Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Zusammenfassung

Chemotherapeutika können irreparable DNA-Schäden in Krebszellen induzieren, was zu Apoptose oder vorzeitiger Seneszenz führt. Im Gegensatz zum apoptotischen Zelltod ist die Seneszenz eine grundlegend andere Maschinerie, die die Ausbreitung von Krebszellen hemmt. Jahrzehntelange wissenschaftliche Studien haben die komplexen pathologischen Wirkungen von seneszenten Krebszellen in Tumoren und Mikroumgebungen aufgedeckt, die Krebszellen und Stromazellen modulieren. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Seneszenz ein starker prognostischer Faktor während der Krebsbehandlung ist, und daher ist ein schneller und genauer Nachweis seneszenter Zellen in Krebsproben unerlässlich. Dieses Papier stellt eine Methode zur Visualisierung und zum Nachweis von therapieinduzierter Seneszenz (TIS) in Krebszellen vor. Diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL)-Zelllinien wurden mit Mafosfamid (MAF) oder Daunrubicin (DN) behandelt und auf den Seneszenzmarker, Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal), den DNA-Synthesemarker 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU) und den DNA-Schadensmarker gamma-H2AX (γH2AX) untersucht. Die Bildgebung von Durchflusszytometern kann dazu beitragen, in kurzer Zeit hochauflösende Einzelzellbilder zu erzeugen, um die drei Marker in Krebszellen gleichzeitig zu visualisieren und zu quantifizieren.

Einleitung

Eine Vielzahl von Reizen kann zelluläre Seneszenz auslösen, wodurch Zellen in einen Zustand stabilen Zellzyklusstillstands eintreten. Zu diesen Reizen gehören intrinsische Signalveränderungen oder extrinsische Spannungen. Intrinsische Signale umfassen progressive Telomerverkürzung, Veränderungen der Telomerstruktur, epigenetische Modifikation, Proteostasestörungen, mitochondriale Dysfunktion und Aktivierung von Onkogenen. Extrinsische Belastungen umfassen entzündliche und/oder Gewebeschädigungssignale, Bestrahlung oder chemische Behandlung und Nahrungsentzug 1,2,3,4. Unter den verschiedenen Arten der Seneszenz sind die am häufigsten beobachteten und gut untersuchten replizierte Seneszenzenz, Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), strahleninduzierte Seneszenz und therapieinduzierte Seneszenz (TIS). OIS ist eine akute zelluläre Reaktion auf genotoxische Schäden, die durch replizierenden Stress verursacht werden, der durch aberrante Onkogenaktivierung erzeugt wird, und kann bis zu einem gewissen Grad das pathologische Fortschreiten von einer präneoplastischen Läsion zu einem ausgewachsenen Tumor verhindern. TIS tritt auf, wenn Tumorzellen durch Chemotherapeutika oder ionisierende Strahlung gestresst^{werden 5,6}.

Seneszenz gilt aufgrund ihrer hochdynamischen Natur als zweischneidiges Schwert in der Pathologie. Es wurde ursprünglich als ein nützlicher tumorunterdrückender Mechanismus beschrieben, um beschädigte Zellen aus dem zirkulierenden Pool von sich teilenden Zellen zu entfernen, die normale Funktion der Organe zu sichern und das Tumorwachstum zu hemmen ^7,8,9. Neue Beweise deuten jedoch auf eine dunkle Seite der Seneszenz hin. Seneszente Zellen sezernieren proinflammatorische Zytokine, bekannt als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP), was zu Fibrose und fehlfunktionellen Organen führt und die Tumorentstehung und -progression^{fördert 10}. Darüber hinaus durchlaufen seneszente Krebszellen eine epigenetische und Genexpressions-Reprogrammierung parallel zur Chromatin-Remodellierung und Aktivierung einer anhaltenden DNA-Schadensantwort (DDR)^11,12 und erwerben neue Krebs-Stammzell-Eigenschaften³. Obwohl seneszenzfähige Tumore im Vergleich zu seneszenzunfähigen Tumoren besser auf therapeutische Interventionen ansprechen¹³, kann die Persistenz seneszenter Zellen zu einer schlechten Langzeitprognose führen, wenn sie nicht effektiv identifiziert und durch senolytische Medikamente eliminiert^{werden 5}. In jedem Fall ist eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Seneszenz von erheblichem klinischem Interesse, nicht nur für die Prognose der Therapiebehandlung, sondern auch für die Entwicklung neuartiger Strategien für seneszente Zellen.

