Imagerie simultanée et détection par cytométrie en flux de plusieurs marqueurs de sénescence fluorescents dans les cellules cancéreuses sénescentes induites par le traitement

Résumé

Nous présentons ici une méthode basée sur la cytométrie en flux pour la visualisation et la quantification de plusieurs marqueurs associés à la sénescence dans des cellules individuelles.

Résumé

Les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire des dommages irréparables à l’ADN dans les cellules cancéreuses, conduisant à l’apoptose ou à la sénescence prématurée. Contrairement à la mort cellulaire apoptotique, la sénescence est une machinerie fondamentalement différente qui restreint la propagation des cellules cancéreuses. Des décennies d’études scientifiques ont révélé les effets pathologiques complexes des cellules cancéreuses sénescentes dans les tumeurs et les microenvironnements qui modulent les cellules cancéreuses et les cellules stromales. De nouvelles preuves suggèrent que la sénescence est un facteur pronostique puissant pendant le traitement du cancer, et donc une détection rapide et précise des cellules sénescentes dans les échantillons de cancer est essentielle. Cet article présente une méthode pour visualiser et détecter la sénescence induite par le traitement (TIS) dans les cellules cancéreuses. Les lignées cellulaires diffuses de lymphome à grandes cellules B (LDGCB) ont été traitées avec du mafosfamide (MAF) ou de la daunorubicine (DN) et examinées pour le marqueur de sénescence, la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal), le marqueur de synthèse de l’ADN 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et le marqueur de dommages à l’ADN gamma-H2AX (γH2AX). L’imagerie par cytomètre en flux peut aider à générer des images unicellulaires à haute résolution en peu de temps pour visualiser et quantifier simultanément les trois marqueurs dans les cellules cancéreuses.

Introduction

Une variété de stimuli peut déclencher la sénescence cellulaire, amenant les cellules à entrer dans un état d’arrêt stable du cycle cellulaire. Ces stimuli comprennent des changements de signalisation intrinsèques ou des stress extrinsèques. Les signaux intrinsèques comprennent le raccourcissement progressif des télomères, les changements dans la structure des télomères, la modification épigénétique, les troubles de la protéostase, le dysfonctionnement mitochondrial et l’activation des oncogènes. Les stress extrinsèques comprennent les signaux de dommages inflammatoires et/ ou tissulaires, les traitements radiologiques ou chimiques et la privation nutritionnelle ^1,2,3,4. Parmi les types distincts de sénescence, les plus fréquemment observés et les mieux étudiés sont la sénescence réplicative, la sénescence induite par l’oncogène (OIS), la sénescence radio-induite et la sénescence induite par la thérapie (TIS). L’OIS est une réponse cellulaire aiguë aux dommages génotoxiques causés par le stress réplicatif généré par l’activation aberrante de l’oncogène et peut dans une certaine mesure empêcher la progression pathologique d’une lésion prénéoplasique à une tumeur à part entière. TiS se produit lorsque les cellules tumorales sont stressées par des médicaments chimiothérapeutiques ou^des rayonnements ionisants ^5,6.

La sénescence est considérée comme une épée à double tranchant en pathologie en raison de sa nature très dynamique. Il a été initialement décrit comme un mécanisme bénéfique de suppression de tumeur pour éliminer les cellules endommagées du pool circulant de cellules en division, préservant le fonctionnement normal des organes et inhibant la croissance tumorale ^7,8,9. Cependant, de nouvelles preuves ont suggéré un côté sombre de la sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent des cytokines pro-inflammatoires, connues sous le nom de phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP), conduisant à la fibrose et aux organes défectueux et favorisant l’initiation et la progression de la tumeur¹⁰. De plus, les cellules cancéreuses sénescentes subissent une reprogrammation épigénétique et d’expression génique parallèlement au remodelage de la chromatine et à l’activation d’une réponse soutenue aux dommages à l’ADN (DDR)^11,12, acquérant de nouvelles propriétés de cellules souches cancéreuses ³. Bien que les tumeurs capables de sénescence répondent mieux à l’intervention thérapeutique que les tumeurs incapables de sénescence¹³, la persistance des cellules sénescentes peut entraîner un mauvais pronostic à long terme si elles ne sont pas efficacement identifiées et éliminées par les médicaments sénolytiques⁵. Quoi qu’il en soit, une méthode fiable pour évaluer la sénescence présente un intérêt clinique important, non seulement pour le pronostic du traitement thérapeutique, mais également pour le développement de nouvelles stratégies ciblant les cellules sénescentes.

