Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt und beschreibt Schritte zur Isolierung, Dissektion, Kultivierung und Färbung von Netzhautexplantaten, die aus einer erwachsenen Maus gewonnen wurden. Diese Methode ist als Ex-vivo-Modell für die Untersuchung verschiedener neurovaskulärer Netzhauterkrankungen wie der diabetischen Retinopathie von Vorteil.

Zusammenfassung

Eine der Herausforderungen in der Netzhautforschung ist die Untersuchung des Cross-Talks zwischen verschiedenen Netzhautzellen wie Netzhautneuronen, Gliazellen und Gefäßzellen. Die Isolierung, Kultivierung und Erhaltung von Netzhautneuronen in vitro hat technische und biologische Einschränkungen. Die Kultivierung von Netzhautexplantaten kann diese Einschränkungen überwinden und bietet ein einzigartiges Ex-vivo-Modell , um den Austausch zwischen verschiedenen Netzhautzellen mit gut kontrollierten biochemischen Parametern und unabhängig vom Gefäßsystem zu untersuchen. Darüber hinaus sind Netzhautexplantate ein wirksames Screening-Instrument zur Untersuchung neuartiger pharmakologischer Interventionen bei verschiedenen retinalen vaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen wie der diabetischen Retinopathie. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolation und Kultur von Netzhautexplantaten über einen längeren Zeitraum. Das Manuskript weist auch einige der technischen Probleme während dieses Verfahrens auf, die die gewünschten Ergebnisse und die Reproduzierbarkeit der Netzhautexplantatkultur beeinträchtigen können. Die Immunfärbung der Netzhautgefäße, Gliazellen und Neuronen zeigte intakte Netzhautkapillaren und Neurogliazellen nach 2 Wochen nach Beginn der Netzhautexplantatkultur. Dies etabliert Netzhautexplantate als zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung von Veränderungen im retinalen Gefäßsystem und in den Neurogliazellen unter Bedingungen, die Netzhauterkrankungen wie diabetische Retinopathie nachahmen.

Einleitung

Verschiedene Modelle wurden vorgestellt, um Netzhauterkrankungen zu untersuchen, darunter sowohl in vivo als auch in vitro Modelle. Die Verwendung von Tieren in der Forschung ist immer noch Gegenstand ständiger ethischer und translationaler^{Debatten 1}. Tiermodelle mit Nagetieren wie Mäusen oder Ratten werden häufig in der Netzhautforschung ^{verwendet 2,3,4}. Klinische Bedenken sind jedoch aufgrund der unterschiedlichen physiologischen Funktionen der Netzhaut bei Nagetieren im Vergleich zum Menschen aufgetreten, wie z. B. das Fehlen der Makula oder Unterschiede im Farbsehen⁵. Die Verwendung menschlicher postmortaler Augen für die Netzhautforschung hat ebenfalls viele Probleme, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Unterschiede in den genetischen Hintergründen der Originalproben, der Krankengeschichte der Spender und der früheren Umgebung oder des Lebensstils der Spender⁶. Darüber hinaus hat die Verwendung von In-vitro-Modellen in der Netzhautforschung auch einige Nachteile. Zellkulturmodelle, die zur Untersuchung von Netzhauterkrankungen verwendet werden, umfassen die Verwendung von Zelllinien menschlichen Ursprungs, Primärzellen oder Stammzellen⁷. Die verwendeten Zellkulturmodelle haben nachweislich Probleme in Bezug auf Kontamination, Fehlidentifizierung oder Dedifferenzierung 8,9,10,11. In jüngster Zeit hat die retinale Organoid-Technologie signifikante Fortschritte gezeigt. Der Aufbau hochkomplexer Netzhäute in vitro hat jedoch mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel haben retinale Organoide nicht die gleichen physiologischen und biochemischen Eigenschaften wie reife in vivo Netzhäute. Um diese Einschränkung zu überwinden, muss die retinale Organoidtechnologie mehr biologische und zelluläre Merkmale integrieren, einschließlich glatter Muskelzellen, Gefäße und Immunzellen wie Mikroglia^12,13,14,15.

