Explant rétinien de la rétine de souris adulte comme modèle ex vivo pour l’étude des maladies neurovasculaires rétiniennes

Résumé

Ce protocole présente et décrit les étapes pour l’isolement, la dissection, la culture et la coloration des explants rétiniens obtenus à partir d’une souris adulte. Cette méthode est bénéfique comme modèle ex vivo pour étudier différentes maladies neurovasculaires rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique.

Résumé

L’un des défis de la recherche sur la rétine est d’étudier la diaphonie entre différentes cellules rétiniennes telles que les neurones rétiniens, les cellules gliales et les cellules vasculaires. L’isolement, la culture et le maintien des neurones rétiniens in vitro ont des limites techniques et biologiques. La culture d’explants rétiniens peut surmonter ces limitations et offrir un modèle ex vivo unique pour étudier la diaphonie entre diverses cellules rétiniennes avec des paramètres biochimiques bien contrôlés et indépendants du système vasculaire. De plus, les explants rétiniens sont un outil de dépistage efficace pour étudier de nouvelles interventions pharmacologiques dans diverses maladies vasculaires et neurodégénératives rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des explants rétiniens pendant une période prolongée. Le manuscrit présente également certains des problèmes techniques au cours de cette procédure qui peuvent affecter les résultats souhaités et la reproductibilité de la culture d’explant rétinien. L’immunomarquage des vaisseaux rétiniens, des cellules gliales et des neurones a démontré des capillaires rétiniens et des cellules neurogliales intacts après 2 semaines à compter du début de la culture d’explantation rétinienne. Cela établit les explants rétiniens comme un outil fiable pour étudier les changements dans le système vasculaire rétinien et les cellules neurogliales dans des conditions qui imitent les maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique.

Introduction

Différents modèles ont été présentés pour étudier les maladies de la rétine, y compris des modèles in vivo et in vitro. L’utilisation des animaux dans la recherche fait encore l’objet d’un débat éthique et translationnel^{continu 1}. Les modèles animaux impliquant des rongeurs tels que les souris ou les rats sont couramment utilisés dans la recherche rétinienne ^2,3,4. Cependant, des préoccupations cliniques sont apparues en raison des différentes fonctions physiologiques de la rétine chez les rongeurs par rapport aux humains, telles que l’absence de la macula ou les différences de vision des couleurs⁵. L’utilisation d’yeux post-mortem humains pour la recherche rétinienne présente également de nombreux problèmes, y compris, mais sans s’y limiter, des différences dans les antécédents génétiques des échantillons originaux, les antécédents médicaux des donneurs et les environnements ou modes de vie antérieurs des donneurs⁶. En outre, l’utilisation de modèles in vitro dans la recherche rétinienne présente également certains inconvénients. Les modèles de culture cellulaire utilisés pour étudier les maladies de la rétine comprennent l’utilisation de lignées cellulaires d’origine humaine, de cellules primaires ou de cellules souches⁷. Il a été démontré que les modèles de culture cellulaire utilisés ont des problèmes en termes de contamination, d’identification erronée ou de dédifférenciation 8,9,10,11. Récemment, la technologie organoïde rétinienne a montré des progrès significatifs. Cependant, la construction de rétines très complexes in vitro présente plusieurs limites. Par exemple, les organoïdes rétiniens n’ont pas les mêmes caractéristiques physiologiques et biochimiques que les rétines in vivo matures. Pour surmonter cette limitation, la technologie organoïde rétinienne doit intégrer davantage de caractéristiques biologiques et cellulaires, y compris les cellules musculaires lisses, le système vasculaire et les cellules immunitaires comme la microglie ^12,13,14,15.

