Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Resumen

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Resumen

Los medicamentos quimioterapéuticos pueden inducir daños irreparables en el ADN en las células cancerosas, lo que lleva a la apoptosis o senescencia prematura. A diferencia de la muerte celular apoptótica, la senescencia es una maquinaria fundamentalmente diferente que restringe la propagación de las células cancerosas. Décadas de estudios científicos han revelado los complejos efectos patológicos de las células cancerosas senescentes en tumores y microambientes que modulan las células cancerosas y las células estromales. La nueva evidencia sugiere que la senescencia es un potente factor pronóstico durante el tratamiento del cáncer y, por lo tanto, la detección rápida y precisa de las células senescentes en muestras de cáncer es esencial. Este artículo presenta un método para visualizar y detectar la senescencia inducida por la terapia (TIS) en las células cancerosas. Las líneas celulares de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) se trataron con mafosfamida (MAF) o daunorrubicina (DN) y se examinaron para detectar el marcador de senescencia, la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal), el marcador de síntesis de ADN 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y el marcador gamma-H2AX de daño al ADN (γH2AX). Las imágenes del citómetro de flujo pueden ayudar a generar imágenes unicelulares de alta resolución en un corto período de tiempo para visualizar y cuantificar simultáneamente los tres marcadores en las células cancerosas.

Introducción

Una variedad de estímulos puede desencadenar la senescencia celular, haciendo que las células entren en un estado de detención estable del ciclo celular. Estos estímulos incluyen cambios intrínsecos de señalización o tensiones extrínsecas. Las señales intrínsecas incluyen acortamiento progresivo de los telómeros, cambios en la estructura de los telómeros, modificación epigenética, trastornos de proteostasis, disfunción mitocondrial y activación de oncogenes. Las tensiones extrínsecas incluyen señales de daño inflamatorio y/o tisular, radiación o tratamiento químico y privación nutricional 1,2,3,4. Entre los distintos tipos de senescencia, los más comúnmente vistos y bien estudiados son la senescencia replicativa, la senescencia inducida por oncogén (OIS), la senescencia inducida por radiación y la senescencia inducida por terapia (TIS). La OIS es una respuesta celular aguda al daño genotóxico causado por el estrés replicativo generado por la activación aberrante del oncogén y puede, en cierta medida, prevenir la progresión patológica de una lesión preneoplásica a un tumor en toda regla. El TIS ocurre cuando las células tumorales están estresadas por medicamentos quimioterapéuticos o radiación ionizante ^5,6.

La senescencia se considera un arma de doble filo en patología debido a su naturaleza altamente dinámica. Inicialmente se describió como un mecanismo supresor de tumores beneficioso para eliminar las células dañadas del grupo circulante de células en división, salvaguardando la función normal de los órganos e inhibiendo el crecimiento tumoral ^7,8,9. Sin embargo, la evidencia emergente ha sugerido un lado oscuro de la senescencia. Las células senescentes secretan citoquinas proinflamatorias, conocidas como fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), que conducen a fibrosis y órganos defectuosos y promueven el inicio y la progresión del tumor¹⁰. Además, las células cancerosas senescentes se someten a una reprogramación epigenética y de expresión génica en paralelo con la remodelación de la cromatina y la activación de una respuesta sostenida de daño al ADN (DDR)^11,12, adquiriendo recientemente nuevas propiedades de células madre cancerosas³. Aunque los tumores con capacidad de senescencia responden mejor a la intervención terapéutica en comparación con los incapaces de senescencia¹³, la persistencia de las células senescentes puede conducir a un mal pronóstico a largo plazo si no son identificados y eliminados eficazmente por los fármacos senolíticos⁵. De cualquier manera, un método confiable para evaluar la senescencia es de gran interés clínico, no solo para el pronóstico del tratamiento terapéutico, sino también para el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas a las células senescentes.

Independientemente de los diferentes desencadenantes, las células senescentes exhiben algunas características comunes, incluida la morfología agrandada, aplanada y multinucleada con grandes vacuolas, núcleos significativamente expandidos, formación de heterocromatina asociada a la senescencia rica en H3K9me3 (SAHF) en el núcleo, acumulación persistente de focos del marcador de daño al ADN γH2AX,^cip1 p53-p21 activado y RB-p16^INK4a mecanismos reguladores del ciclo celular, detención estable del ciclo celular G1, inducción masiva de SASP y actividad elevada asociada a la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal)¹⁴. Dado que ningún marcador único es suficiente para definir la senescencia, la tinción enzimática para la actividad SA-β-gal, que se considera el estándar de oro para la detección de senescencia, generalmente se combina con la tinción inmunohistoquímica para H3K9me3 y Ki67 para detectar TIS¹⁵. Sin embargo, el SA-β-gal basado en cromosomas químicos es difícil de cuantificar. Aquí, combinamos la detección de SA-β-gal basada en fluorescencia de 5-dodecanoylaminofluoresce-di-β-D-galactopiranosido (C₁₂FDG) basada en fluorescencia (fSA-β-gal) con tinción inmunofluorescente para γH2AX y ADN incorporado a EdU para identificar células senescentes C₁₂FDG ⁺ EdU-γH2AX ⁺ utilizando el sistema de citómetro de flujo de imágenes avanzadas, que combina la velocidad, la sensibilidad y las imágenes detalladas de una sola célula con información espacial que no se puede proporcionar mediante citometría de flujo y microscopía. Este método permite la generación rápida de imágenes de alta resolución que permiten el posicionamiento y la cuantificación de señales fluorescentes dentro de las células, al tiempo que autoriza el análisis rápido de múltiples muestras mediante la construcción de tuberías estándar.