Unabhängig von verschiedenen Auslösern weisen seneszente Zellen einige gemeinsame Merkmale auf, darunter vergrößerte, abgeflachte, mehrkernige Morphologie mit großen Vakuolen, signifikant expandierte Kerne, Bildung von H3K9me3-reichem Seneszenz-assoziiertem Heterochromatin (SAHF) im Zellkern, persistierende Ansammlung von DNA-Schadensmarker-γH2AX-Herden, aktiviertes p53-p21^CIP1 und Rb-p16^INK4a Zellzyklus-Regulationsmechanismen, stabiler G1-Zellzyklus-Stillstand, massive Induktion von SASP und erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal^{) 14}. Da kein einzelner Marker ausreicht, um die Seneszenz zu definieren, wird die enzymatische Färbung für die SA-β-gal-Aktivität, die als Goldstandard für den Seneszenznachweis gilt, normalerweise mit einer immunhistochemischen Färbung für H3K9me3 und Ki67 kombiniert, um TIS¹⁵ nachzuweisen. Chemisch-chromogenes SA-β-gal ist jedoch schwer zu quantifizieren. Hier kombinierten wir 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-Galactopyranosid (C 12 FDG) fluoreszenzbasierten SA-β-gal (fSA-β-gal)-Nachweis mit Immunfluoreszenzfärbung für γH2AX und EdU-inkorporierte DNA, um C₁₂FDG+EdU-γH2AX⁺ seneszente Zellen mit dem fortschrittlichen bildgebenden Durchflusszytometersystem zu identifizieren, das die Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und detaillierte Einzelzellbilder mit räumlichen Informationen kombiniert, die durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie nicht bereitgestellt werden können. Diese Methode ermöglicht die schnelle Generierung von hochauflösenden Bildern, die die Positionierung und Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen innerhalb von Zellen ermöglichen, während die schnelle Analyse mehrerer Proben durch den Bau von Standardpipelines lizenziert wird.

Protokoll

1. DLBCL-Zelllinien mit Mafosfamid oder Daunrubicin Behandlung zur Induktion der zellulären Seneszenz

HINWEIS: Das Protokoll funktioniert auch für adhärente Krebszellen. Je nach Zellgröße 1-2 × 10 5 Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte einspeisen und die Platte in einem⁵ % CO₂, 37 °C Inkubator über Nacht vor der Behandlung inkubieren. Die Protokollschritte sind die gleichen wie für Suspensionszellen, jedoch mit zwei Ausnahmen. Zuerst müssen Zellen nach Schritt 3.4 von der Platte trypsinisiert werden. Zweitens werden Waschschritte ohne Zentrifugation vor der Trypsinisierung durchgeführt.

1. Zählen Sie DLBCL-Zellen und Samen Sie 1 × 10 6 Zellen / ml in 4 ml Medium pro Vertiefung in eine 6-Well-Kulturplatte^. Kultivieren Sie DLBCL-Zellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin.
2. Geben Sie MAF (5 μg / ml) oder DN (20 ng / ml) in die Zellkultur und schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen.
   HINWEIS: MAF und DN sind nicht stabil. Nach dem Auflösen in DMSO sollte die Stammlösung aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden. Frost-/Tauzyklen sollten vermieden werden.
3. Inkubieren Sie die Platte in einem 5% CO₂, 37 °C Inkubator für 3 Tage.
4. Nach einer 3-tägigen Inkubation sammeln Sie die DLBCL-Zellen in 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen und drehen Sie sie bei 100 × g, 4 °C für 5 min.
5. Verwerfen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellpellets mit 4 ml frischem Medium und fügen Sie die Suspensionen wieder in die 6-Well-Platte hinzu.
6. Kultivieren Sie die Zellplatte in einem 5% CO 2, 37 °C Inkubator für weitere₂ Tage, bevor Sie zur Analyse ernten.