Organotypische Netzhautexplantate haben sich als zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung von Netzhauterkrankungen wie diabetischer Retinopathie und degenerativen Netzhauterkrankungen erwiesen^16,17,18,19. Im Vergleich zu anderen bestehenden Techniken unterstützt die Verwendung von Netzhautexplantaten sowohl in vitro retinale Zellkulturen als auch aktuelle in vivo Tiermodelle, indem ein einzigartiges Merkmal hinzugefügt wird, um das Cross-Talk zwischen verschiedenen Netzhautzellen unter den gleichen biochemischen Parametern und unabhängig von systemischen Variablen zu untersuchen. Die Explantatkulturen ermöglichen es, verschiedene Netzhautzellen in derselben Umgebung zusammen zu halten, was die Erhaltung retinaler interzellulärer Interaktionen ermöglicht^20,21,22. Darüber hinaus zeigte eine frühere Studie, dass Netzhautexplantate in der Lage waren, die morphologische Struktur und Funktionalität der kultivierten Netzhautzellen zu erhalten²³. Somit können Netzhautexplantate eine gute Plattform für die Untersuchung möglicher therapeutischer Ziele für eine Vielzahl von Netzhauterkrankungen^{bieten 24,25,26}. Retinale Explantatkulturen bieten eine kontrollierbare Technik und sind ein sehr flexibler Ersatz für bestehende Mothoden, die zahlreiche pharmakologische Manipulationen ermöglichen und mehrere molekulare Mechanismen aufdecken können²⁷.

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die retinale Explantattechnik als sinnvolles Zwischenmodellsystem zwischen in vitro Zellkulturen und in vivo Tiermodellen darzustellen. Diese Technik kann Netzhautfunktionen besser nachahmen als dissoziierte Zellen. Da verschiedene Netzhautschichten intakt bleiben, können die interzellulären Interaktionen der Netzhaut im Labor unter gut kontrollierten biochemischen Bedingungen und unabhängig von der Funktion des Gefäßsystems beurteilt werden²⁸.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Oakland University, Rochester, MI, USA genehmigt und folgten den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

1. Tierische Zubereitung

1. Halten Sie die Tiere unter konstanter Temperatur in einer lichtkontrollierten Umgebung. Die Temperatureinstellungen für den Tierstallraum sollten den Richtlinien des "Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren" entsprechen. Der Temperaturbereich für Mäuse liegt zwischen 18 °C und 26 °C. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit kontrolliert und auf etwa 42% eingestellt.
2. Verwenden Sie für dieses Experiment männliche C57BL / 6J-Mäuse (Details finden Sie in der Materialtabelle ), die älter als 12 Wochen sind (für dieses Protokoll wurde eine erwachsene Maus verwendet).
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde ein Wildtyp-Stamm für die Demonstration verwendet, da er keine genetischen Anomalien aufwies, die die Netzhaut betrafen. Man könnte jedoch andere Stämme, einschließlich genetisch manipulierter Stämme, für die Netzhautexplantatkultur verwenden.
3. Stellen Sie 12 h Hell-Dunkel-Zyklen über Lichtsteuerung in den Tierhaltungsräumen zur Verfügung.
4. Untersuchen Sie jedes Tier zweimal täglich während der Woche und einmal täglich am Wochenende auf Gesundheit und ausreichende Nahrungs- und Wasseraufnahme. Stellen Sie sicher, dass Sie sie mit frischem Essen und sauberem Wasser versorgen.
5. Wenn der Futter- und Wasserstand während der Woche niedrig ist, spülen Sie die Wasserflasche ab und füllen Sie sie wieder auf. Fügen Sie bei Bedarf frische Lebensmittel hinzu. Wechseln Sie verschmutzte Käfige täglich oder nach Bedarf für die Gesundheit der Tiere.
   HINWEIS: Um die Photorezeptoren und lichtinduzierten Veränderungen in der Netzhaut zu untersuchen, passen Sie die Mäuse über Nacht in einer speziellen dunklen Box in einem dunklen Raum in der Tiereinrichtung dunkel an.
6. Euthanasieren Sie die Tiere in ihrem Heimkäfig durch CO 2 Inhalationsüberdosis mit komprimiertem CO 2 -Gas in Flaschen, die an eine CO₂ -Kammer angeschlossen sind. Führen Sie die Sterbebestätigung mit einer sekundären Euthanasiemethode wie Zervixluxation durch.
7. Nach Abschluss des Verfahrens bestätigen Sie den Tiertod durch eine geeignete Methode, z. B. die Bestätigung eines Herz- und Atemstillstands oder die Beobachtung fester und erweiterter Pupillen des Tieres.

2. Gewebevorbereitung

1. Sobald das Tier eingeschläfert ist, reinigen Sie den Bereich mit 70% Ethanol. Öffnen Sie dann die Augenlider mit einer Hand, so dass das Auge sichtbar ist. Üben Sie mit der gegenüberliegenden Hand mit gebogenen Pinzetten Druck auf die oberen und unteren Teile der Umlaufbahn aus, bis der Globus hervorsteht.
2. Um das Auge zu enukleieren, schließen Sie vorsichtig die Pinzette am hinteren Teil des Auges und heben Sie sie in einer kontinuierlichen Bewegung an. Halten Sie den Augapfel mit einer Pinzette vom Sehnerv ab. Stellen Sie sicher, dass Sie sterilisierte Dissektionswerkzeuge für alle Schritte verwenden und unter vollständig aseptischen Bedingungen arbeiten.
3. Tauchen Sie jeden Augapfel in eine 1,5 ml Tube mit 1 ml eiskaltem HBSS mit Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml). Waschen Sie den Augapfel in HBSS zweimal für jeweils 5 Minuten.
4. Übertragen Sie den Augapfel in ein 1,5-2 ml Röhrchen, das komplette Medien enthält (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin und Streptomycin).

