Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Resumo

Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.

Resumo

Um dos desafios na pesquisa da retina é estudar a conversa cruzada entre diferentes células da retina, como neurônios da retina, células gliais e células vasculares. Isolar, cultivar e sustentar neurônios da retina in vitro têm limitações técnicas e biológicas. A cultura de explantes de retina pode superar essas limitações e oferecer um modelo ex vivo único para estudar o cross-talk entre várias células da retina com parâmetros bioquímicos bem controlados e independentes do sistema vascular. Além disso, os explantes da retina são uma ferramenta de triagem eficaz para o estudo de novas intervenções farmacológicas em várias doenças vasculares e neurodegenerativas da retina, como a retinopatia diabética. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolamento e cultura de explantes da retina por um período prolongado. O manuscrito também apresenta alguns dos problemas técnicos durante este procedimento que podem afetar os resultados desejados e a reprodutibilidade da cultura de explante retinal. A imunocoloração dos vasos da retina, células gliais e neurônios demonstrou capilares da retina intactos e células neurogliais após 2 semanas do início da cultura do explante da retina. Isso estabelece explantes de retina como uma ferramenta confiável para estudar mudanças na vasculatura da retina e células neurogliais sob condições que imitam doenças da retina, como a retinopatia diabética.

Introdução

Diferentes modelos foram apresentados para estudar doenças da retina, incluindo modelos in vivo e in vitro. O uso de animais em pesquisa ainda é uma questão de contínuo debate ético e translacional¹. Modelos animais envolvendo roedores, como camundongos ou ratos, são comumente utilizados em pesquisas sobre retina ^2,3,4. No entanto, preocupações clínicas têm surgido devido às diferentes funções fisiológicas da retina em roedores em comparação com humanos, como a ausência de mácula ou diferenças na visão de cores⁵. O uso de olhos post-mortem humanos para pesquisa da retina também tem muitos problemas, incluindo, entre outros, diferenças nos antecedentes genéticos das amostras originais, no histórico médico dos doadores e nos ambientes ou estilos de vida anteriores dos doadores⁶. Além disso, o uso de modelos in vitro na pesquisa da retina também tem algumas desvantagens. Os modelos de cultura celular utilizados para estudar doenças da retina incluem a utilização de linhagens celulares de origem humana, células primárias ou células-tronco⁷. Os modelos de cultura celular utilizados têm demonstrado problemas em termos de contaminação, identificação incorreta ou desdiferenciação 8,9,10,11. Recentemente, a tecnologia organoide da retina mostrou um progresso significativo. No entanto, a construção de retinas altamente complexas in vitro tem várias limitações. Por exemplo, os organoides da retina não têm as mesmas características fisiológicas e bioquímicas que as retinas maduras in vivo. Para superar essa limitação, a tecnologia organoide da retina deve integrar mais características biológicas e celulares, incluindo células musculares lisas, vasculatura e células imunes como a micróglia^12,13,14,15.

Os explantes organotípicos da retina têm emergido como uma ferramenta confiável para o estudo de doenças da retina, como a retinopatia diabética e as doenças degenerativas da retina^16,17,18,19. Em comparação com outras técnicas existentes, o uso de explantes de retina suporta tanto culturas de células da retina in vitro quanto modelos animais in vivo atuais, adicionando uma característica única para estudar o cross-talk entre várias células da retina sob os mesmos parâmetros bioquímicos e independentes de variáveis sistêmicas. As culturas de explante permitem que diferentes células da retina sejam mantidas juntas no mesmo ambiente, permitindo a preservação das interações intercelulares da retina^20,21,22. Além disso, um estudo anterior mostrou que os explantes da retina foram capazes de preservar a estrutura morfológica e a funcionalidade das células da retina cultivadas²³. Assim, os explantes de retina podem fornecer uma plataforma decente para a investigação de possíveis alvos terapêuticos para uma ampla variedade de doenças da retina^24,25,26. As culturas de explante retiniano fornecem uma técnica controlável e são substitutas muito flexíveis dos mothods existentes que permitem inúmeras manipulações farmacológicas e podem descobrir vários mecanismos moleculares²⁷.

O objetivo geral deste trabalho é apresentar a técnica de explante retiniano como um sistema de modelo intermediário razoável entre culturas de células in vitro e modelos animais in vivo. Esta técnica pode imitar as funções da retina de uma maneira melhor do que as células dissociadas. Como várias camadas retinianas permanecem intactas, as interações intercelulares da retina podem ser avaliadas em laboratório sob condições bioquímicas bem controladas e independentes do funcionamento do sistema vascular²⁸.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Oakland University, Rochester, MI, EUA e seguiram as diretrizes estabelecidas pela Declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual.