Indépendamment des différents déclencheurs, les cellules sénescentes présentent certaines caractéristiques communes, notamment une morphologie élargie, aplatie et multinucléée avec de grandes vacuoles, des noyaux significativement dilatés, la formation d’hétérochromatine associée à la sénescence (SAHF) riche en H3K9me3 dans le noyau, l’accumulation persistante de foyers de marqueurs de dommages à l’ADN γH2AX, activé p53-p21^CIP1 et Rb-p16^INK4a les mécanismes de régulation du cycle cellulaire, l’arrêt stable du cycle cellulaire G1, l’induction massive de SASP et l’activité élevée de la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal)¹⁴. Étant donné qu’aucun marqueur unique n’est suffisant pour définir la sénescence, la coloration enzymatique pour l’activité SA-β-gal, qui est considérée comme l’étalon-or pour la détection de la sénescence, est généralement associée à une coloration immunohistochimique pour H3K9me3 et Ki67 pour détecter TIS¹⁵. Cependant, le SA-β-gal chimique à base de chromogène est difficile à quantifier. Ici, nous avons combiné la détection de SA-β-gal (fSA-β-gal) à base de fluorescence 5-dodécanoylaminofluorescéine-di-β-D-galactopyranoside (_C12FDG) à base de fluorescence SA-β-gal) avec une coloration immunofluorescente pour l’ADN incorporé à γH2AX et EdU pour identifier les cellules sénescentes_C12FDG ⁺ EdU-γH2AX ⁺ à l’aide du système de cytomètre en flux d’imagerie avancée, qui combine la vitesse, la sensibilité et les images unicellulaires détaillées avec des informations spatiales qui ne peuvent pas être fournies par la cytométrie en flux et la microscopie. Cette méthode permet la génération rapide d’images haute résolution permettant le positionnement et la quantification des signaux fluorescents dans les cellules, tout en autorisant l’analyse rapide de plusieurs échantillons en construisant des pipelines standard.

Protocole

1. Lignées cellulaires du LDGCB avec traitement au mafosfamide ou à la daunorubicine pour induire la sénescence cellulaire

REMARQUE: Le protocole fonctionne également pour les cellules cancéreuses adhérentes. Selon la taille de la cellule, ensemencez 1 à 2 × 10⁵ cellules dans un puits d’une plaque de 6 puits et incubez la plaque dans un incubateur à 5% de CO₂, 37 ° C pendant la nuit avant le traitement. Les étapes du protocole sont les mêmes que pour les cellules de suspension, mais à deux exceptions près. Tout d’abord, les cellules doivent être trypsinisées sur la plaque après l’étape 3.4. Deuxièmement, les étapes de lavage sont effectuées sans centrifugation avant la trypsinisation.

1. Compter les cellules du LDGCB et ensemencer 1 × 10⁶ cellules/mL dans 4 mL de milieu par puits dans une plaque de culture de 6 puits. Cultiver des cellules du LDGCB dans un milieu RPMI-1640 complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 100 U / mL de pénicilline / streptomycine.
2. Ajouter le MAF (5 μg/mL) ou le DN (20 ng/mL) dans la culture cellulaire et bercer doucement la plaque pour mélanger.
   REMARQUE : MAF et DN ne sont pas stables. Après dissolution dans le DMSO, la solution mère doit être aliquotedée et stockée à -20 °C. Les cycles de gel/dégel doivent être évités.
3. Incuber la plaque dans un incubateur à 5% de CO₂, 37 °C pendant 3 jours.
4. Après une incubation de 3 jours, prélever les cellules DLBCL dans des tubes centrifuges stériles de 15 mL et les faire tourner à 100 × g, 4 °C pendant 5 min.
5. Jetez le surnageant, remettez en suspension les granulés de cellule avec 4 mL de milieu frais et ajoutez les suspensions dans la plaque à 6 puits.
6. Cultivez la plaque cellulaire dans un incubateur à 5 % de CO₂, 37 °C pendant encore 2 jours avant de la récolter pour analyse.

