Эксплантация сетчатки взрослой мыши как модель Ex Vivo для изучения нейрососудистых заболеваний сетчатки

Резюме

В этом протоколе представлены и описаны этапы выделения, рассечения, культивирования и окрашивания эксплантов сетчатки, полученных от взрослой мыши. Этот метод полезен в качестве модели ex vivo для изучения различных нейрососудистых заболеваний сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия.

Аннотация

Одной из проблем в исследованиях сетчатки является изучение перекрестных помех между различными клетками сетчатки, такими как нейроны сетчатки, глиальные клетки и сосудистые клетки. Выделение, культивирование и поддержание нейронов сетчатки in vitro имеют технические и биологические ограничения. Культивирование эксплантов сетчатки может преодолеть эти ограничения и предложить уникальную модель ex vivo для изучения перекрестных помех между различными клетками сетчатки с хорошо контролируемыми биохимическими параметрами и независимо от сосудистой системы. Кроме того, экспланты сетчатки являются эффективным инструментом скрининга для изучения новых фармакологических вмешательств при различных сосудистых и нейродегенеративных заболеваниях сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия. Здесь мы опишем подробный протокол изоляции и культуры эксплантов сетчатки в течение длительного периода. В рукописи также представлены некоторые технические проблемы во время этой процедуры, которые могут повлиять на желаемые результаты и воспроизводимость культуры эксплантата сетчатки. Иммуноокрашивание сосудов сетчатки, глиальных клеток и нейронов продемонстрировало интактные капилляры сетчатки и нейроглиальные клетки через 2 недели с начала культуры эксплантата сетчатки. Это делает экспланты сетчатки надежным инструментом для изучения изменений в сосудистой системе сетчатки и нейроглиальных клетках в условиях, имитирующих заболевания сетчатки, такие как диабетическая ретинопатия.

Введение

Для изучения заболеваний сетчатки были представлены различные модели, включая модели in vivo и in vitro. Использование животных в исследованиях по-прежнему является предметом непрерывных этических и трансляционных дебатов¹. Животные модели с участием грызунов, таких как мыши или крысы, обычно используются в исследованиях сетчатки ^2,3,4. Тем не менее, клинические проблемы возникли из-за различных физиологических функций сетчатки у грызунов по сравнению с людьми, таких как отсутствие макулы или различия в цветовом зрении⁵. Использование посмертных глаз человека для исследований сетчатки также имеет много проблем, включая, но не ограничиваясь, различиями в генетическом фоне оригинальных образцов, истории болезни доноров и предыдущей среде или образе жизни доноров⁶. Кроме того, использование моделей in vitro в исследованиях сетчатки также имеет некоторые недостатки. Модели клеточных культур, используемые для изучения заболеваний сетчатки, включают использование клеточных линий человеческого происхождения, первичных клеток или стволовых клеток⁷. Было показано, что используемые модели клеточных культур имеют проблемы с точки зрения загрязнения, неправильной идентификации или дедифференцированности 8,9,10,11. В последнее время органоидная технология сетчатки показала значительный прогресс. Однако построение очень сложных сетчаток in vitro имеет ряд ограничений. Например, органоиды сетчатки не имеют тех же физиологических и биохимических характеристик, что и зрелые сетчатки in vivo. Чтобы преодолеть это ограничение, органоидная технология сетчатки должна интегрировать больше биологических и клеточных особенностей, включая гладкомышечные клетки, сосудистую систему и иммунные клетки, такие как микроглия ^12,13,14,15.

Органотипические экспланты сетчатки стали надежным инструментом для изучения таких заболеваний сетчатки, как диабетическая ретинопатия и дегенеративные заболевания сетчатки 16,17,18,19. По сравнению с другими существующими методами, использование эксплантов сетчатки поддерживает как культуры клеток сетчатки in vitro, так и современные модели животных in vivo, добавляя уникальную особенность для изучения перекрестных помех между различными клетками сетчатки при одних и тех же биохимических параметрах и независимо от системных переменных. Экстраплантные культуры позволяют различным клеткам сетчатки храниться вместе в одной среде, что позволяет сохранить межклеточные взаимодействия сетчатки 20,21,22. Более того, предыдущее исследование показало, что экспланты сетчатки способны сохранять морфологическую структуру и функциональность культивируемых клеток сетчатки²³. Таким образом, экспланты сетчатки могут обеспечить достойную платформу для исследования возможных терапевтических целей для широкого спектра заболеваний сетчатки 24,25,26. Экстраплантные культуры сетчатки обеспечивают контролируемую технику и являются очень гибкой заменой существующим мотылькам, которые позволяют проводить многочисленные фармакологические манипуляции и могут раскрыть несколько молекулярных механизмов²⁷.

