הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

Summary

כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.

Abstract

תרופות כימותרפיות יכולות לגרום לנזק בלתי הפיך לדנ"א בתאים סרטניים, מה שמוביל לאפופטוזיס או לסנסנציה מוקדמת. שלא כמו מוות של תאים אפופטוטיים, סנסנציה היא מנגנון שונה במהותו המרסן את התפשטותם של תאים סרטניים. עשרות שנים של מחקרים מדעיים חשפו את ההשפעות הפתולוגיות המורכבות של תאי סרטן סנסנטיים בגידולים ובמיקרו-סביבה המווסתים תאים סרטניים ותאים סטרומליים. ראיות חדשות מצביעות על כך שסנסנציה היא גורם פרוגנוסטי רב עוצמה במהלך הטיפול בסרטן, ולכן זיהוי מהיר ומדויק של תאים סנסנטיים בדגימות סרטן הוא חיוני. מאמר זה מציג שיטה לדמיין ולזהות סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול (TIS) בתאים סרטניים. קווי תאים מתפזרים של לימפומה של תאי B גדולים (DLBCL) טופלו באמצעות מאפוספמיד (MAF) או דאונורוביצין (DN) ונבדקו לאיתור סמן הסנסנציה, β-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה (SA-β-gal), סמן סינתזת הדנ"א 5-אתניל-2′-דאוקסיורידין (EdU), וסמן הנזק לדנ"א gamma-H2AX (γH2AX). הדמיית ציטומטר זרימה יכולה לסייע ביצירת תמונות חד-תאיות ברזולוציה גבוהה בפרק זמן קצר כדי לדמיין ולכמת בו-זמנית את שלושת הסמנים בתאים סרטניים.

Introduction

מגוון גירויים יכולים לגרום לסנסנציה תאית, ולגרום לתאים להיכנס למצב של עצירה יציבה של מחזור התא. גירויים אלה כוללים שינויי איתות פנימיים או לחצים חיצוניים. אותות פנימיים כוללים קיצור טלומרים פרוגרסיבי, שינויים במבנה הטלומרים, שינוי אפיגנטי, הפרעות פרוטאוסטזיס, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה והפעלה של אונקוגנים. לחצים חיצוניים כוללים אותות דלקת ו/או נזק לרקמות, קרינה או טיפול כימי, וחסך תזונתי ^1,2,3,4. מבין הסוגים המובהקים של סנסנציה, הנפוצים ביותר הנראים והנחקרים היטב הם סנסנציה משכפלת, סנסנציה המושרה על ידי אונקוגן (OIS), סנסנציה המושרה על ידי קרינה וסנסנציה המושרה על ידי טיפול (TIS). OIS היא תגובה תאית חריפה לנזק גנוטוקסי הנגרם על ידי עקה משכפלת הנוצרת על ידי הפעלת אונקוגן חריגה ויכולה במידה מסוימת למנוע את ההתקדמות הפתולוגית מנגע קדם-אופלסטי לגידול מלא. TIS קורה כאשר תאי הגידול נלחצים על ידי תרופות כימותרפיות או קרינה מייננת ^5,6.

Senescence נחשב חרב פיפיות בפתולוגיה בשל אופיו הדינמי מאוד. הוא תואר בתחילה כמנגנון מדכא גידול מועיל להסרת תאים פגומים ממאגר התאים המתחלקים במחזור הדם, תוך שמירה על תפקודם התקין של האיברים ועיכוב צמיחת הגידול ^7,8,9. עם זאת, עדויות חדשות מצביעות על צד אפל של סנסנציה. תאים סנסנטיים מפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים, הידועים בשם פנוטיפ הפרשה הקשור לסנסנציה (SASP), מה שמוביל לפיברוזיס ואיברים לא תקינים ומקדם את התחלת הגידול והתקדמותו¹⁰. יתר על כן, תאים סרטניים סנסנטיים עוברים תכנות מחדש אפיגנטי וביטוי גנים במקביל לשיפוץ כרומטין והפעלה של תגובה מתמשכת של נזק לדנ"א (DDR)^11,12, תוך רכישת תכונות חדשות של תאי סרטן-גזע³. אף על פי שגידולים בעלי יכולת סנסנסנציה מגיבים טוב יותר להתערבות טיפולית בהשוואה לגידולים שאינם מסוגלים לסנסנציה¹³, ההתמדה של תאים סנסנטיים עלולה להוביל לפרוגנוזה גרועה לטווח ארוך אם הם לא יזוהו ביעילות ויסולקו על ידי תרופות סנוליטיות⁵. כך או כך, שיטה אמינה להערכת סנסנציה היא בעלת עניין קליני משמעותי, לא רק לפרוגנוזה של הטיפול, אלא גם לפיתוח אסטרטגיות חדשניות המכוונות לתאים סנסנטיים.

