Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Resumen

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Resumen

Los medicamentos quimioterapéuticos pueden inducir daños irreparables en el ADN en las células cancerosas, lo que lleva a la apoptosis o senescencia prematura. A diferencia de la muerte celular apoptótica, la senescencia es una maquinaria fundamentalmente diferente que restringe la propagación de las células cancerosas. Décadas de estudios científicos han revelado los complejos efectos patológicos de las células cancerosas senescentes en tumores y microambientes que modulan las células cancerosas y las células estromales. La nueva evidencia sugiere que la senescencia es un potente factor pronóstico durante el tratamiento del cáncer y, por lo tanto, la detección rápida y precisa de las células senescentes en muestras de cáncer es esencial. Este artículo presenta un método para visualizar y detectar la senescencia inducida por la terapia (TIS) en las células cancerosas. Las líneas celulares de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) se trataron con mafosfamida (MAF) o daunorrubicina (DN) y se examinaron para detectar el marcador de senescencia, la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal), el marcador de síntesis de ADN 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y el marcador gamma-H2AX de daño al ADN (γH2AX). Las imágenes del citómetro de flujo pueden ayudar a generar imágenes unicelulares de alta resolución en un corto período de tiempo para visualizar y cuantificar simultáneamente los tres marcadores en las células cancerosas.

Introducción

Una variedad de estímulos puede desencadenar la senescencia celular, haciendo que las células entren en un estado de detención estable del ciclo celular. Estos estímulos incluyen cambios intrínsecos de señalización o tensiones extrínsecas. Las señales intrínsecas incluyen acortamiento progresivo de los telómeros, cambios en la estructura de los telómeros, modificación epigenética, trastornos de proteostasis, disfunción mitocondrial y activación de oncogenes. Las tensiones extrínsecas incluyen señales de daño inflamatorio y/o tisular, radiación o tratamiento químico y privación nutricional 1,2,3,4.

Protocolo

1. Líneas celulares DLBCL con tratamiento con mafosfamida o daunorrubicina para inducir senescencia celular

NOTA: El protocolo también funciona para las células cancerosas adherentes. Dependiendo del tamaño de la célula, sembra 1-2 × 10⁵ células en un pozo de una placa de 6 pocillos e incuba la placa en una incubadora de 5% de CO₂, 37 ° C durante la noche antes del tratamiento. Los pasos del protocolo son los mismos que para las celdas de suspensión, pero con dos excepciones. Primero, las células deben ser tripsinizadas de la placa después del paso 3.4. En segundo lugar, los pasos de lavado se realizan s....

Resultados

Se generó una matriz de compensación utilizando un software de análisis de imágenes mediante la carga de datos grabados de muestras de control de un solo color. Como se muestra en la Figura Suplementaria S1, se detectó un derrame de luz no despreciable (valor de coeficiente ≥ 0.1) de EdU a C₁₂FDG con un valor de coeficiente de diafonía de 0.248, mientras que la diafonía entre otros canales no fue significativa. Cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL fueron tratadas con 5 μg/mL .......

Discusión

Este método examinó la capacidad de entrada de senescencia de cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL durante el tratamiento de quimioterapia, con imágenes de campo brillante y cuantificación basada en citometría de flujo. A nivel unicelular, detectamos con éxito poblaciones senescentes C₁₂FDG^+EdU-Ki67+ principales en células KARPAS422 y WSU-DLCL2 tratadas, y en menor medida en células OCI-LY1, mientras que la línea celular SU-DHL6 fue resistente al tratamiento. L.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575