Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Abstract

I farmaci chemioterapici possono indurre danni irreparabili al DNA nelle cellule tumorali, portando ad apoptosi o senescenza prematura. A differenza della morte cellulare apoptotica, la senescenza è un meccanismo fondamentalmente diverso che limita la propagazione delle cellule tumorali. Decenni di studi scientifici hanno rivelato i complessi effetti patologici delle cellule tumorali senescenti nei tumori e nei microambienti che modulano le cellule tumorali e le cellule stromali. Nuove prove suggeriscono che la senescenza è un potente fattore prognostico durante il trattamento del cancro, e quindi è essenziale un rilevamento rapido e accurato delle cellule senescenti nei campioni di cancro. Questo documento presenta un metodo per visualizzare e rilevare la senescenza indotta dalla terapia (TIS) nelle cellule tumorali. Le linee cellulari diffuse di linfoma a grandi cellule B (DLBCL) sono state trattate con mafosfamide (MAF) o daunorubicina (DN) ed esaminate per il marcatore di senescenza, la β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal), il marcatore di sintesi del DNA 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) e il marcatore di danno al DNA gamma-H2AX (γH2AX). L'imaging del citometro a flusso può aiutare a generare immagini a singola cellula ad alta risoluzione in un breve periodo di tempo per visualizzare e quantificare simultaneamente i tre marcatori nelle cellule tumorali.

Introduzione

Una varietà di stimoli può innescare la senescenza cellulare, facendo sì che le cellule entrino in uno stato di arresto stabile del ciclo cellulare. Questi stimoli includono cambiamenti intrinseci di segnalazione o stress estrinseci. I segnali intrinseci includono l'accorciamento progressivo dei telomeri, i cambiamenti nella struttura dei telomeri, la modificazione epigenetica, i disturbi della proteostasi, la disfunzione mitocondriale e l'attivazione degli oncogeni. Gli stress estrinseci includono segnali infiammatori e / o di danno tissutale, radiazioni o trattamenti chimici e privazione nutrizionale 1,2,3,4. Tra i tipi distinti di senescenza, i più comunemente visti e ben studiati sono la senescenza replicativa, la senescenza indotta da oncogeni (OIS), la senescenza indotta da radiazioni e la senescenza indotta dalla terapia (TIS). L'OIS è una risposta cellulare acuta al danno genotossico causato dallo stress replicativo generato dall'attivazione aberrante dell'oncogene e può in una certa misura prevenire la progressione patologica da una lesione preneoplastica a un tumore in piena regola. La TIS si verifica quando le cellule tumorali sono stressate da farmaci chemioterapici o radiazioni ionizzanti ^5,6.

La senescenza è considerata un'arma a doppio taglio in patologia a causa della sua natura altamente dinamica. Inizialmente è stato descritto come un meccanismo benefico soppressivo del tumore per rimuovere le cellule danneggiate dal pool circolante di cellule in divisione, salvaguardando la normale funzione degli organi e inibendo la crescita tumorale ^7,8,9. Tuttavia, le prove emergenti hanno suggerito un lato oscuro della senescenza. Le cellule senescenti secernono citochine proinfiammatorie, note come fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), che portano alla fibrosi e agli organi malfunzionanti e promuovono l'inizio e la progressione del tumore¹⁰. Inoltre, le cellule tumorali senescenti subiscono una riprogrammazione epigenetica e di espressione genica in parallelo con il rimodellamento della cromatina e l'attivazione di una risposta sostenuta al danno al DNA (DDR)^11,12, acquisendo di recente nuove proprietà delle cellule staminali tumorali³. Sebbene i tumori capaci di senescenza rispondano meglio all'intervento terapeutico rispetto a quelli incapaci di senescenza¹³, la persistenza delle cellule senescenti può portare a una prognosi a lungo termine sfavorevole se non vengono efficacemente identificati ed eliminati dai farmaci senolitici⁵. In entrambi i casi, un metodo affidabile per valutare la senescenza è di notevole interesse clinico, non solo per la prognosi del trattamento terapeutico, ma anche per lo sviluppo di nuove strategie mirate alle cellule senescenti.

