Espianto retinico della retina del topo adulto come modello ex vivo per lo studio delle malattie neurovascolari retiniche

Riepilogo

Questo protocollo presenta e descrive i passaggi per l'isolamento, la dissezione, la coltivazione e la colorazione degli espianti retinici ottenuti da un topo adulto. Questo metodo è utile come modello ex vivo per lo studio di diverse malattie neurovascolari retiniche come la retinopatia diabetica.

Abstract

Una delle sfide nella ricerca sulla retina è studiare il cross-talk tra diverse cellule retiniche come i neuroni retinici, le cellule gliali e le cellule vascolari. Isolare, coltivare e sostenere i neuroni retinici in vitro hanno limitazioni tecniche e biologiche. La coltura di espianti retinici può superare queste limitazioni e offrire un modello ex vivo unico per studiare il cross-talk tra varie cellule retiniche con parametri biochimici ben controllati e indipendenti dal sistema vascolare. Inoltre, gli espianti retinici sono un efficace strumento di screening per lo studio di nuovi interventi farmacologici in varie malattie vascolari e neurodegenerative della retina come la retinopatia diabetica. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura degli espianti retinici per un periodo prolungato. Il manoscritto presenta anche alcuni dei problemi tecnici durante questa procedura che possono influenzare i risultati desiderati e la riproducibilità della coltura retinica di espianto. L'immunocolorazione dei vasi retinici, delle cellule gliali e dei neuroni ha dimostrato capillari retinici e cellule neurogliali intatti dopo 2 settimane dall'inizio della coltura retinica di espianto. Ciò stabilisce che gli espianti retinici sono uno strumento affidabile per studiare i cambiamenti nella vascolarizzazione retinica e nelle cellule neurogliali in condizioni che imitano le malattie retiniche come la retinopatia diabetica.

Introduzione

Sono stati presentati diversi modelli per studiare le malattie della retina, inclusi modelli sia in vivo che in vitro. L'uso degli animali nella ricerca è ancora oggetto di continuo dibattito etico e traslazionale¹. I modelli animali che coinvolgono roditori come topi o ratti sono comunemente usati nella ricerca retinica ^2,3,4. Tuttavia, le preoccupazioni cliniche sono sorte a causa delle diverse funzioni fisiologiche della retina nei roditori rispetto agli esseri umani, come l'assenza della macula o le differenze nella visione dei colori⁵. L'uso di occhi umani postmortem per la ricerca sulla retina ha anche molti problemi, inclusi ma non limitati a differenze nei background genetici dei campioni originali, la storia medica dei donatori e gli ambienti o gli stili di vita precedenti dei donatori⁶. Inoltre, l'uso di modelli in vitro nella ricerca retinica presenta anche alcuni inconvenienti. I modelli di coltura cellulare utilizzati per studiare le malattie della retina includono l'utilizzo di linee cellulari di origine umana, cellule primarie o cellule staminali⁷. I modelli di coltura cellulare utilizzati hanno dimostrato di avere problemi in termini di contaminazione, identificazione errata o dedifferenziazione 8,9,10,11. Recentemente, la tecnologia degli organoidi retinici ha mostrato progressi significativi. Tuttavia, la costruzione di retine altamente complesse in vitro ha diverse limitazioni. Ad esempio, gli organoidi retinici non hanno le stesse caratteristiche fisiologiche e biochimiche delle retine mature in vivo. Per superare questa limitazione, la tecnologia degli organoidi retinici deve integrare più caratteristiche biologiche e cellulari, comprese le cellule muscolari lisce, la vascolarizzazione e le cellule immunitarie come la microglia^12,13,14,15.