3. Gewebedissektion

1. Sezieren Sie die Netzhaut vorsichtig unter einem Operationsmikroskop, wie in Abbildung 1 nacheinander dargestellt.
   1. Machen Sie einen umlaufenden Schnitt um den Limbus, um den Augapfel zu öffnen. Entfernen Sie die Hornhaut, indem Sie kreisförmig entlang der Hornhautgrenze und des (limbalen) Einschnitts sezieren, gefolgt von der Entfernung des vorderen Segments, der Linse und des Glaskörpers, wobei eine leere Augenmuschel zurückbleibt.
   2. Indem Sie die Region des Sehnervenkopfes mit einer feinen Pinzette halten, ziehen Sie die äußere Augenschicht sanft ab. Achten Sie bei der Entfernung der äußeren Hülle sehr darauf, die Netzhaut der Neuralhaut nicht zu verletzen und sicherzustellen, dass die Netzhaut vollständig intakt bleibt.
      HINWEIS: Die Netzhaut muss vorsichtig vom retinalen Pigmentepithel (RPE) entfernt werden, und ein einziger Schnitt am Sehnervkopf muss durchgeführt werden, um die Netzhaut vom Sehnerv zu lösen. Stellen Sie dies visuell sicher, indem Sie das vom Sehnerv hinterlassene Loch (den Sehnervkopf) identifizieren.
   3. Zerlegen Sie die Netzhaut radial in vier gleich große Stücke.
2. Befolgen Sie die folgenden Schritte zur Handhabung der kleinen Teile der Netzhaut, um die richtige Ausrichtung der Netzhautkultur sicherzustellen.
   1. Öffnen Sie mit einer sezierenden Scherenklinge knapp unter dem Netzhautstück (Table of Materials).
   2. Heben Sie das Netzhautstück langsam mit der Spitze eines offenen Scherenblattes an und legen Sie es vorsichtig auf die Kulturplatte.
3. Übertragen Sie die aus der isolierten Netzhaut gewonnenen Explantate separat auf Zellkultureinsätze in einer 12-Well-Platte, die jeweils 300 μL retinale Explantatmedien enthalten, wobei die retinale Ganglienzelle (Neuroretina) nach oben zeigt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es sich bei den Medien um DMEM-Medien mit N2- und B27-Ergänzungen handelt. Fügen Sie auch Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) zu den Medien hinzu (Materialtabelle). Die Netzhaut besteht aus mehreren Schichten neuronaler Zellen, die über Synapsen miteinander verbunden sind und von außen durch die pigmentierte Schicht des retinalen Pigmentepithels gestützt werden, die die schwarze Schicht ist, die während der Dissektion entfernt wurde.
4. Entfernen Sie alle Reste des pigmentierten Epithels; Diese Überreste können jedoch helfen, die richtige Ausrichtung der Explantat zu identifizieren. Stellen Sie sicher, dass der pigmentierte Teil nach unten und der nicht pigmentierte Teil nach oben zeigt.
5. Inkubation der Netzhautexplantatkultur in befeuchteten Inkubatoren bei 37 °C und 5% CO₂.
6. Stellen Sie sicher, dass die Netzhautoberfläche nach oben zeigt. Wenn das Netzhautstück umgedreht oder gefaltet wird, versuchen Sie, es vorsichtig auf die richtige Ausrichtung einzustellen.
   HINWEIS: Achten Sie sehr auf die korrekte Ausrichtung der Netzhautexplantat in der Kulturplatte. Vermeiden Sie jegliches Umdrehen oder Falten der Explantat in der Kulturplatte, da dies zum Versagen des richtigen Wachstums der Netzhautzellen in Kultur führt.

4. Netzhautexplantatkultur

1. Die Netzhautexplantatkulturen (hergestellt in den Schritten 3.2-3.3) werden in befeuchteten Inkubatoren bei 37 °C und 5 %_CO2 gehalten.
2. Wechseln Sie die Hälfte der Medien von jedem Brunnen jeden zweiten Tag für 2 Wochen. Pipettieren Sie dazu vorsichtig 150 μL aus dem Brunnen. Dann fügen Sie 150 μL frisches Medium wieder in den Brunnen hinzu. Vermeiden Sie es, die Explantate beim Wechseln des Mediums umzudrehen.
3. Überprüfen Sie die Explantation sorgfältig unter dem Mikroskop, bevor Sie die Kulturplatte wieder in den Inkubator geben. Untersuchen Sie die Integrität der Zellen und die Netzhautarchitektur unter einem Hellfeldmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Explantat noch richtig ausgerichtet ist. Verwenden Sie sowohl die 4x- als auch die 20x-Objektivlinse, um die Explantat zu untersuchen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie das vollständige Eintauchen der Explantat in das Medium.