Indipendentemente dai diversi fattori scatenanti, le cellule senescenti presentano alcune caratteristiche comuni, tra cui morfologia allargata, appiattita, multinucleata con grandi vacuoli, nuclei significativamente espansi, formazione di eterocromatina associata alla senescenza ricca di H3K9me3 (SAHF) nel nucleo, accumulo persistente di focolai di marcatore di danno al DNA γH2AX, p53-p21^{attivato CIP1} e Rb-p16^INK4a meccanismi di regolazione del ciclo cellulare, arresto stabile del ciclo cellulare G1, induzione massiccia di SASP e elevata attività della β-galattosidasi (SA-β-gal) associata alla senescenza¹⁴. Poiché nessun singolo marcatore è sufficiente per definire la senescenza, la colorazione enzimatica per l'attività SA-β-gal, che è considerata il gold standard per il rilevamento della senescenza, è solitamente combinata con la colorazione immunoistochimica per H3K9me3 e Ki67 per rilevare TIS¹⁵. Tuttavia, il SA-β-gal a base cromogenica chimica è difficile da quantificare. Qui, abbiamo combinato il rilevamento SA-β-gal (fSA-β-gal) a base di fluorescenza a base di fluorescenza 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galattopiranoside (C₁₂FDG) con la colorazione immunofluorescente per γH2AX e il DNA incorporato in EdU per identificare le cellule senescenti C₁₂FDG ⁺ EdU-γH2AX ⁺ utilizzando l'avanzato sistema di citometro a flusso di imaging, che combina la velocità, la sensibilità e le immagini dettagliate a singola cellula con informazioni spaziali che non possono essere fornite dalla citometria a flusso e dalla microscopia. Questo metodo consente una rapida generazione di immagini ad alta risoluzione che consentono il posizionamento e la quantificazione dei segnali fluorescenti all'interno delle celle, consentendo al contempo l'analisi rapida di più campioni mediante la costruzione di pipeline standard.

Protocollo

1. Linee cellulari DLBCL con trattamento con mafosfamide o daunorubicina per indurre la senescenza cellulare

NOTA: Il protocollo funziona anche per le cellule tumorali aderenti. A seconda delle dimensioni della cellula, il seme 1-2 × 10⁵ cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare la piastra in un incubatore al 5% di CO₂, 37 °C durante la notte prima del trattamento. I passaggi del protocollo sono gli stessi delle celle di sospensione, ma con due eccezioni. In primo luogo, le cellule devono essere tripsinate dalla piastra dopo il passaggio 3.4. In secondo luogo, le fasi di lavaggio vengono eseguite senza centrifugazione prima della tripsinizzazione.

1. Contare le cellule DLBCL e il seme 1 × 10⁶ cellule / mL in 4 mL di terreno per pozzo in una piastra di coltura a 6 pozzetti. Coltivare cellule DLBCL in mezzo RPMI-1640 integrate con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 100 U / mL di penicillina / streptomicina.
2. Aggiungere MAF (5 μg/mL) o DN (20 ng/mL) nella coltura cellulare e scuotere delicatamente la piastra per mescolare.
   NOTA: MAF e DN non sono stabili. Dopo la dissoluzione in DMSO, la soluzione madre deve essere aliquotata e conservata a -20 °C. I cicli di congelamento/scongelamento dovrebbero essere evitati.
3. Incubare la piastra in un incubatore al 5% di CO₂, 37 °C per 3 giorni.
4. Dopo un'incubazione di 3 giorni, raccogliere le cellule DLBCL in tubi di centrifuga sterili da 15 ml e ruotare a 100 × g, 4 °C per 5 minuti.
5. Scartare il surnatante, risospesciare i pellet cellulari con 4 ml di mezzo fresco e aggiungere nuovamente le sospensioni nella piastra a 6 pozzetti.
6. Coltivare la piastra cellulare in un incubatore al 5% di CO₂, 37 °C per altri 2 giorni prima della raccolta per l'analisi.