ללא קשר לטריגרים שונים, תאים סנסנטיים מציגים כמה מאפיינים נפוצים, כולל מורפולוגיה מוגדלת, שטוחה ורב-גרעינית עם ואקואולות גדולות, גרעינים מורחבים באופן משמעותי, היווצרות של הטרוכרומטין עשיר בסנסנציה H3K9me3 (SAHF) בגרעין, הצטברות מתמשכת של סמן נזק לדנ"א γH2AX מוקדים, מופעל p53-p21^CIP1 ו- Rb-p16^INK4a מנגנוני ויסות מחזור התא, עצירת מחזור תאי G1 יציבה, אינדוקציה מסיבית של SASP ופעילות מוגברת הקשורה לסנסנציה β-גלקטוזידאז (SA-β-gal)¹⁴. מכיוון שאין מספיק סמן יחיד כדי להגדיר סנסנציה, צביעה אנזימטית עבור פעילות SA-β-gal, הנחשבת לתקן הזהב לזיהוי סנסנציות, משולבת בדרך כלל עם צביעה אימונוהיסטוכימית עבור H3K9me3 ו- Ki67 כדי לזהות TIS¹⁵. עם זאת, קשה לכמת SA-β-gal המבוסס על כרומוגניה כימית. כאן, שילבנו 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C₁₂FDG) מבוסס פלואורסצנציה מבוסס SA-β-gal (fSA-β-gal) עם צביעה אימונופלואורסנטית עבור γH2AX ו- DNA משולב EdU כדי לזהות C₁₂FDG⁺EdU-γH2AX⁺ תאים סנסנטיים באמצעות מערכת ציטומטר זרימת ההדמיה המתקדמת, המשלבת את המהירות, הרגישות ותמונות מפורטות של תא יחיד עם מידע מרחבי שלא ניתן לספק על ידי ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה. שיטה זו מאפשרת יצירה מהירה של תמונות ברזולוציה גבוהה המאפשרת מיקום וכימות של אותות פלואורסצנטיים בתוך תאים, תוך מתן רישיון לניתוח מהיר של דגימות מרובות על ידי בניית צינורות סטנדרטיים.

Protocol

1. קווי תאים DLBCL עם טיפול באפוספמיד או דאונורוביצין כדי לגרום לסנסנציה תאית

הערה: הפרוטוקול פועל גם עבור תאים סרטניים חסידיים. בהתאם לגודל התא, זרע 1-2 × 10⁵ תאים לתוך באר אחת של צלחת 6 בארות ולדגום את הצלחת באינקובטור 5% CO₂, 37 °C לילה לפני הטיפול. שלבי הפרוטוקול זהים לאלה של תאי ההשעיה אך עם שני יוצאים מן הכלל. ראשית, יש לנסות את התאים מהצלחת לאחר שלב 3.4. שנית, שלבי שטיפה מבוצעים ללא צנטריפוגה לפני טריפסיניזציה.

1. ספירת תאי DLBCL וזרע 1 × 10⁶ תאים/מ"ל ב-4 מ"ל של בינוני לכל באר לתוך צלחת תרבית של 6 בארות. טפחו תאי DLBCL במדיום RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-100 פניצילין/סטרפטומיצין U/mL.
2. הוסיפו MAF (5 מיקרוגרם/מ"ל) או DN (20 ננוגרם/מ"ל) לתרבית התאים ונדנדו בעדינות את הצלחת לערבוב.
   הערה: MAF ו- DN אינם יציבים. לאחר פירוק ב- DMSO, יש למקם את פתרון המניות ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. יש להימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה.
3. דגירה של הצלחת באינקובטור 5% CO₂, 37 °C למשך 3 ימים.
4. לאחר דגירה של 3 ימים, לאסוף את תאי DLBCL בצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מ"ל ולסובב ב 100 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
5. השליכו את ה-supernatant, החיזרו את כדורי התאים עם 4 מ"ל של מדיום רענן, והוסיפו את המתלים בחזרה לצלחת בעלת 6 הבארות.
6. טפחו את צלחת התא בחממה של 5% CO₂, 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים נוספים לפני הקטיף לניתוח.