Общая цель данной работы состоит в том, чтобы представить метод эксплантации сетчатки в качестве разумной промежуточной модельной системы между клеточными культурами in vitro и моделями животных in vivo . Этот метод может имитировать функции сетчатки лучше, чем диссоциированные клетки. Поскольку различные слои сетчатки остаются нетронутыми, межклеточные взаимодействия сетчатки могут быть оценены в лаборатории в хорошо контролируемых биохимических условиях и независимо от функционирования сосудистой системы²⁸.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Оклендском университете, Рочестер, штат Мичиган, США и соответствовали руководящим принципам, установленным Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Подготовка животных

1. Держите животных под постоянной температурой в среде с контролируемым светом. Температурные условия для комнаты содержания животных должны соответствовать руководящим принципам, изложенным в «Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию». Температурный диапазон для мышей составляет от 18 °C до 26 °C. Держите уровень влажности под контролем и установите его на уровне около 42%.
2. Для этого эксперимента используйте самцов мышей C57BL/6J (подробности см. в Таблице материалов ), которым более 12 недель (для этого протокола использовалась взрослая мышь).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм дикого типа был использован в этом протоколе для демонстрации, так как он не имел каких-либо генетических аномалий, влияющих на сетчатку. Тем не менее, можно использовать другие штаммы, в том числе генетически модифицированные штаммы, для культуры эксплантата сетчатки.
3. Обеспечьте 12-часовые циклы света / темноты с помощью управления освещением в комнатах содержания животных.
4. Осматривайте каждое животное на предмет здоровья и адекватного потребления пищи и воды два раза в день в течение недели и один раз в день в выходные дни. Обязательно обеспечьте их свежей пищей и чистой водой.
5. Если уровень пищи и воды низкий в течение недели, промойте бутылку с водой и наполните ее. Добавляйте свежие продукты, когда это необходимо. Меняйте загрязненные клетки ежедневно или по мере необходимости для здоровья животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения фоторецепторов и светоиндуцированных изменений в сетчатке, темные мыши адаптируются на ночь в специальном темном ящике, расположенном в темной комнате в животном помещении.
6. Усыпляйте животных в их домашней клетке путем передозировки вдыхания CO₂ с использованием сжатого газа CO₂ в баллонах, подключенных к камере CO₂ . Провести подтверждение смерти с помощью вторичного метода эвтаназии, такого как вывих шейки матки.
7. После завершения процедуры подтвердите гибель животного соответствующим методом, таким как подтверждение остановки сердца и дыхания или наблюдение за фиксированными и расширенными зрачками животного.

2. Подготовка тканей

1. После того, как животное будет усыплено, очистите область 70% этанолом. Затем откройте веки одной рукой так, чтобы глаз был виден. Применяйте давление на верхнюю и нижнюю части орбиты противоположной рукой, используя изогнутые щипцы, пока земной шар не выступит.
2. Чтобы энуклеировать глаз, осторожно закройте щипцы на задней части глаза и поднимитесь непрерывным движением. С помощью щипцов удерживайте глазное яблоко от зрительного нерва. Обязательно используйте стерилизованные инструменты для рассечения для всех этапов и работайте в полных асептических условиях.
3. Погрузите каждое глазное яблоко в трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл ледяного HBSS с пенициллин-стрептомицином (10 000 Ед/мл). Промыть глазное яблоко в HBSS дважды по 5 мин каждый.
4. Переведите глазное яблоко в пробирку объемом 1,5-2 мл, содержащую полную среду (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-глутамина и 1% пенициллина и стрептомицина).

3. Рассечение тканей

1. Тщательно рассекните сетчатку под операционным микроскопом, как показано последовательно на рисунке 1.
   1. Сделайте окружной разрез вокруг лимбуса, чтобы открыть глазное яблоко. Удалите роговицу, циркулярно рассекнув вдоль границы роговицы и (лимбального) разреза, а затем удалив передний сегмент, хрусталик и стекловидное тело, оставив пустую глазную чашку.
   2. Удерживая область головки зрительного нерва тонкими щипцами, аккуратно отшелушите внешний слой глаза. Уделяйте большое внимание во время удаления наружной оболочки, чтобы не травмировать нервную сетчатку и обеспечить, чтобы сетчатка оставалась полностью неповрежденной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатка должна быть тщательно отслоена от пигментного эпителия сетчатки (RPE), и должен быть выполнен один разрез на головке зрительного нерва, чтобы отделить сетчатку от зрительного нерва. Визуально убедитесь в этом, определив отверстие, оставленное зрительным нервом (головкой зрительного нерва).
   3. Рассекните сетчатку радиально на четыре одинаковых по размеру кусочка.
2. Выполните следующие действия для обработки небольших кусочков сетчатки, чтобы обеспечить правильную ориентацию культуры сетчатки.
   1. Используя рассекающее ножничное лезвие, откройте прямо под куском сетчатки (Таблица материалов).
   2. Медленно поднимите кусок сетчатки кончиком открытого ножничного лезвия и аккуратно перенесите его на культуральную пластину.
3. Перенесите экспланты, полученные из изолированной сетчатки, отдельно на клеточные культуральные вставки в 12-луночной пластине, каждая из которых содержит 300 мкл экстраплантной среды сетчатки, причем сторона ганглиозной клетки сетчатки (нейроретина) обращена вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что носитель является носителем DMEM с добавками N2 и B27. Добавьте пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) также в среду (Таблица материалов). Сетчатка образована из нескольких слоев нейрональных клеток, соединенных между собой через синапсы и поддерживаемых снаружи пигментированным слоем пигментного эпителия сетчатки, который представляет собой черный слой, который был удален во время рассечения.
4. Удалить остатки пигментированного эпителия; однако эти остатки могут помочь в определении правильной ориентации эксплантата. Убедитесь, что пигментированная часть обращена вниз, а непигментированная часть обращена вверх.
5. Инкубируют экстраплантную культуру сетчатки в увлажненных инкубаторах при 37 °C и 5% CO₂.
6. Убедитесь, что поверхность сетчатки обращена вверх. Если кусок сетчатки перевернут или сложен, попробуйте аккуратно отрегулировать его в правильной ориентации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите большое внимание на правильную ориентацию эксплантата сетчатки в культуральной пластине. Избегайте любого переворачивания или сворачивания эксплантата в культуральной пластине, так как это приведет к нарушению правильного роста клеток сетчатки в культуре.