2. Préparer les solutions pour la coloration (tableau 1)

3. Tacher les cellules DLBCL avec différents marqueurs de sénescence

REMARQUE: Les échantillons cellulaires colorés avec des marqueurs individuels (c.-à-d. bleu-EdU pacifique, C₁₂FDG ou Alexa Fluor 647-γH2AX) sont préparés pour générer une matrice de compensation afin de corriger le débordement de fluorescence pendant la mesure. Bien que fortement suggérée, cette étape pourrait être suspendue lorsqu’il y a un chevauchement omis (valeur du coefficient de compensation ≤ 0,1) des spectres d’émission entre différents fluorophores. Cependant, les utilisateurs doivent déterminer des étapes de compensation normalisées lorsqu’ils utilisent différents instruments et panneaux fluorescents.

1. Ajouter une solution d’EdU de 10 mM dans un rapport de 1:1 000 dans la culture cellulaire DLBCL générée à partir de l’étape 1.6 (la concentration finale d’EdU est de 10 μM). Bercez doucement la plaque pour mélanger et incuber dans un incubateur à 5% de CO₂, 37 °C pendant 3 h.
2. Sortez la plaque de l’incubateur et ajoutez une solution de chloroquine de 100 mM à une concentration finale de 75 μM (voir la discussion). Bercez doucement la plaque pour mélanger et incuber dans un incubateur à 5% de CO₂, 37 °C pendant 30 min.
3. Sortir la plaque de l’incubateur et ajouter 20 mM de solution de FDG en_C12à 1:1 000 à une concentration finale de_C12FDG de 20 μM. Secouez doucement la plaque pour mélanger et incuber dans un incubateur à 5 % de CO₂, 37 °C pendant 1 h.
4. Sortez la plaque de l’incubateur et ajoutez 100 mM de solution de 2-phényléthyl-β-D-thiogalactoside (PETG) à 1:50 pour arrêter la coloration fSA-β-gal (concentration finale de PETG de 2 mM). Faites pivoter doucement la plaque pour mélanger.
5. Transférer les cellules dans des tubes centrifuges stériles de 15 mL et tourner à 100 × g, 4 °C pendant 5 min. Jetez le surnageant et lavez les cellules avec 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
6. Répétez l’étape de lavage PBS. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 500 μL de solution de fixation de paraformaldéhyde à 4 %.
7. Après 10 min d’incubation à température ambiante, centrifuger à 250 × g, température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et laver les cellules avec 4 mL de PBS.
8. Répétez l’étape de lavage PBS. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de perméabilisation de la saponine et transférer la suspension dans un nouveau tube de 1,5 mL. Après 10 min d’incubation à température ambiante, centrifuger à 250 × g, température ambiante pendant 5 min.
9. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 200 μL de solution d’anticorps primaires (anticorps 1:500 γH2AX dans une solution d’incubation d’anticorps). Incuber à 4 °C pendant la nuit dans l’obscurité.
10. Centrifuger les tubes à 250 × g, 4 °C pendant 5 min. Jeter le surnageant et laver avec 100 μL de solution de lavage à la saponine.
11. Répétez l’étape de lavage deux fois de plus. Jetez le surnageant et remettez en suspension les pastilles cellulaires dans 500 μL de cocktail de détection EdU.
12. Incuber à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité. Centrifuger à 250 × g, température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et laver avec 1 mL de solution de lavage à la saponine.
13. Répétez l’étape de lavage deux fois. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 20 à 50 μL de PBS. Passez à la section 4 pour la mesure de l’échantillon.

