Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

Özet

Bu protokol, yetişkin bir fareden elde edilen retinal eksplantların izolasyonu, diseksiyonu, kültürlenmesi ve boyanması için adımları sunar ve açıklar. Bu yöntem, diyabetik retinopati gibi farklı retinal nörovasküler hastalıkları incelemek için ex vivo bir model olarak faydalıdır.

Özet

Retina araştırmalarındaki zorluklardan biri, retinal nöronlar, glial hücreler ve vasküler hücreler gibi farklı retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemektir. Retinal nöronların in vitro olarak izole edilmesi, kültürlenmesi ve sürdürülmesinin teknik ve biyolojik sınırlamaları vardır. Retinal eksplantların kültürlenmesi bu sınırlamaların üstesinden gelebilir ve iyi kontrol edilen biyokimyasal parametrelere sahip ve vasküler sistemden bağımsız olarak çeşitli retinal hücreler arasındaki çapraz konuşmayı incelemek için benzersiz bir ex vivo model sunabilir. Ayrıca, retinal eksplantlar, diyabetik retinopati gibi çeşitli retinal vasküler ve nörodejeneratif hastalıklarda yeni farmakolojik müdahaleleri incelemek için etkili bir tarama aracıdır. Burada, retinal eksplantların izolasyonu ve kültürü için uzun bir süre için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Makale ayrıca bu işlem sırasında retinal eksplant kültürünün istenen sonuçlarını ve tekrarlanabilirliğini etkileyebilecek bazı teknik problemleri de sunmaktadır. Retinal damarların, glial hücrelerin ve nöronların immün boyaması, retinal eksplant kültürünün başlangıcından itibaren 2 hafta sonra sağlam retinal kılcal damarları ve nöroglial hücreleri gösterdi. Bu, retinal eksplantları, diyabetik retinopati gibi retinal hastalıkları taklit eden koşullar altında retinal vaskülatür ve nöroglial hücrelerdeki değişiklikleri incelemek için güvenilir bir araç olarak kurar.

Giriş

Retina hastalıklarını incelemek için hem in vivo hem de in vitro modeller de dahil olmak üzere farklı modeller sunulmuştur. Hayvanların araştırmalarda kullanımı hala sürekli bir etik ve çeviri tartışması konusudur¹. Fareler veya sıçanlar gibi kemirgenleri içeren hayvan modelleri, retinal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır ^2,3,4. Bununla birlikte, kemirgenlerde retinanın insanlara kıyasla farklı fizyolojik fonksiyonları nedeniyle, makulanın yokluğu veya renk vizyonundaki farklılıklar gibi klinik kaygılar ortaya çıkmıştır

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Oakland Üniversitesi, Rochester, MI, ABD'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı tarafından oluşturulan yönergeleri izledi.

1. Hayvan hazırlığı

1. Hayvanları ışık kontrollü bir ortamda sabit bir sıcaklık altında tutun. Hayvan barınma odası için sıcaklık ayarları, "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" tarafından belirtilen yönergelere uygun olmalıdır. Fareler için sıcaklık aralığı 18 °C ile 26 °C arasındadır. Nem seviyeleri....

Sonuçlar

Retinal eksplantın nöronal ve vasküler retinal hücrelerinin kültür medyasında ex vivo olarak uzun süre hayatta kalması
Protokolümüzü kullanarak retinal bir eksplantı kültüre alarak, 2 haftaya kadar canlı olan farklı retina hücrelerini korumada başarılı olduk. Farklı retina hücrelerinin varlığını doğrulamak için, nöronal hücre belirteci (NeuN), glial hücre belirteci (GFAP) ve vasküler belirteç (izolektin-B4) kullanılarak reti.......

Tartışmalar

Laboratuvarımız^{31,32,33,34,35,36} yıldır retinal mikrovasküler disfonksiyonu destekleyen patofizyolojik değişiklikleri incelemektedir. Retinal eksplantlar, diyabetik retinopati veya dejeneratif retina hastalıkları gibi retina hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanılması çok değerli olabilecek t.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407