4. Культура эксплантата сетчатки

1. Поддерживают экстраплантные культуры сетчатки (приготовленные на этапах 3.2-3.3) в увлажненных инкубаторах при 37 °C и 5% CO₂.
2. Меняйте половину носителей из каждой скважины через день в течение 2 недель. Делайте это путем тщательного пипетирования 150 мкл из лунки. Затем добавьте 150 мкл свежей среды обратно в колодец. Избегайте переворачивания эксплантата при смене носителя.
3. Тщательно проверьте эксплант под микроскопом, прежде чем поместить культуральную пластину обратно в инкубатор. Исследуйте целостность клеток и архитектуру сетчатки под ярким микроскопом. Убедитесь, что эксплант по-прежнему правильно ориентирован. Используйте объективы 4x и 20x для осмотра эксплантата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полного погружения экспланта в носитель.

5. Иммуногистохимия

1. Через 2 недели зафиксируйте эксплант сетчатки, удалив носитель. Сделайте это, сначала промыв один раз 200 мкл 1x PBS, а затем добавив 300 мкл 4% параформальдегида в 0,1 М PBS, рН 7,4, в скважину, содержащую эксплант, и оставив его на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить, не снимая вставки культуры с пластины. Экспланты также могут быть перенесены в коническую трубку объемом 500 мкл, а промывка и фиксация могут быть выполнены внутри трубки.
2. Переложите эксплант в коническую трубку объемом 500 мкл, содержащую 300 мкл 1x PBS-2,5% Triton X для промывки.
3. Промывайте неподвижные экспланты в трубке три раза в течение 5 мин каждый, используя среднюю скорость на шейкере (25 об/мин).
4. Блокируют ожидаемые неспецифические реакции путем инкубации экспланта с 300 мкл 1x блокирующего буфера, содержащего 0,02% тимеросала, в течение 1 ч при комнатной температуре до инкубации антител.
5. Инкубируют неподвижные экспланты с первичными антителами в течение ночи при 4 °C, используя среднюю скорость на шейкере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение эндотелиальных клеток сетчатки в фиксированном экспланте путем окрашивания антителом GSL I, BSL I (лектин) (7:1000). Обнаружение глиальных клеток в эксплантатах сетчатки путем окрашивания антителом к глиальному фибриллярному кислому белку кролика (GFAP) (1:250). Обнаружение нейронов сетчатки путем окрашивания экспланта антителом NeuN кролика (1:250)^29,30. Инкубировать s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome экспланты с комбинацией лектина, NeuN и инкубировать другие с комбинацией лектина, GFAP.
6. На следующий день удалите первичное антитело из труб путем аспирации пипеткой. Промывайте экспланты 1x PBS-2,5% Triton X три раза в течение 5 мин каждый, используя среднюю скорость на шейкере.
7. Добавьте вторичные антитела: Козий анти-Кролик IgG (1:500) (вторичный для GFAP и NeuN) и Texas Red (7:1000) (для лектина). Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре, используя среднюю скорость на шейкере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела светочувствительны, поэтому накройте трубку алюминиевой фольгой.
8. Удаляют вторичные антитела путем аспирации, а затем промыть три раза по 5 мин каждый с 1x PBS-2,5% Triton X.
9. Перенесите эксплант из трубки на стеклянную горку с помощью передаточной пипетки. Удалите лишнюю жидкость с слайда, а затем добавьте на слайд одну каплю монтажного носителя с DAPI.
10. Накройте ткань чехлом. Не допускайте пузырьков воздуха между обложек и тканью.
11. Отнесите окрашенные слайды к флуоресцентному микроскопу и начните делать снимки. Важно покрыть окрашенные слайды с помощью слайд-бокса, так как флуоресцентное окрашивание светочувствительно.

Результаты

Выживание нейронных и сосудистых клеток сетчатки эксплантата сетчатки в культуральной среде ex vivo в течение длительного времени
Культивируя эксплант сетчатки с использованием нашего протокола, мы успешно поддерживали различные клетки сетчатки, кото...

Обсуждение

Наша лаборатория изучает патофизиологические изменения, которые способствуют микрососудистой дисфункции сетчатки в течение 31,32,33,34,35,36 лет. Экспланты сетчатки являются одним из...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407