2. Preparare soluzioni per la colorazione (Tabella 1)

3. Macchie di cellule DLBCL con diversi marcatori di senescenza

NOTA: i campioni di cellule colorati con singoli marcatori (ad esempio, pacific blue-EdU, C₁₂FDG o Alexa Fluor 647-γH2AX) sono preparati per generare una matrice di compensazione per correggere lo spillover di fluorescenza durante la misurazione. Sebbene altamente consigliato, questo passaggio potrebbe essere sospeso quando vi è una sovrapposizione omitabile (valore del coefficiente di compensazione ≤ 0,1) degli spettri di emissione tra diversi fluorofori. Tuttavia, gli utenti devono determinare passaggi di compensazione standardizzati quando si utilizzano diversi strumenti e pannelli fluorescenti.

1. Aggiungere una soluzione edU da 10 mM con un rapporto di 1:1.000 nella coltura cellulare DLBCL generata dal passaggio 1.6 (la concentrazione finale di EdU è di 10 μM). Scuotere delicatamente la piastra per mescolare e incubare in un incubatore al 5% di CO₂, 37 °C per 3 ore.
2. Estrarre la piastra dall'incubatore e aggiungere 100 mM di soluzione di clorochina ad una concentrazione finale di 75 μM (vedere discussione). Scuotere delicatamente la piastra per mescolare e incubare in un incubatore al 5% di CO₂, 37 °C per 30 minuti.
3. Estrarre la piastra dall'incubatore e aggiungere una soluzione di 20 mM C₁₂FDG a 1: 1.000 a una concentrazione finale di C₁₂FDG di 20 μM. Scuotere delicatamente la piastra per mescolare e incubare in un incubatore al 5% di CO₂, 37 °C per 1 ora.
4. Estrarre la piastra dall'incubatore e aggiungere 100 mM di soluzione di 2-feniletil-β-D-tiogalattoside (PETG) a 1:50 per interrompere la colorazione fSA-β-gal (concentrazione finale di PETG di 2 mM). Ruotare delicatamente la piastra per mescolare.
5. Trasferire le cellule in tubi centrifughi sterili da 15 mL e ruotare a 100 × g, 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante e lavare le cellule con 4 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
6. Ripetere la fase di lavaggio PBS. Scartare il surnatante e risospesciare i pellet cellulari in 500 μL di soluzione di fissazione della paraformaldeide al 4%.
7. Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare a 250 × g, temperatura ambiente per 5 min. Scartare il surnatante e lavare le cellule con 4 ml di PBS.
8. Ripetere la fase di lavaggio PBS. Scartare il surnatante, risospesere il pellet cellulare in 200 μL di tampone di permeabilizzazione della saponina e trasferire la sospensione in un nuovo tubo da 1,5 mL. Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare a 250 × g, temperatura ambiente per 5 min.
9. Scartare il surnatante e risospese i pellet cellulari in 200 μL di soluzione anticorpale primaria (anticorpo 1:500 γH2AX in soluzione di incubazione anticorpale). Incubare a 4 °C durante la notte al buio.
10. Centrifugare i tubi a 250 × g, 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante e lavare con 100 μL di soluzione di lavaggio di saponina.
11. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. Scartare il surnatante e risospesciare i pellet cellulari in 500 μL di cocktail di rilevamento EdU.
12. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Centrifuga a 250 × g, temperatura ambiente per 5 min. Scartare il surnatante e lavare con 1 mL di soluzione di lavaggio di saponina.
13. Ripetere la fase di lavaggio due volte. Scartare il surnatante e risospescere i pellet cellulari in 20-50 μL di PBS. Passare alla sezione 4 per la misurazione del campione.