1. Preparação animal

1. Mantenha os animais alojados sob uma temperatura constante em um ambiente controlado pela luz. As configurações de temperatura para a sala de alojamento de animais devem seguir as diretrizes estabelecidas pelo "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório". A faixa de temperatura para camundongos está entre 18 °C e 26 °C. Mantenha os níveis de umidade controlados e definidos em cerca de 42%.
2. Para este experimento, use camundongos machos C57BL/6J (verifique a Tabela de Materiais para obter detalhes) com mais de 12 semanas de idade (um camundongo adulto foi usado para este protocolo).
   NOTA: Uma cepa do tipo selvagem foi utilizada neste protocolo para a demonstração, pois não apresentava nenhuma anormalidade genética que afetasse a retina. No entanto, pode-se usar outras cepas, incluindo cepas geneticamente manipuladas, para a cultura do explante da retina.
3. Forneça ciclos de luz / escuridão de 12 horas através do controle de iluminação nas salas de alojamento de animais.
4. Inspecione todos os animais quanto à saúde e ingestão adequada de alimentos e água duas vezes por dia durante a semana e uma vez por dia nos fins de semana. Certifique-se de fornecer-lhes alimentos frescos e água limpa.
5. Se os níveis de comida e água estiverem baixos durante a semana, lave a garrafa de água e recarregue-a. Adicione alimentos frescos sempre que necessário. Troque as gaiolas sujas diariamente ou conforme necessário para a saúde dos animais.
   NOTA: Para estudar os fotorreceptores e as alterações induzidas pela luz na retina, adapte os ratos durante a noite em uma caixa escura especial localizada em uma sala escura na instalação animal.
6. Eutanasiar os animais em sua gaiola doméstica por overdose de inalação de CO 2 usando gás CO 2 comprimido em cilindros conectados a uma câmara de CO₂. Realizar a confirmação da morte usando um método secundário de eutanásia, como luxação cervical.
7. Após a conclusão do procedimento, confirme a morte do animal por um método apropriado, como confirmar a parada cardíaca e respiratória ou observar pupilas fixas e dilatadas do animal.

2. Preparação de tecidos

1. Uma vez que o animal é sacrificado, limpe a área com etanol a 70%. Em seguida, abra as pálpebras com uma mão para que o olho fique visível. Aplique pressão nas partes superior e inferior da órbita com a mão oposta usando pinças curvas até que o globo se projete.
2. Para enuclear o olho, feche suavemente a pinça na porção posterior do olho e eleve em um movimento contínuo. Usando fórceps, segure o globo ocular do nervo óptico. Certifique-se de usar ferramentas de dissecação esterilizadas para todas as etapas e trabalhar sob condições assépticas completas.
3. Mergulhe cada globo ocular em um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de HBSS gelado com penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Lave o globo ocular em HBSS duas vezes por 5 minutos cada.
4. Transfira o globo ocular para um tubo de 1,5-2 mL contendo meios completos (10% FBS, 2% B27, 1% N2, 1% L-glutamina e 1% penicilina e estreptomicina).

3. Dissecção tecidual

1. Dissecar a retina cuidadosamente sob um microscópio cirúrgico, conforme ilustrado sequencialmente na Figura 1.
   1. Faça uma incisão circunferencial ao redor do limbo para abrir o globo ocular. Remova a córnea dissecando circularmente ao longo da borda da córnea e da incisão (límbica), seguido da remoção do segmento anterior, lente e corpo vítreo, deixando um copo ocular vazio.
   2. Ao segurar a região da cabeça do nervo óptico com pinça fina, retire a camada externa do olho suavemente. Preste muita atenção durante a remoção do revestimento externo, a fim de não ferir a retina neural e garantir que a retina permaneça totalmente intacta.
      NOTA: A retina deve ser cuidadosamente descascada do epitélio pigmentar da retina (EPR), e um único corte na cabeça do nervo óptico deve ser realizado para descolar a retina do nervo óptico. Assegure-se visualmente identificando o orifício deixado pelo nervo óptico (a cabeça do nervo óptico).
   3. Dissecar a retina radialmente em quatro pedaços de tamanho igual.
2. Siga os passos abaixo para manusear os pequenos pedaços da retina para garantir a orientação adequada da cultura da retina.
   1. Usando uma lâmina de tesoura dissecante, abra logo abaixo da peça da retina (Tabela de Materiais).
   2. Levante lentamente a peça da retina com a ponta de uma lâmina de tesoura aberta e transfira-a suavemente para a placa de cultura.
3. Transfira os explantes derivados da retina isolada separadamente para inserções de cultura celular em uma placa de 12 poços, cada uma contendo 300 μL de meio de explante da retina, com o lado da célula ganglionar da retina (neurorretina) voltado para cima.
   Observação : Certifique-se de que a mídia é mídia DMEM com suplementos N2 e B27. Adicione penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) ao meio também (Tabela de Materiais). A retina é formada por múltiplas camadas de células neuronais interligadas através de sinapses e suportadas do lado de fora pela camada pigmentada do epitélio pigmentar da retina, que é a camada preta que foi removida durante a dissecção.
4. Remova quaisquer restos do epitélio pigmentado; no entanto, esses remanescentes podem ajudar a identificar a orientação adequada do explante. Certifique-se de que a parte pigmentada está voltada para baixo e que a parte não pigmentada está voltada para cima.
5. Incubar a cultura de explante retiniano em incubadoras umidificadas a 37 °C e 5% de CO₂.
6. Certifique-se de que a superfície da retina está voltada para cima. Se a peça da retina estiver virada ou dobrada, tente ajustá-la suavemente à orientação correta.
   NOTA: Preste muita atenção à orientação correta do explante da retina na placa de cultura. Evite qualquer inversão ou dobramento do explante na placa de cultura, pois isso resultará em falha do crescimento adequado das células da retina em cultura.