Les explants organotypiques de la rétine sont apparus comme un outil fiable pour étudier les maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique et les maladies dégénératives de la rétine^16,17,18,19. Par rapport à d’autres techniques existantes, l’utilisation d’explants rétiniens soutient à la fois les cultures cellulaires rétiniennes in vitro et les modèles animaux in vivo actuels en ajoutant une caractéristique unique pour étudier la diaphonie entre diverses cellules rétiniennes sous les mêmes paramètres biochimiques et indépendamment des variables systémiques. Les cultures d’explantation permettent de maintenir différentes cellules rétiniennes ensemble dans le même environnement, permettant la préservation des interactions intercellulaires rétiniennes^20,21,22. De plus, une étude antérieure a montré que les explants rétiniens étaient capables de préserver la structure morphologique et la fonctionnalité des cellules rétiniennes en culture²³. Ainsi, les explants rétiniens peuvent fournir une plate-forme décente pour étudier des cibles thérapeutiques possibles pour une grande variété de maladies rétiniennes^24,25,26. Les cultures d’explants rétiniens fournissent une technique contrôlable et sont un substitut très flexible aux motos existantes qui permettent de nombreuses manipulations pharmacologiques et peuvent découvrir plusieurs mécanismes moléculaires²⁷.

L’objectif global de cet article est de présenter la technique de l’explant rétinien comme un système de modèle intermédiaire raisonnable entre les cultures cellulaires in vitro et les modèles animaux in vivo . Cette technique peut imiter les fonctions rétiniennes d’une meilleure manière que les cellules dissociées. Comme diverses couches rétiniennes restent intactes, les interactions intercellulaires rétiniennes peuvent être évaluées en laboratoire dans des conditions biochimiques bien contrôlées et indépendamment du fonctionnement du système vasculaire²⁸.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université d’Oakland, Rochester, MI, États-Unis et ont suivi les lignes directrices établies par la Déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Préparation des animaux

1. Gardez les animaux logés sous une température constante dans un environnement contrôlé par la lumière. Les réglages de température pour la salle de logement des animaux doivent suivre les directives énoncées dans le « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ». La plage de température pour les souris est comprise entre 18 °C et 26 °C. Gardez les niveaux d’humidité contrôlés et réglés à environ 42%.
2. Pour cette expérience, utilisez des souris mâles C57BL / 6J (consultez le tableau des matériaux pour plus de détails) âgées de plus de 12 semaines (une souris adulte a été utilisée pour ce protocole).
   REMARQUE: Une souche de type sauvage a été utilisée dans ce protocole pour la démonstration, car elle ne présentait aucune anomalie génétique affectant la rétine. Cependant, on pourrait utiliser d’autres souches, y compris des souches génétiquement manipulées, pour la culture d’explantation rétinienne.
3. Fournir des cycles lumière/obscurité de 12 h via le contrôle de l’éclairage dans les salles de logement des animaux.
4. Inspectez chaque animal pour vérifier sa santé et sa consommation adéquate de nourriture et d’eau deux fois par jour pendant la semaine et une fois par jour le week-end. Assurez-vous de leur fournir des aliments frais et de l’eau propre.
5. Si les niveaux de nourriture et d’eau sont bas pendant la semaine, rincez la bouteille d’eau et remplissez-la. Ajoutez des aliments frais chaque fois que nécessaire. Changez les cages souillées tous les jours ou au besoin pour la santé des animaux.
   REMARQUE: Pour étudier les photorécepteurs et les changements induits par la lumière dans la rétine, adaptez les souris à l’obscurité pendant la nuit dans une boîte sombre spéciale située dans une pièce sombre de l’animalerie.
6. Euthanasier les animaux dans leur cage domestique par surdose de CO 2 par inhalation en utilisant du gaz CO 2 comprimé dans des bouteilles reliées à une chambre de CO₂. Procéder à la confirmation du décès à l’aide d’une méthode secondaire d’euthanasie telle que la luxation cervicale.
7. Après avoir terminé la procédure, confirmer la mort de l’animal par une méthode appropriée, telle que la confirmation de l’arrêt cardiaque et respiratoire ou l’observation des pupilles fixes et dilatées de l’animal.