2. הכינו פתרונות לצביעה (טבלה 1)

3. כתם תאי DLBCL בסמני סנסנציה שונים

הערה: דגימות תאים מוכתמות בסמנים בודדים (כלומר, כחול-EdU פסיפי, C₁₂FDG, או Alexa Fluor 647-γH2AX) מוכנות ליצור מטריצת פיצוי כדי לתקן את הזליגה הפלואורסצנטית במהלך המדידה. למרות שהוצע מאוד, ניתן להשעות שלב זה כאשר קיימת חפיפה ניתנת להשמטה (ערך מקדם הפיצוי ≤ 0.1) של ספקטרום הפליטה בקרב פלואורופורים שונים. עם זאת, על המשתמשים לקבוע שלבי פיצוי סטנדרטיים בעת שימוש במכשירים שונים ובלוחות פלורסנט שונים.

1. הוסף תמיסת EdU של 10 mM ביחס של 1:1,000 לתרבית התאים DLBCL הנוצרת משלב 1.6 (ריכוז EdU הסופי הוא 10 μM). נדנדו בעדינות את הצלחת כדי לערבב ולדגום באינקובטור 5% CO₂, 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
2. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומוסיפים תמיסת כלורוקין 100 מ"מ לריכוז סופי של 75 מיקרומטר (ראו דיון). נדנדו בעדינות את הצלחת כדי לערבב ולדגום באינקובטור 5% CO₂, 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. הוציאו את הצלחת מהאינקובטור והוסיפו תמיסת 20 mM C₁₂FDG ב-1: 1,000 לריכוז C₁₂FDG סופי של 20 מיקרומטר.
4. הוציאו את הצלחת מהאינקובטור והוסיפו תמיסת 100 mM 2-פנילאתיל-β-D-thiogalactoside (PETG) בשעה 1:50 כדי לעצור את תמיסת fSA-β-gal (ריכוז PETG סופי של 2 mM). סובבו בעדינות את הצלחת כדי לערבב.
5. מעבירים את התאים לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מ"ל ומסובבים ב-100 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. יש להשליך את חומר העל ולשטוף את התאים ב-4 מ"ל של מלח בעל מאגר פוספט (PBS).
6. חזור על שלב הכביסה של PBS. השליכו את הסופרנאטנט והחזירו את כדורי התא ב-500 μL של תמיסת קיבוע פרפורמלדהיד של 4%.
7. לאחר 10 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 250 × גרם, טמפרטורת החדר במשך 5 דקות. השליכו את תאי הסופרנטנט ושטפו 4 מ"ל של PBS.
8. חזור על שלב הכביסה של PBS. יש להשליך את הסופרנטנט, להחיות את גלולת התא ב-200 μL של חיץ חדירת סאפונין ולהעביר את ההשעיה לצינור חדש של 1.5 מ"ל. לאחר 10 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 250 × גרם, טמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
9. יש להשליך את הסופרנטנט ולהחיות את כדורי התאים ב-200 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית (נוגדן 1:500 γH2AX בתמיסת הדגירה של נוגדנים). דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחושך.
10. צנטריפוגה את הצינורות ב 250 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את ה-supernatant ושטפו עם תמיסת שטיפת סאפונין ב-100 μL.
11. חזרו על שלב הכביסה פעמיים נוספות. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את כדורי התא ב-500 מיקרול' של קוקטייל זיהוי EdU.
12. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך. צנטריפוגה ב 250 × גרם, טמפרטורת החדר במשך 5 דקות. יש להשליך את ה-supernatant ולשטוף עם 1 מ"ל של תמיסת שטיפת ספונין.
13. חזור על שלב הכביסה פעמיים. יש להשליך את הסופרנטנט ולהחיות את כדורי התא ב-20-50 מיקרול של PBS. המשך לסעיף 4 למדידת מדגם.