Gli espianti organotipici della retina sono emersi come uno strumento affidabile per lo studio delle malattie retiniche come la retinopatia diabetica e le malattie degenerative della retina^16,17,18,19. Rispetto ad altre tecniche esistenti, l'uso di espianti retinici supporta sia colture cellulari retiniche in vitro che modelli animali in vivo attuali aggiungendo una caratteristica unica per studiare il cross-talk tra varie cellule retiniche sotto gli stessi parametri biochimici e indipendenti da variabili sistemiche. Le colture di espianti consentono di mantenere insieme diverse cellule retiniche nello stesso ambiente, consentendo la conservazione delle interazioni intercellulari retiniche^20,21,22. Inoltre, uno studio precedente ha dimostrato che gli espianti retinici erano in grado di preservare la struttura morfologica e la funzionalità delle cellule retiniche in coltura²³. Pertanto, gli espianti retinici possono fornire una piattaforma decente per studiare possibili bersagli terapeutici per un'ampia varietà di malattie retiniche^24,25,26. Le colture di espianti retinici forniscono una tecnica controllabile e sono sostituti molto flessibili dei motod esistenti che consentono numerose manipolazioni farmacologiche e possono scoprire diversi meccanismi molecolari²⁷.

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di presentare la tecnica dell'espianto retinico come un ragionevole sistema di modelli intermedi tra colture cellulari in vitro e modelli animali in vivo . Questa tecnica può imitare le funzioni retiniche in un modo migliore rispetto alle cellule dissociate. Poiché vari strati retinici rimangono intatti, le interazioni intercellulari retiniche possono essere valutate in laboratorio in condizioni biochimiche ben controllate e indipendenti dal funzionamento del sistema vascolare²⁸.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università di Oakland, Rochester, MI, USA e hanno seguito le linee guida stabilite dalla dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Preparazione degli animali

1. Mantenere gli animali alloggiati a temperatura costante in un ambiente controllato dalla luce. Le impostazioni di temperatura per la stanza di stabulazione degli animali devono seguire le linee guida stabilite dalla "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio". L'intervallo di temperatura per i topi è compreso tra 18 °C e 26 °C. Mantenere i livelli di umidità controllati e impostati a circa il 42%.
2. Per questo esperimento, utilizzare topi maschi C57BL / 6J (controllare la tabella dei materiali per i dettagli) che hanno più di 12 settimane di età (un topo adulto è stato utilizzato per questo protocollo).
   NOTA: Un ceppo wild-type è stato utilizzato in questo protocollo per la dimostrazione, in quanto non presentava anomalie genetiche che colpivano la retina. Tuttavia, si potrebbero usare altri ceppi, compresi ceppi geneticamente manipolati, per la coltura di espianti retinici.
3. Fornire cicli luce/buio di 12 ore tramite il controllo dell'illuminazione nelle stanze di stabulazione degli animali.
4. Ispezionare ogni animale per la salute e l'assunzione adeguata di cibo e acqua due volte al giorno durante la settimana e una volta al giorno nei fine settimana. Assicurati di fornire loro cibo fresco e acqua pulita.
5. Se i livelli di cibo e acqua sono bassi durante la settimana, sciacquare la bottiglia d'acqua e riempirla. Aggiungi cibo fresco quando necessario. Cambiare le gabbie sporche ogni giorno o secondo necessità per la salute degli animali.
   NOTA: Per studiare i fotorecettori e i cambiamenti indotti dalla luce nella retina, adattare i topi durante la notte in una speciale scatola oscura situata in una stanza buia nella struttura animale.
6. Eutanasia gli animali nella loro gabbia domestica per overdose di inalazione di CO 2 usando gas CO₂ compresso in bombole collegate a una camera di CO₂. Condurre la conferma della morte utilizzando un metodo secondario di eutanasia come la lussazione cervicale.
7. Dopo aver completato la procedura, confermare la morte dell'animale con un metodo appropriato, come confermare l'arresto cardiaco e respiratorio o osservare le pupille fisse e dilatate dell'animale.

2. Preparazione dei tessuti

1. Una volta che l'animale è stato eutanasiato, pulire l'area con etanolo al 70%. Quindi, aprire le palpebre con una mano in modo che l'occhio sia visibile. Applicare pressione alle parti superiore e inferiore dell'orbita con la mano opposta usando una pinza curva fino a quando il globo sporge.
2. Per enucleare l'occhio, chiudere delicatamente la pinza sulla porzione posteriore dell'occhio e sollevare in un movimento continuo. Usando una pinza, tieni il bulbo oculare dal nervo ottico. Assicurarsi di utilizzare strumenti di dissezione sterilizzati per tutti i passaggi e di lavorare in condizioni completamente asettiche.
3. Immergere ogni bulbo oculare in un tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di HBSS ghiacciato con penicillina-streptomicina (10.000 U/mL). Lavare il bulbo oculare in HBSS due volte per 5 minuti ciascuno.
4. Trasferire il bulbo oculare in un tubo da 1,5-2 ml contenente mezzi completi (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutammina e 1% penicillina e streptomicina).