2. Préparation des tissus

1. Une fois l’animal euthanasié, nettoyez la zone avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, ouvrez les paupières d’une main pour que l’œil soit visible. Appliquez une pression sur les parties supérieure et inférieure de l’orbite avec la main opposée à l’aide de pinces incurvées jusqu’à ce que le globe fasse saillie.
2. Pour énucléer l’œil, fermez doucement la pince sur la partie postérieure de l’œil et élevez-la dans un mouvement continu. À l’aide d’une pince, tenez le globe oculaire du nerf optique. Assurez-vous d’utiliser des outils de dissection stérilisés pour toutes les étapes et de travailler dans des conditions aseptiques complètes.
3. Plongez chaque globe oculaire dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL d’HBSS glacé avec de la pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL). Lavez le globe oculaire dans HBSS deux fois pendant 5 minutes chacun.
4. Transférer le globe oculaire dans un tube de 1,5 à 2 mL contenant un milieu complet (10 % FBS, 2 % B27, 1 % N2, 1 % L-glutamine et 1 % pénicilline et streptomycine).

3. Dissection tissulaire

1. Disséquez soigneusement la rétine sous un microscope opératoire, comme illustré séquentiellement à la figure 1.
   1. Faites une incision circonférentielle autour du limbe pour ouvrir le globe oculaire. Retirez la cornée en disséquant circulairement le long du bord de la cornée et de l’incision (limbique), puis en enlevant le segment antérieur, le cristallin et le corps vitré, en laissant une coupelle oculaire vide.
   2. En tenant la région de la tête du nerf optique avec une fine pince, décollez doucement la couche externe de l’œil. Portez une grande attention lors de l’enlèvement de la couche externe afin de ne pas blesser la rétine neurale et de vous assurer que la rétine reste totalement intacte.
      REMARQUE: La rétine doit être soigneusement décollée de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), et une seule incision à la tête du nerf optique doit être effectuée pour détacher la rétine du nerf optique. Assurez-vous visuellement en identifiant le trou laissé par le nerf optique (la tête du nerf optique).
   3. Disséquez la rétine radialement en quatre morceaux de taille égale.
2. Suivez les étapes ci-dessous pour manipuler les petits morceaux de la rétine afin d’assurer une orientation appropriée de la culture rétinienne.
   1. À l’aide d’une lame de ciseaux disséquante, ouvrir juste en dessous de la pièce rétinienne (Table of Materials).
   2. Soulevez lentement la pièce rétinienne avec la pointe d’une lame de ciseaux ouverte et transférez-la doucement sur la plaque de culture.
3. Transférer les explants dérivés de la rétine isolée séparément sur des inserts de culture cellulaire dans une plaque de 12 puits, chacun contenant 300 μL de milieux d’explantation rétiniens, avec le côté des cellules ganglionnaires de la rétine (neurorétine) tourné vers le haut.
   REMARQUE: Assurez-vous que le support est DMEM avec des suppléments N2 et B27. Ajouter également de la pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) au milieu (tableau des matières). La rétine est formée de plusieurs couches de cellules neuronales interconnectées par des synapses et soutenues de l’extérieur par la couche pigmentée de l’épithélium pigmentaire rétinien, qui est la couche noire qui a été enlevée lors de la dissection.
4. Enlevez tous les restes de l’épithélium pigmenté; Cependant, ces restes peuvent aider à identifier l’orientation appropriée de l’explant. Assurez-vous que la partie pigmentée est orientée vers le bas et que la partie non pigmentée est orientée vers le haut.
5. Incuber la culture d’explantation rétinienne dans des incubateurs humidifiés à 37 °C et 5% de CO₂.
6. Assurez-vous que la surface rétinienne est orientée vers le haut. Si la pièce rétinienne est retournée ou pliée, essayez de l’ajuster doucement à la bonne orientation.
   REMARQUE: Portez une grande attention à l’orientation correcte de l’explant rétinien dans la plaque de culture. Évitez tout retournement ou repliement de l’explant dans la plaque de culture, car cela entraînerait une défaillance de la croissance correcte des cellules rétiniennes en culture.

4. Culture d’explantation rétinienne

1. Maintenir les cultures d’explants rétiniens (préparées aux étapes 3.2-3.3) dans des incubateurs humidifiés à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Changez la moitié du média de chaque puits tous les deux jours pendant 2 semaines. Pour ce faire, pipetez soigneusement 150 μL du puits. Ensuite, ajoutez 150 μL de fluide frais dans le puits. Évitez de retourner l’explant lors du changement de support.
3. Vérifiez soigneusement l’explant au microscope avant de remettre la plaque de culture dans l’incubateur. Examiner l’intégrité des cellules et l’architecture rétinienne au microscope à fond clair. Assurez-vous que l’explant est toujours orienté correctement. Utilisez les objectifs 4x et 20x pour examiner l’explant.
   REMARQUE: Évitez l’immersion complète de l’explant dans le média.