2. Vorbereiten von Lösungen für die Färbung (Tabelle 1)

3. Färben Sie DLBCL-Zellen mit verschiedenen Seneszenzmarkern

HINWEIS: Zellproben, die mit einzelnen Markern (z. B. Pacific Blue-EdU, C₁₂FDG oder Alexa Fluor 647-γH2AX) angefärbt sind, werden vorbereitet, um eine Kompensationsmatrix zu erzeugen, um den Fluoreszenz-Spillover während der Messung zu korrigieren. Obwohl dieser Schritt sehr nahegelegt wird, könnte er ausgesetzt werden, wenn es eine weglassende Überlappung (Kompensationskoeffizientenwert ≤ 0,1) der Emissionsspektren zwischen verschiedenen Fluorophoren gibt. Anwender müssen jedoch standardisierte Kompensationsschritte festlegen, wenn sie verschiedene Instrumente und Fluoreszenzpaneele verwenden.

1. Geben Sie 10 mM EdU-Lösung in einem Verhältnis von 1:1.000 in die DLBCL-Zellkultur, die aus Schritt 1.6 erzeugt wird (die endgültige EdU-Konzentration beträgt 10 μM). Schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen und Inkubieren in einem Inkubator mit 5% CO₂, 37 °C für 3 h.
2. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 100 mM Chloroquinlösung zu einer Endkonzentration von 75 μM hinzu (siehe Diskussion). Die Platte vorsichtig schaukeln, um sie zu mischen und in einem 5% CO₂, 37 °C Inkubator für 30 min zu inkubieren.
3. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 20 mM C 12 FDG-Lösung bei 1: 1.000 zu einer endgültigen C₁₂FDG-Konzentration von 20 μM hinzu. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen und Inkubieren in einem 5% CO₂, 37 °C Inkubator für 1 h.
4. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 100 mM 2-Phenylethyl-β-D-thiogalactoside (PETG) -Lösung bei 1:50 hinzu, um die fSA-β-gal-Färbung (endgültige PETG-Konzentration von 2 mM) zu stoppen. Drehen Sie die Platte vorsichtig zum Mischen.
5. Übertragen Sie die Zellen auf 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen und drehen Sie sie bei 100 × g, 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
6. Wiederholen Sie den PBS-Waschschritt. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 500 μL 4% paraformaldehydiger Fixierungslösung.
7. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur, Zentrifuge bei 250 × g, Raumtemperatur 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 4 ml PBS.
8. Wiederholen Sie den PBS-Waschschritt. Verwerfen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL Saponinpermeabilisierungspuffer und übertragen Sie die Suspension in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur zentrifugieren bei 250 × g, Raumtemperatur 5 min.
9. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 μL primärer Antikörperlösung (1:500 γH2AX-Antikörper in Antikörper-Inkubationslösung). Bei 4 °C über Nacht im Dunkeln inkubieren.
10. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 × g, 4 °C für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 100 μL Saponin-Waschlösung.
11. Wiederholen Sie den Waschschritt zwei weitere Male. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in einem 500 μL EdU-Detektionscocktail.
12. Bei Raumtemperatur 30 min im Dunkeln inkubieren. Zentrifuge bei 250 × g, Raumtemperatur für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 1 ml Saponin-Waschlösung.
13. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 20-50 μL PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Probenmessung fort.