Protocolo

1. Líneas celulares DLBCL con tratamiento con mafosfamida o daunorrubicina para inducir senescencia celular

NOTA: El protocolo también funciona para las células cancerosas adherentes. Dependiendo del tamaño de la célula, sembra 1-2 × 10⁵ células en un pozo de una placa de 6 pocillos e incuba la placa en una incubadora de 5% de CO₂, 37 ° C durante la noche antes del tratamiento. Los pasos del protocolo son los mismos que para las celdas de suspensión, pero con dos excepciones. Primero, las células deben ser tripsinizadas de la placa después del paso 3.4. En segundo lugar, los pasos de lavado se realizan sin centrifugación antes de la tripsinización.

1. Cuente las células DLBCL y la semilla 1 × 10⁶ células / ml en 4 ml de medio por pozo en una placa de cultivo de 6 pocillos. Cultivar células DLBCL en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
2. Agregue MAF (5 μg / ml) o DN (20 ng / ml) en el cultivo celular y meca suavemente la placa para mezclar.
   NOTA: MAF y DN no son estables. Después de disolverse en DMSO, la solución madre debe alicitarse y almacenarse a -20 °C. Se deben evitar los ciclos de congelación/descongelación.
3. Incubar la placa en una incubadora de 5% de CO₂, 37 °C durante 3 días.
4. Después de una incubación de 3 días, recoja las células DLBCL en tubos de centrífuga estériles de 15 ml y gire a 100 × g, 4 ° C durante 5 min.
5. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender los gránulos celulares con 4 ml de medio fresco y vuelva a agregar las suspensiones en la placa de 6 pocillos.
6. Cultive la placa celular en una incubadora de 5% de CO₂, 37 ° C durante otros 2 días antes de la cosecha para su análisis.

2. Preparar soluciones para la tinción (Tabla 1)

3. Tinción de células DLBCL con diferentes marcadores de senescencia

NOTA: Las muestras celulares teñidas con marcadores individuales (es decir, azul pacífico-EdU, C₁₂FDG o Alexa Fluor 647-γH2AX) están preparadas para generar una matriz de compensación para corregir el derrame de fluorescencia durante la medición. Aunque muy sugerido, este paso podría suspenderse cuando hay una superposición omitible (valor del coeficiente de compensación ≤ 0,1) de los espectros de emisión entre diferentes fluoróforos. Sin embargo, los usuarios deben determinar los pasos de compensación estandarizados cuando se utilizan diferentes instrumentos y paneles fluorescentes.

1. Añadir una solución de EdU de 10 mM en una proporción de 1:1.000 en el cultivo celular DLBCL generado a partir del paso 1,6 (la concentración final de EdU es de 10 μM). Mece suavemente la placa para mezclar e incubar en una incubadora de 5% de CO₂, 37 °C durante 3 h.
2. Saque la placa de la incubadora y agregue una solución de cloroquina de 100 mM a una concentración final de 75 μM (ver discusión). Mece suavemente la placa para mezclar e incubar en una incubadora de 5% de CO₂, 37 °C durante 30 min.
3. Saque la placa de la incubadora y agregue 20 mM C₁₂solución FDG a 1: 1,000 a una concentración final de C₁₂FDG de 20 μM. Balancee suavemente la placa para mezclar e incubar en una incubadora de 5% CO₂, 37 ° C durante 1 h.
4. Saque la placa de la incubadora y agregue 100 mM de solución de 2-feniletil-β-D-tiogalactósido (PETG) a 1:50 para detener la tinción de fSA-β-gal (concentración final de PETG de 2 mM). Gire suavemente la placa para mezclar.
5. Transfiera las células a tubos de centrífuga estériles de 15 ml y gire a 100 × g, 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave las células con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
6. Repita el paso de lavado de PBS. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 500 μL de solución de fijación de paraformaldehído al 4%.
7. Después de 10 min de incubación a temperatura ambiente, centrífuga a 250 × g, temperatura ambiente durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave las células con 4 ml de PBS.
8. Repita el paso de lavado de PBS. Deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en 200 μL de tampón de permeabilización de saponina y transfiera la suspensión a un nuevo tubo de 1,5 ml. Después de 10 min de incubación a temperatura ambiente, centrífuga a 250 × g, temperatura ambiente durante 5 min.
9. Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 200 μL de solución primaria de anticuerpos (anticuerpo 1:500 γH2AX en solución de incubación de anticuerpos). Incubar a 4 °C durante la noche en la oscuridad.
10. Centrifugar los tubos a 250 × g, 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave con 100 μL de solución de lavado de saponina.
11. Repita el paso de lavado dos veces más. Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 500 μL de cóctel de detección de EdU.
12. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. Centrífuga a 250 × g, a temperatura ambiente durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave con 1 ml de solución de lavado de saponina.
13. Repita el paso de lavado dos veces. Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 20-50 μL de PBS. Continúe con la sección 4 para la medición de la muestra.