4. Cultura de explante retiniano

1. Manter as culturas de explante retiniano (preparadas nas etapas 3.2-3.3) em incubadoras umidificadas a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Troque metade da mídia de cada poço a cada dois dias durante 2 semanas. Faça isso pipetando 150 μL do poço com cuidado. Em seguida, adicione 150 μL de mídia fresca de volta ao poço. Evite virar o explante ao trocar a mídia.
3. Verifique o explante cuidadosamente sob o microscópio antes de colocar a placa de cultura de volta na incubadora. Examine a integridade das células e a arquitetura da retina sob um microscópio de campo brilhante. Certifique-se de que o explante ainda está orientado corretamente. Use as lentes objetivas de 4x e 20x para examinar o explante.
   NOTA: Evite a imersão completa do explante no meio.

5. Imuno-histoquímica

1. Após 2 semanas, corrija o explante da retina removendo o meio. Faça isso lavando primeiro uma vez com 200 μL de 1x PBS e, em seguida, adicionando 300 μL de paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M, pH 7,4, ao poço que contém o explante e deixando-o durante a noite.
   NOTA: Esta etapa pode ser feita sem remover as inserções de cultura da placa. Os explantes também podem ser transferidos para um tubo cônico de 500 μL, e a lavagem e fixação podem ser feitas dentro do tubo.
2. Transfira o explante para um tubo cônico de 500 μL contendo 300 μL de 1x PBS-2,5% Triton X para lavagem.
3. Lave os explantes fixos no tubo três vezes durante 5 minutos cada utilizando velocidade média num agitador (25 rpm).
4. Bloquear as reações inespecíficas esperadas incubando o explante com 300 μL de tampão bloqueador 1x contendo timerosal a 0,02% por 1 h à temperatura ambiente antes da incubação do anticorpo.
5. Incubar os explantes fixos com os anticorpos primários durante a noite a 4 °C utilizando velocidade média num agitador.
   NOTA: Detectar as células endoteliais da retina no explante fixo por coloração com o anticorpo GSL I, BSL I (lectina) (7:1.000). Detectar as células gliais nos explantes da retina por coloração com anticorpo de proteína ácida fibrilar glial de coelho (GFAP) (1:250). Detectar os neurônios da retina corando o explante com o anticorpo NeuN do coelho (1:250)^29,30. Incubate s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explanta com a lectina, combinação NeuN, e incubar outros com a lectina, combinação GFAP.
6. No dia seguinte, remova o anticorpo primário dos tubos por aspiração com uma pipeta. Lave os explantes com 1x PBS-2,5% Triton X três vezes por 5 min cada usando velocidade média em um agitador.
7. Adicione os anticorpos secundários: Goat anti-Rabbit IgG (1:500) (secundário para GFAP e NeuN) e Texas Red (7:1.000) (para a lectina). Incubar durante 1 h à temperatura ambiente utilizando velocidade média num agitador.
   NOTA: Os anticorpos secundários são sensíveis à luz, por isso cubra o tubo com papel alumínio.
8. Remova os anticorpos secundários por aspiração e, em seguida, lave três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS-2,5% Triton X.
9. Transfira o explante do tubo para uma lâmina de vidro usando uma pipeta de transferência. Remova qualquer excesso de líquido no slide e adicione uma gota de mídia de montagem com DAPI ao slide.
10. Cubra o tecido com uma tampa. Não permita bolhas de ar entre a tampa e o tecido.
11. Leve as lâminas coradas para o microscópio de fluorescência e comece a tirar as imagens. É importante cobrir as lâminas coradas usando uma caixa de deslizamento, pois a coloração por fluorescência é sensível à luz.

Resultados

Sobrevivência das células neuronais e vasculares da retina do explante retiniano em meio de cultura ex vivo por um tempo prolongado
Ao cultivar um explante de retina utilizando nosso protocolo, fomos bem-sucedidos em manter diferentes células da retina que eram viáveis por até 2 semanas. Para verificar a presença de diferentes células da retina, foi realizada coloração por imunofluorescência do explante retiniano utilizando um marcador de células n...

Discussão

Nosso laboratório vem estudando as alterações fisiopatológicas que promovem a disfunção microvascular da retina há anos 31,32,33,34,35,36. Os explantes de retina são uma das técnicas que podem ser de grande valia para o estudo de doenças da retina, como a retinopatia diabética ou doenças degenerativas da retina. T...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407