4. Marqueurs de sénescence d’imagerie à l’aide du système de cytomètre en flux d’imagerie

1. Videz le flacon de liquide résiduaire. Vérifiez les niveaux de perles de vitesse, de stérilisateur, de nettoyant, de débublant, de gaine et de réactifs de rinçage (eau désionisée) pour vous assurer qu’il y a suffisamment de liquides avant d’allumer l’instrument (voir le tableau des matériaux).
2. Allumez l’instrument et le logiciel d’imagerie (voir l’interface du logiciel à la Figure 1A).
3. Cliquez sur le bouton Démarrage pour initialiser la fluidique et l’étalonnage du système.
   REMARQUE: Cette procédure prend environ 45 min.
4. Réglez le grossissement sur 40x, réglez la vitesse fluidique sur faible et allumez les lasers nécessaires à l’expérience. Activez les lasers 405 nm, 488 nm et 642 nm pour mesurer respectivement le bleu EdU-pacifique, le C₁₂FDG et l’Alexa Fluor 647-γH2AX (ou Alexa Fluor 647-Ki67). Réglez Ch6 pour le canal de diffusion et Ch1 et Ch9 pour le champ lumineux.
5. Commencez par l’échantillon qui devrait avoir la fluorescence la plus élevée pour mettre en place l’intensité des lasers. Retournez doucement le tube d’échantillon pour mélanger. Ouvrez le couvercle du tube et insérez le tube d’échantillonnage sur la station d’accueil. Cliquez sur Charger pour commencer.
6. Ouvrez un nuage de points et sélectionnez les fonctions Area_M01 et Aspect Ratio_M01 pour les axes X et Y, respectivement. Définissez une porte au-dessus du rapport d’aspect de 0,5 pour exclure les doublets et les agrégats de cellules en dessous et sur le côté droit, ainsi que la population de billes de vitesse sur le côté gauche (Figure 1B).
7. Ouvrez un histogramme et sélectionnez la fonction Dégradé RMS_M01_Ch01 pour l’axe X. Choisissez la population de singlets et définissez la porte pour sélectionner les cellules focalisées (Figure 1C).
   REMARQUE: Le système d’imagerie utilisera automatiquement des perles de vitesse pour ajuster la mise au point pour l’imagerie. Cependant, il est recommandé de sélectionner la moitié droite du pic d’histogramme pour la population la mieux ciblée.
8. Ouvrez un histogramme et sélectionnez Intensités maximales de pixels brutes pour l’axe X pour chaque couche de couleur (Ch2, 7 et 11). Ajustez les puissances laser (c’est-à-dire les lasers 488 nm, 405 nm et 642 nm pour les lasers Ch2, 7 et 11, respectivement), de sorte que chaque fluorochrome ait une valeur Raw Max Pixel comprise entre 100 et 4 000 pour éviter une sursaturation.
   REMARQUE: Pour cette expérience, le réglage de la puissance laser est de 50 mW, 200 mW et 50 mW pour les lasers 488 nm, 405 nm et 642 nm, respectivement.
9. Choisissez la population ciblée à enregistrer et cliquez sur Acquérir pour mesurer les échantillons DLBCL avec des paramètres cohérents. Lorsque vous changez d’échantillon pour la mesure, cliquez sur Retour pour récupérer le tube d’échantillon. Appuyez sur Charger pour ignorer l’exemple.
10. Une fois tous les échantillons mesurés, éteignez le laser à champ lumineux et diffusez. Mesurez des échantillons de contrôle unicolores pour générer une matrice de compensation.
11. Cliquez sur Arrêter pour fermer le système d’imagerie.
12. Analysez les données dans le logiciel d’analyse d’images.
    1. Utilisez l’outil Spot Wizard du logiciel d’analyse d’images pour compter et quantifier automatiquement les foyers nucléaires γH2AX dans les images de cellules vivantes. Sélectionnez deux populations de cellules (une avec un nombre de points élevé et une avec un nombre de points faible) pour entraîner l’assistant de spot pour une analyse automatique du nombre de points.

Résultats

Une matrice de compensation a été générée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images en chargeant les données enregistrées d’échantillons de contrôle unicolores. Comme le montre la figure supplémentaire S1, un débordement de lumière non négligeable (valeur du coefficient ≥ 0,1) de l’EdU au_C12FDG a été détecté avec une valeur de coefficient de diaphonie de 0,248, tandis que la diaphonie entre les autres canaux n’était pas significative. Quatre lignées cellulai...

Discussion

Cette méthode a examiné la capacité d’entrée de sénescence de quatre lignées cellulaires différentes de LDGCB lors d’un traitement de chimiothérapie, avec une imagerie en champ lumineux et une quantification basée sur la cytométrie en flux. Au niveau unicellulaire, nous avons détecté avec succès d’importantes populations sénescentes C₁₂FDG^+EdU-Ki67+ dans les cellules KARPAS422 et WSU-DLCL2 traitées, et dans une moindre mesure dans les cellules OCI-LY1, tand...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575