4. Imaging dei marcatori di senescenza utilizzando il sistema di citometro a flusso di imaging

1. Svuotare la bottiglia del fluido di scarico. Controllare i livelli di velocità perline, sterilizzatori, detergenti, debolbbler, guaine e reagenti di risciacquo (acqua deionizzata) per garantire liquidi sufficienti prima di accendere lo strumento (vedere la Tabella dei materiali).
2. Accendere lo strumento e il software di imaging (vedere l'interfaccia software nella Figura 1A).
3. Fare clic sul pulsante di avvio per inizializzare la fluidica e la calibrazione del sistema.
   Nota : questa procedura richiede circa 45 min.
4. Imposta l'ingrandimento su 40x, imposta la velocità fluidica su bassa e accendi i laser necessari nell'esperimento. Attiva i laser a 405 nm, 488 nm e 642 nm per misurare rispettivamente Il blu EdU-Pacifico, C₁₂FDG e Alexa Fluor 647-γH2AX (o Alexa Fluor 647-Ki67). Impostare Ch6 per canale scatter e Ch1 e Ch9 per brightfield.
5. Inizia con il campione che dovrebbe avere la più alta fluorescenza per impostare l'intensità dei laser. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare. Aprire il coperchio del tubo e inserire il tubo campione sul dock. Fare clic su Carica per iniziare.
6. Aprite un grafico a dispersione e selezionate le feature Area_M01 e Aspect Ratio_M01 rispettivamente per gli assi X e Y. Impostare un gate sopra le proporzioni di 0,5 per escludere i doppietti e gli aggregati di celle sotto e sul lato destro e la popolazione di perline di velocità sul lato sinistro (Figura 1B).
7. Aprite un plottaggio di istogramma e selezionate la feature Sfumatura RMS_M01_Ch01 per l'asse X. Scegliere la popolazione singoletta e impostare il gate da selezionare per le celle focalizzate (Figura 1C).
   NOTA: il sistema di imaging utilizzerà automaticamente le perle di velocità per regolare la messa a fuoco per l'imaging. Tuttavia, si consiglia di selezionare la metà destra del picco dell'istogramma per la popolazione più focalizzata.
8. Aprite un plottaggio di istogrammi e selezionate Intensità pixel massime non elaborate per l'asse X per ogni canale di colore (Ch2, 7 e 11). Regola le potenze laser (ad esempio, 488 nm, 405 nm e 642 nm laser per Ch2, 7 e 11, rispettivamente), in modo che ogni fluorocromo abbia un valore raw max Pixel compreso tra 100 e 4.000 per evitare la sovrasaturazione.
   NOTA: per questo esperimento, l'impostazione della potenza laser è di 50 mW, 200 mW e 50 mW per i laser 488 nm, 405 nm e 642 nm, rispettivamente.
9. Scegli la popolazione focalizzata da registrare e fai clic su Acquisisci per misurare i campioni DLBCL con impostazioni coerenti. Quando si cambiano i campioni per la misurazione, fare clic su Ritorna per recuperare la provetta del campione. Premere Carica per eliminare il campione.
10. Dopo aver misurato tutti i campioni, spegnere il campo luminoso e il laser a dispersione. Misurare campioni di controllo monocolore per generare una matrice di compensazione.
11. Fare clic su Arresta per chiudere il sistema di imaging.
12. Analizza i dati nel software di analisi delle immagini.
    1. Utilizza lo strumento Spot Wizard del software di analisi delle immagini per contare e quantificare automaticamente i focolai nucleari γH2AX nelle immagini di cellule vive. Selezionare due popolazioni di cellule (una con alto e una con basso numero di spot) per addestrare la procedura guidata spot per un'ulteriore analisi automatica del conteggio spot.

Risultati

Una matrice di compensazione è stata generata utilizzando un software di analisi delle immagini caricando i dati registrati dei campioni di controllo a colore singolo. Come mostrato nella Figura supplementare S1, è stata rilevata una ricaduta della luce non trascurabile (valore del coefficiente ≥ 0,1) da EdU a C₁₂FDG con valore del coefficiente di diafonia 0,248, mentre la diafonia tra gli altri canali non era significativa. Quattro diverse linee cellulari DLBCL sono state trattate con 5 ?...

Discussione

Questo metodo ha esaminato la capacità di ingresso in senescenza di quattro diverse linee cellulari DLBCL durante il trattamento chemioterapico, con imaging a campo luminoso e quantificazione basata sulla citometria a flusso. A livello di singola cellula, abbiamo rilevato con successo le principali popolazioni senescenti C₁₂FDG ^{+ EdU-Ki67 +} nelle cellule TRATTATE KARPAS422 e WSU-DLCL2 e, in misura minore, nelle cellule OCI-LY1, mentre la linea cellulare SU-DHL6 era resistente ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575