4. Obtención de imágenes de marcadores de senescencia utilizando el sistema de citómetro de flujo de imágenes

1. Vacíe la botella de líquido residual. Verifique los niveles de perlas de velocidad, esterilizador, limpiador, desacreditador, vaina y reactivos de enjuague (agua desionizada) para asegurarse de que haya suficientes líquidos antes de encender el instrumento (consulte la Tabla de materiales).
2. Encienda el instrumento y el software de imágenes (consulte la interfaz del software en la Figura 1A).
3. Haga clic en el botón Inicio para inicializar la fluidez y la calibración del sistema.
   NOTA: Este procedimiento dura aproximadamente 45 min.
4. Ajuste el aumento a 40x, establezca la velocidad de fluidics en baja y encienda los láseres necesarios en el experimento. Encienda los láseres de 405 nm, 488 nm y 642 nm para medir EdU-pacific blue, C₁₂FDG y Alexa Fluor 647-γH2AX (o Alexa Fluor 647-Ki67), respectivamente. Establezca Ch6 para el canal de dispersión y Ch1 y Ch9 para el campo brillante.
5. Comience con la muestra que se espera que tenga la mayor fluorescencia para configurar la intensidad de los láseres. Voltee suavemente el tubo de muestra para mezclar. Abra la tapa del tubo e inserte el tubo de muestra en la base. Haga clic en Cargar para comenzar.
6. Abra un diagrama de dispersión y seleccione las funciones Area_M01 y aspect Ratio_M01 para los ejes X e Y, respectivamente. Establezca una puerta por encima de la relación de aspecto de 0,5 para excluir los dobletes y los agregados de celdas debajo y en el lado derecho, y la población de cuentas de velocidad en el lado izquierdo (Figura 1B).
7. Abra una gráfica de histograma y seleccione la función Degradado RMS_M01_Ch01 para el eje X. Elija la población singlete y establezca la puerta para seleccionar las celdas enfocadas (Figura 1C).
   NOTA: El sistema de imágenes utilizará automáticamente cuentas de velocidad para ajustar el enfoque de las imágenes. Sin embargo, se recomienda seleccionar la mitad derecha del pico del histograma para la población mejor enfocada.
8. Abra una gráfica de histograma y seleccione Intensidades máximas de píxeles sin procesar para el eje X para cada canal de color (Ch2, 7 y 11). Ajuste las potencias del láser (es decir, láseres de 488 nm, 405 nm y 642 nm para Ch2, 7 y 11, respectivamente), de modo que cada fluorocromo tenga un valor de píxel máximo raw entre 100 y 4.000 para evitar la sobresaturación.
   NOTA: Para este experimento, el ajuste de potencia del láser es de 50 mW, 200 mW y 50 mW para láseres de 488 nm, 405 nm y 642 nm, respectivamente.
9. Elija la población enfocada para registrar y haga clic en Adquirir para medir las muestras de DLBCL con configuraciones consistentes. Al cambiar las muestras para la medición, haga clic en Retorno para recuperar el tubo de muestra. Pulse Cargar para descartar el ejemplo.
10. Después de medir todas las muestras, apague el láser de campo brillante y dispersión. Mida muestras de control de un solo color para generar una matriz de compensación.
11. Haga clic en Apagar para cerrar el sistema de imágenes.
12. Analice los datos en el software de análisis de imágenes.
    1. Utilice la herramienta Spot Wizard del software de análisis de imágenes para contar y cuantificar automáticamente los focos nucleares γH2AX en imágenes de células vivas. Seleccione dos poblaciones celulares (una con alto y otra con bajo conteo de puntos) para entrenar al asistente de puntos para un análisis más automático de conteo de puntos.

Resultados

Se generó una matriz de compensación utilizando un software de análisis de imágenes mediante la carga de datos grabados de muestras de control de un solo color. Como se muestra en la Figura Suplementaria S1, se detectó un derrame de luz no despreciable (valor de coeficiente ≥ 0.1) de EdU a C₁₂FDG con un valor de coeficiente de diafonía de 0.248, mientras que la diafonía entre otros canales no fue significativa. Cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL fueron tratadas con 5 μg/mL ...

Discusión

Este método examinó la capacidad de entrada de senescencia de cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL durante el tratamiento de quimioterapia, con imágenes de campo brillante y cuantificación basada en citometría de flujo. A nivel unicelular, detectamos con éxito poblaciones senescentes C₁₂FDG^+EdU-Ki67+ principales en células KARPAS422 y WSU-DLCL2 tratadas, y en menor medida en células OCI-LY1, mientras que la línea celular SU-DHL6 fue resistente al tratamiento. L...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575