5. Immunohistochimie

1. Après 2 semaines, fixez l’explant rétinien en retirant le média. Pour ce faire, lavez d’abord une fois avec 200 μL de 1x PBS, puis ajoutez 300 μL de paraformaldéhyde à 4% dans 0,1 M PBS, pH 7,4, au puits contenant l’explant et laissez-le toute la nuit.
   REMARQUE: Cette étape peut être effectuée sans retirer les inserts de culture de la plaque. Les explants peuvent également être transférés dans un tube conique de 500 μL, et le lavage et la fixation peuvent être effectués à l’intérieur du tube.
2. Transférer l’explant dans un tube conique de 500 μL contenant 300 μL de 1x PBS-2,5% Triton X pour le lavage.
3. Laver les explants fixes dans le tube trois fois pendant 5 minutes chacun en utilisant une vitesse moyenne sur un agitateur (25 tr / min).
4. Bloquer les réactions non spécifiques attendues en incubant l’explant avec 300 μL de tampon de blocage 1x contenant 0,02% de thimérosal pendant 1 h à température ambiante avant l’incubation de l’anticorps.
5. Incuber les explants fixes avec les anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C en utilisant une vitesse moyenne sur un agitateur.
   REMARQUE : Détecter les cellules endothéliales rétiniennes dans l’explant fixe en les colorant avec des anticorps GSL I, BSL I (lectine) (7:1 000). Détecter les cellules gliales dans les explants rétiniens en les colorant avec un anticorps de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) de lapin (1:250). Détecter les neurones rétiniens en colorant l’explant avec l’anticorps NeuN de lapin (1:250)^29,30. Incuber s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explants avec la lectine, NeuN combinaison, et en incuber d’autres avec la lectine, combinaison GFAP.
6. Le lendemain, retirez l’anticorps primaire des tubes par aspiration à l’aide d’une pipette. Lavez les explants avec 1x PBS-2,5% Triton X trois fois pendant 5 minutes chacun en utilisant une vitesse moyenne sur un agitateur.
7. Ajouter les anticorps secondaires : IgG anti-lapin de chèvre (1:500) (secondaire pour GFAP et NeuN) et Texas Red (7:1 000) (pour la lectine). Incuber pendant 1 h à température ambiante à vitesse moyenne sur un agitateur.
   REMARQUE: Les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière, alors couvrez le tube avec du papier d’aluminium.
8. Retirez les anticorps secondaires par aspiration, puis lavez trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1x PBS-2,5% Triton X.
9. Transférer l’explant du tube sur une lame de verre à l’aide d’une pipette de transfert. Retirez tout excès de liquide sur la lame, puis ajoutez une goutte de support de montage avec DAPI à la lame.
10. Couvrez le mouchoir avec un couvercle. Ne laissez pas de bulles d’air entre la lamelle de couverture et le mouchoir.
11. Prenez les lames colorées au microscope à fluorescence et commencez à prendre les images. Il est important de couvrir les lames colorées à l’aide d’une boîte à diapositives car la coloration par fluorescence est sensible à la lumière.

Résultats

Survie des cellules rétiniennes neuronales et vasculaires de l’explant rétinien dans des milieux de culture ex vivo pendant une période prolongée
En cultivant un explant rétinien en utilisant notre protocole, nous avons réussi à maintenir différentes cellules rétiniennes viables jusqu’à 2 semaines. Pour vérifier la présence de différentes cellules rétiniennes, une coloration par immunofluorescence de l’explant rétinien à l’aide d’un ...

Discussion

Notre laboratoire étudie les changements physiopathologiques qui favorisent le dysfonctionnement microvasculaire rétinien depuis les années 31,32,33,34,35,36. Les explants rétiniens sont l’une des techniques qui peuvent être d’une grande valeur à utiliser comme modèle pour étudier les maladies rétiniennes telles ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407