3. Dissezione dei tessuti

1. Sezionare attentamente la retina al microscopio operatorio, come illustrato in sequenza nella Figura 1.
   1. Fai un'incisione circonferenziale intorno al limbus per aprire il bulbo oculare. Rimuovere la cornea sezionando circolarmente lungo il bordo della cornea e l'incisione (limbale), seguita dalla rimozione del segmento anteriore, della lente e del corpo vitreo, lasciando una coppa oculare vuota.
   2. Tenendo la regione della testa del nervo ottico con una pinza fine, staccare delicatamente il rivestimento esterno dell'occhio. Prestare molta attenzione durante la rimozione del mantello esterno per non ferire la retina neurale e per garantire che la retina rimanga totalmente intatta.
      NOTA: La retina deve essere accuratamente staccata dall'epitelio pigmentato retinico (RPE) e deve essere eseguito un singolo taglio alla testa del nervo ottico per staccare la retina dal nervo ottico. Assicurarsi visivamente questo identificando il foro lasciato dal nervo ottico (la testa del nervo ottico).
   3. Sezionare la retina radialmente in quattro pezzi di uguali dimensioni.
2. Seguire i passaggi seguenti per gestire i piccoli pezzi della retina per garantire il corretto orientamento della coltura retinica.
   1. Utilizzando una lama a forbice da dissezione, aprire appena sotto il pezzo retinico (Table of Materials).
   2. Sollevare lentamente il pezzo retinico con la punta di una lama a forbice aperta e trasferirlo delicatamente sulla piastra di coltura.
3. Trasferire separatamente gli espianti derivati dalla retina isolata su inserti di coltura cellulare in una piastra a 12 pozzetti, ciascuno contenente 300 μL di mezzo di espianto retinico, con il lato della cellula gangliare retinica (neuroretina) rivolto verso l'alto.
   NOTA: Assicurarsi che il supporto sia DMEM con supplementi N2 e B27. Aggiungere penicillina-streptomicina (10.000 U / ml) al supporto come pure (Tabella dei materiali). La retina è formata da più strati di cellule neuronali interconnesse tramite sinapsi e sostenute dall'esterno dallo strato pigmentato dell'epitelio pigmentato retinico, che è lo strato nero che è stato rimosso durante la dissezione.
4. Rimuovere eventuali residui dell'epitelio pigmentato; Tuttavia, questi resti possono aiutare a identificare il corretto orientamento dell'espianto. Assicurarsi che la parte pigmentata sia rivolta verso il basso e che la parte non pigmentata sia rivolta verso l'alto.
5. Incubare la coltura retinica di espianti in incubatori umidificati a 37 °C e 5% di CO₂.
6. Assicurarsi che la superficie retinica sia rivolta verso l'alto. Se il pezzo retinico è capovolto o piegato, prova a regolarlo delicatamente con l'orientamento corretto.
   NOTA: Prestare molta attenzione al corretto orientamento dell'espianto retinico nella piastra di coltura. Evitare qualsiasi capovolgimento o piegatura dell'espianto nella piastra di coltura in quanto ciò comporterà il fallimento della corretta crescita delle cellule retiniche in coltura.

4. Coltura retinica di espianti

1. Mantenere le colture di espianti retinici (preparate nelle fasi 3.2-3.3) in incubatori umidificati a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Cambia metà dei media da ogni pozzetto a giorni alterni per 2 settimane. Fatelo pipettando con attenzione 150 μL dal pozzetto. Quindi, aggiungere 150 μL di terreno fresco nel pozzetto. Evitare di capovolgere l'espianto quando si cambia il supporto.
3. Controllare attentamente l'espianto al microscopio prima di rimettere la piastra di coltura nell'incubatore. Esaminare l'integrità delle cellule e l'architettura retinica al microscopio a campo chiaro. Assicurarsi che l'espianto sia ancora orientato correttamente. Utilizzare sia l'obiettivo 4x che 20x per esaminare l'espianto.
   NOTA: Evitare la completa immersione dell'espianto nel supporto.