4. Bildgebende Seneszenzmarker mit dem bildgebenden Durchflusszytometersystem

1. Leeren Sie die Abfallflasche. Überprüfen Sie die Füllstände von Geschwindigkeitsperlen, Sterilisator, Reiniger, Debubbler, Mantel und Spülreagenzien (deionisiertes Wasser), um ausreichend Flüssigkeit zu gewährleisten, bevor Sie das Instrument einschalten (siehe Materialtabelle).
2. Schalten Sie das Instrument und die Bildgebungssoftware ein (siehe Softwareschnittstelle in Abbildung 1A).
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Fluidik und die Systemkalibrierung zu initialisieren.
   HINWEIS: Dieser Vorgang dauert ca. 45 Minuten.
4. Stellen Sie die Vergrößerung auf 40x ein, stellen Sie die Fluidikgeschwindigkeit auf niedrig ein und schalten Sie die im Experiment benötigten Laser ein. Schalten Sie 405-nm-, 488-nm- und 642-nm-Laser ein, um EdU-pacific blue, C₁₂FDG bzw. Alexa Fluor 647-γH2AX (oder Alexa Fluor 647-Ki67) zu messen. Stellen Sie Ch6 für den Streukanal und Ch1 und Ch9 für das Hellfeld ein.
5. Beginnen Sie mit der Probe, von der erwartet wird, dass sie die höchste Fluoreszenz aufweist, um die Intensität der Laser einzustellen. Drehen Sie das Probenröhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Öffnen Sie den Röhrchendeckel und führen Sie das Probenröhrchen in das Dock ein. Klicken Sie auf Laden , um zu beginnen.
6. Öffnen Sie ein Streudiagramm und wählen Sie die Features Area_M01 und Aspect Ratio_M01 für die X- bzw. Y-Achse aus. Legen Sie ein Gate oberhalb des Seitenverhältnisses von 0,5 fest, um Dubletten und Zellaggregate unterhalb und auf der rechten Seite sowie die Geschwindigkeitsperlenpopulation auf der linken Seite auszuschließen (Abbildung 1B).
7. Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm und wählen Sie das Feature-Verlaufs RMS_M01_Ch01 für die X-Achse aus. Wählen Sie die Singulett-Population aus, und legen Sie das Gate so fest, dass es für fokussierte Zellen ausgewählt wird (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Das Bildgebungssystem verwendet automatisch Geschwindigkeitsperlen, um den Fokus für die Bildgebung anzupassen. Es wird jedoch empfohlen, die richtige Hälfte des Histogramm-Peaks für die am besten fokussierte Population auszuwählen.
8. Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm, und wählen Sie für jeden Farbkanal (Ch2, 7 und 11) die Option "Unformatierte maximale Pixelintensitäten" für die X-Achse aus. Stellen Sie die Laserleistungen ein (d. h. 488 nm, 405 nm und 642 nm Laser für Ch2, 7 bzw. 11), so dass jedes Fluorochrom einen Raw Max Pixel-Wert zwischen 100 und 4.000 hat , um eine Übersättigung zu vermeiden.
   HINWEIS: Für dieses Experiment beträgt die Einstellung der Laserleistung 50 mW, 200 mW und 50 mW für Laser 488 nm, 405 nm bzw. 642 nm.
9. Wählen Sie die fokussierte Grundgesamtheit aus, die aufgezeichnet werden soll, und klicken Sie auf Erwerben , um die DLBCL-Stichproben mit konsistenten Einstellungen zu messen. Wenn Sie Proben für die Messung wechseln, klicken Sie auf Zurück, um das Probenröhrchen wiederherzustellen. Drücken Sie auf Laden , um das Beispiel zu verwerfen .
10. Nachdem alle Proben gemessen wurden, schalten Sie den Hellfeld- und Streulaser aus. Messen Sie einfarbige Kontrollproben, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen.
11. Klicken Sie auf Herunterfahren, um das Imaging-System zu schließen.
12. Analysieren Sie die Daten in der Bildanalysesoftware.
    1. Verwenden Sie das Spot-Wizard-Tool der Bildanalyse-Software, um Kern-γH2AX-Herde in Lebendzellbildern automatisch zu zählen und zu quantifizieren. Wählen Sie zwei Zellpopulationen aus (eine mit hoher und eine mit niedriger Punktzahl), um den Spot-Assistenten für eine weitere automatische Spot-Count-Analyse zu trainieren.

Ergebnisse

Eine Kompensationsmatrix wurde mit Hilfe von Bildanalysesoftware generiert, indem aufgezeichnete Daten von einfarbigen Kontrollproben geladen wurden. Wie in Ergänzender Abbildung S1 gezeigt, wurde ein nicht zu vernachlässigender Lichtüberlauf (Koeffizientenwert ≥ 0,1) von EdU auf C₁₂FDG mit einem Übersprechkoeffizientenwert von 0,248 festgestellt, während das Übersprechen unter anderen Kanälen nicht signifikant war. Vier verschiedene DLBCL-Zelllinien wurden mit 5 μg/ml MAF oder 20 ng...

Diskussion

Diese Methode untersuchte die Seneszenzeintrittsfähigkeit von vier verschiedenen DLBCL-Zelllinien unter Chemotherapie mit Hellfeldbildgebung und Durchflusszytometrie-basierter Quantifizierung. Auf Einzelzellebene konnten wir erfolgreich wichtige C 12 FDG+EdU-Ki67⁺ seneszente Populationen in behandelten KARPAS422- und WSU-DLCL2-Zellen und in geringerem Maße in OCI-LY1-Zellen nachweisen, während die SU-DHL6-Zelllinie resistent gegen die Behandlung war. Der Unterschied in der S...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575