에서 망막 외식편의 신경 및 혈관 망막 세포의 생존 연장 시간
우리의 프로토콜을 사용하여 망막 체외이식편을 배양함으로써 우리는 최대 2주 동안 생존할 수 있는 다양한 망막 세포를 유지하는 데 성공했습니다. 상이한 망막 세포의 존재를 확인하기 위해, 신경 세포 마커 (NeuN), 신경교 세포 마커 (GFAP) 및 혈관 마커 (isolectin-B4)를 ?...

토론

우리 연구실은^{31,32,33,34,35,36} 년 동안 망막 미세 혈관 기능 장애를 촉진하는 병태 생리 학적 변화를 연구 해 왔습니다. 망막 외식편은 당뇨병성 망막증이나 퇴행성 망막질환과 같은 망막 질환을 연구하기 위한 모델로 사용하기에 큰 가치가 있는 기술...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407