5. Immunoistochimica

1. Dopo 2 settimane, fissare l'espianto retinico rimuovendo il mezzo. Farlo lavando prima una volta con 200 μL di 1x PBS e quindi aggiungendo 300 μL di paraformaldeide al 4% in 0,1 M PBS, pH 7,4, al pozzetto contenente l'espianto e lasciandolo durante la notte.
   NOTA: Questo passaggio può essere eseguito senza rimuovere gli inserti di coltura dalla piastra. Gli espianti possono anche essere trasferiti in un tubo conico da 500 μL e il lavaggio e la fissazione possono essere effettuati all'interno del tubo.
2. Trasferire l'espianto in un tubo conico da 500 μL contenente 300 μL di 1x PBS-2,5% Triton X per il lavaggio.
3. Lavare gli espianti fissi nel tubo tre volte per 5 minuti ciascuno utilizzando una velocità media su uno shaker (25 rpm).
4. Bloccare le reazioni non specifiche attese incubando l'espianto con 300 μL di tampone bloccante 1x contenente thimerosal allo 0,02% per 1 ora a temperatura ambiente prima dell'incubazione dell'anticorpo.
5. Incubare gli espianti fissi con gli anticorpi primari per una notte a 4 °C usando la velocità media su uno shaker.
   NOTA: Rilevare le cellule endoteliali retiniche nell'espianto fisso mediante colorazione con anticorpi GSL I, BSL I (lectina) (7:1.000). Rilevare le cellule gliali negli espianti retinici colorando con l'anticorpo della proteina acida fibrillare gliare di coniglio (GFAP) (1:250). Rilevare i neuroni retinici colorando l'espianto con l'anticorpo NeuN di coniglio (1:250)^29,30. Incubare s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome espianta con la combinazione lectina, NeuN e incuba altri con la combinazione lectina, GFAP.
6. Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario dalle provette mediante aspirazione con una pipetta. Lavare gli espianti con 1x PBS-2,5% Triton X tre volte per 5 minuti ciascuno utilizzando la velocità media su uno shaker.
7. Aggiungere gli anticorpi secondari: Goat anti-Rabbit IgG (1:500) (secondario per GFAP e NeuN) e Texas Red (7:1.000) (per la lectina). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando velocità media su uno shaker.
   NOTA: Gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce, quindi coprire il tubo con un foglio di alluminio.
8. Rimuovere gli anticorpi secondari mediante aspirazione, quindi lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS-2,5% Triton X.
9. Trasferire l'espianto dal tubo a un vetrino usando una pipetta di trasferimento. Rimuovere il liquido in eccesso sulla slitta, quindi aggiungere una goccia di supporto di montaggio con DAPI alla diapositiva.
10. Coprire il fazzoletto con un vetrino. Non lasciare bolle d'aria tra il copricapo e il fazzoletto.
11. Porta i vetrini colorati al microscopio a fluorescenza e inizia a scattare le immagini. È importante coprire i vetrini colorati utilizzando una scatola di scorrimento poiché la colorazione a fluorescenza è sensibile alla luce.

Risultati

Sopravvivenza delle cellule retiniche neuronali e vascolari dell'espianto retinico in terreni di coltura ex vivo per un tempo prolungato
Coltivando un espianto retinico utilizzando il nostro protocollo, siamo riusciti a mantenere diverse cellule retiniche che erano vitali per un massimo di 2 settimane. Per verificare la presenza di diverse cellule retiniche, è stata eseguita la colorazione immunofluorescenza dell'espianto retinico utilizzando un marcatore di...

Discussione

Il nostro laboratorio studia da anni i cambiamenti fisiopatologici che favoriscono la disfunzione microvascolare retinica 31,32,33,34,35,36. Gli espianti retinici sono una delle tecniche che possono essere di grande valore da utilizzare come modello per lo studio di malattie retiniche come la retinopatia diabetica o le malatt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407