4. הדמיה של סמני סנסנציה באמצעות מערכת ציטומטר זרימת ההדמיה

1. רוקנו את בקבוק נוזל הפסולת. בדקו את רמות החרוזים המהירים, המעקרים, המנקה, ההפרחות, הנדן וריאגנטי השטיפה (מים שעברו דה-יוניזציה) כדי להבטיח מספיק נוזלים לפני הפעלת המכשיר (ראו טבלת החומרים).
2. הפעילו את המכשיר ואת תוכנת ההדמיה (ראו את ממשק התוכנה באיור 1A).
3. לחץ על לחצן הפעלה כדי לאתחל נוזלים וכיול המערכת.
   הערה: הליך זה אורך כ-45 דקות.
4. הגדר את ההגדלה ל-40x, הגדר את מהירות הנוזלים לנמוכה והפעל את הלייזרים הדרושים בניסוי. הפעל לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-642 ננומטר כדי למדוד את הלייזרים הכחולים של EdU-pacific, C₁₂FDG ו-Alexa Fluor 647-γH2AX (או Alexa Fluor 647-Ki67), בהתאמה. הגדר את Ch6 עבור ערוץ פיזור, ו- Ch1 ו- Ch9 עבור ברייטפילד.
5. התחילו עם הדגימה שצפויה להיות בעלת הפלואורסצנציה הגבוהה ביותר כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים. הפוך בעדינות את צינור הדגימה כדי לערבב. פתח את מכסה הצינור, והכנס את צינור הדגימה לרציף. לחץ על טען כדי להתחיל.
6. פתח תרשים פיזור ובחר את התכונות Area_M01 ו - Aspect Ratio_M01 עבור צירי X ו - Y, בהתאמה. הגדר שער מעל יחס גובה-רוחב של 0.5 כדי לא לכלול כפלים וצבירת תאים מתחת ובצד ימין, ואת אוכלוסיית חרוזי המהירות בצד שמאל (איור 1B).
7. פתח תרשים היסטוגרמה ובחר את התכונה מעבר צבע RMS_M01_Ch01 עבור ציר ה- X. בחרו את אוכלוסיית הסינגלטים והגדירו את השער לבחירה עבור תאים ממוקדים (איור 1C).
   הערה: מערכת ההדמיה תשתמש באופן אוטומטי בחרוזי מהירות כדי להתאים את המיקוד להדמיה. עם זאת, מומלץ לבחור את המחצית הימנית של שיא ההיסטוגרמה עבור האוכלוסייה הממוקדת ביותר.
8. פתח תרשים היסטוגרמה ובחר עוצמות פיקסלים של Raw Max עבור ציר X עבור כל ערוץ צבע (Ch2, 7 ו- 11). התאימו את הספקות הלייזר (כלומר, לייזרים של 488 ננומטר, 405 ננומטר ו-642 ננומטר עבור Ch2, 7 ו-11, בהתאמה), כך שלכל פלואורוכרום יהיה ערך Raw Max Pixel בין 100 ל-4,000 כדי למנוע פיזור יתר.
   הערה: עבור ניסוי זה, הגדרת הספק הלייזר היא 50 mW, 200 mW ו - 50 mW עבור לייזרים 488 ננומטר, 405 ננומטר ו - 642 ננומטר, בהתאמה.
9. בחר את האוכלוסייה הממוקדת שתקליט ולחץ על רכוש כדי למדוד את דגימות ה- DLBCL עם הגדרות עקביות. בעת שינוי דגימות למדידה, לחץ על Return כדי לשחזר את צינור הדגימה. לחץ על טען כדי להשליך את הדגימה.
10. לאחר שכל הדגימות נמדדות, כבו את שדה הבהיר ופזרו את הלייזר. מדוד דגימות בקרה בצבע יחיד כדי ליצור מטריצת פיצוי.
11. לחץ על כיבוי כדי לסגור את מערכת ההדמיה.
12. נתח את הנתונים בתוכנת ניתוח התמונות.
    1. השתמש בכלי Spot Wizard של תוכנת ניתוח התמונות כדי לספור ולכמת באופן אוטומטי מוקדי γH2AX גרעיניים בתמונות של תאים חיים. בחר שתי אוכלוסיות תאים (אחת עם גבוהה ואחת עם ספירת נקודות נמוכה) כדי לאמן את אשף הנקודות לניתוח אוטומטי נוסף של ספירת הכתמים.

תוצאות

מטריצת פיצוי נוצרה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות על ידי טעינת נתונים מוקלטים של דגימות בקרה בצבע יחיד. כפי שניתן לראות באיור המשלים S1, זליגת אור לא זניחה (ערך מקדם ≥ 0.1) מ-EdU ל-C₁₂FDG זוהתה עם ערך מקדם crosstalk 0.248, בעוד שה-crosstalk בין ערוצים אחרים לא היה משמעותי. ארבעה קווי תאים שונים של DLBCL...

Discussion

שיטה זו בחנה את יכולת הכניסה לסנסנציה של ארבעה קווי תאי DLBCL שונים עם טיפול כימותרפי, עם הדמיה בשדה בהיר וכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה. ברמה של תא יחיד, זיהינו בהצלחה אוכלוסיות סנסנטיות עיקריות של C₁₂FDG^+EdU-Ki67+ בתאי KARPAS422 ו-WSU-DLCL2 שטופלו, ובמידה פחותה בתאי OCI-LY1, בעוד שקו הת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575