5. Immunhistochemie

1. Nach 2 Wochen fixieren Sie die Netzhautexplantat, indem Sie das Medium entfernen. Tun Sie dies, indem Sie zuerst einmal mit 200 μL 1x PBS waschen und dann 300 μL 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS, pH 7,4, in die Vertiefung geben, die die Explantat enthält, und sie über Nacht stehen lassen.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, ohne die Kultureinsätze von der Platte zu entfernen. Die Explantate können auch in ein 500 μL konisches Röhrchen überführt werden, und das Waschen und Fixieren kann im Inneren des Röhrchens erfolgen.
2. Die Explantat wird zum Waschen in ein 500 μL konisches Röhrchen mit 300 μL 1x PBS-2,5% Triton X überführt.
3. Waschen Sie die festen Explantate dreimal für jeweils 5 min mit mittlerer Geschwindigkeit auf einem Shaker (25 U/min) in der Tube.
4. Blockieren Sie die erwarteten unspezifischen Reaktionen, indem Sie die Explantat mit 300 μL 1x blockierendem Puffer mit 0,02% Thimerosal für 1 h bei Raumtemperatur vor der Antikörperinkubation inkubieren.
5. Die fixierten Explantate mit den primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C mit mittlerer Geschwindigkeit auf einem Shaker inkubieren.
   HINWEIS: Nachweis der retinalen Endothelzellen in der fixierten Explantat durch Färbung mit GSL I, BSL I Antikörper (Lektin) (7:1.000). Nachweis der Gliazellen in den Netzhautexplantaten durch Färbung mit Kaninchen-Gliafibrillär-saurem Protein (GFAP) Antikörper (1:250). Detektieren Sie die retinalen Neuronen, indem Sie die Explantat mit Kaninchen-NeuN-Antikörper färben (1:250)^29,30. Inkubieren Sie s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explantiert mit dem Lektin, NeuN-Kombination, und inkubieren Sie andere mit dem Lektin, GFAP-Kombination.
6. Am nächsten Tag entfernen Sie den primären Antikörper aus den Röhrchen durch Aspiration mit einer Pipette. Waschen Sie die Explantate mit 1x PBS-2,5% Triton X dreimal für jeweils 5 min mit mittlerer Geschwindigkeit auf einem Shaker.
7. Fügen Sie die sekundären Antikörper hinzu: Goat Anti-Rabbit IgG (1:500) (sekundär für GFAP und NeuN) und Texas Red (7:1.000) (für das Lektin). 1 h bei Raumtemperatur mit mittlerer Geschwindigkeit auf einem Schüttler inkubieren.
   HINWEIS: Die sekundären Antikörper sind lichtempfindlich, also bedecken Sie die Röhre mit Aluminiumfolie.
8. Entfernen Sie die sekundären Antikörper durch Aspiration und waschen Sie dann dreimal für jeweils 5 min mit 1x PBS-2,5% Triton X.
9. Das Explantat aus dem Röhrchen mit einer Transferpipette auf einen Glasobjektträger überführen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf dem Objektträger, und fügen Sie dann einen Tropfen Montagemedien mit DAPI zum Objektträger hinzu.
10. Bedecken Sie das Gewebe mit einem Deckglas. Lassen Sie keine Luftblasen zwischen dem Deckglas und dem Gewebe zu.
11. Bringen Sie die gefärbten Objektträger zum Fluoreszenzmikroskop und beginnen Sie mit der Aufnahme der Bilder. Es ist wichtig, die gefärbten Objektträger mit einer Objektträgerbox abzudecken, da die Fluoreszenzfärbung lichtempfindlich ist.

Ergebnisse

Überleben der neuronalen und vaskulären Netzhautzellen der Netzhautexplantat in Kulturmedien ex vivo über einen längeren Zeitraum
Durch die Kultivierung einer Netzhautexplantat unter Verwendung unseres Protokolls gelang es uns, verschiedene Netzhautzellen zu erhalten, die bis zu 2 Wochen lebensfähig waren. Um das Vorhandensein verschiedener Netzhautzellen nachzuweisen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung der Netzhautexplantat mit einem neuronalen Zellmar...

Diskussion

Unser Labor untersucht seit^{Jahren die} pathophysiologischen Veränderungen, die die retinale mikrovaskuläre Dysfunktion fördern, 31,32,33,34,35,36. Netzhautexplantate sind eine der Techniken, die als Modell für die Untersuchung von Netzhauterkrankungen wie diabetischer Retinopathie oder degenerativen Netzhauterkrankungen vo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407