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요약

여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.

초록

화학 요법 약물은 암세포에서 돌이킬 수없는 DNA 손상을 유도하여 아폽토시스 또는 조기 노화를 유발할 수 있습니다. 세포사멸 세포 사멸과는 달리, 노화는 암세포의 번식을 억제하는 근본적으로 다른 기계이다. 수십 년간의 과학적 연구는 암세포와 기질 세포를 조절하는 종양 및 미세 환경에서 노인성 암 세포의 복잡한 병리학 적 효과를 밝혀 냈습니다. 새로운 증거는 노화가 암 치료 중 강력한 예후 인자이므로 암 샘플에서 노화 세포의 신속하고 정확한 검출이 필수적임을 시사합니다. 이 논문은 암세포에서 치료 유도 노화 (TIS)를 시각화하고 검출하는 방법을 제시합니다. 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) 세포주를 마포스파미드 (MAF) 또는 다우노루비신 (DN)으로 처리하고, 노화 마커, 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal), DNA 합성 마커 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU), 및 DNA 손상 마커 감마-H2AX (γH2AX)에 대해 조사하였다. 유세포 분석기 이미징은 단기간에 고해상도 단일 세포 이미지를 생성하여 암세포의 세 가지 마커를 동시에 시각화하고 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

다양한 자극은 세포 노화를 유발하여 세포가 안정된 세포 주기 정지 상태로 진입하게 할 수 있습니다. 이러한 자극에는 내재적 신호 변화 또는 외적 스트레스가 포함됩니다. 내재적 신호에는 진행성 텔로미어 단축, 텔로미어 구조의 변화, 후성유전학적 변형, 프로테오스타시스 장애, 미토콘드리아 기능장애, 종양유전자의 활성화가 포함된다. 외인성 스트레스에는 염증 및/또는 조직 손상 신호, 방사선 또는 화학적 치료, 영양 결핍 1,2,3,4가 포함됩니다. 뚜렷한 유형의 노화 중에서 가장 일반적으로 볼 수 있고 잘 연구 된 것은 복제 노화, 종양 유전자 유도 노화 (OIS), 방사선 유도 노화 및 치료 유도 노화 (TIS)입니다. OIS는 비정상적인 종양유전자 활성화에 의해 생성된 복제 스트레스에 의해 야기되는 유전독성 손상에 대한 급성 세포 반응이며, 신생물성 병변으로부터 본격적인 종양으로의 병리학적 진행을 어느 정도 예방할 수 있다. TIS는 종양 세포가 화학 요법 약물 또는 이온화 방사선 5,6에 의해 스트레스를 받을 때 발생합니다.

노화는 매우 역동적 인 특성으로 인해 병리학에서 양날의 검으로 간주됩니다. 처음에는 분열 세포의 순환 풀에서 손상된 세포를 제거하고 장기의 정상적인 기능을 보호하고 종양 성장 7,8,9을 억제하는 유익한 종양 억제 메커니즘으로 설명되었습니다. 그러나 새로운 증거는 노화의 어두운면을 시사했다. 노화 세포는 노화 관련 분비 표현형(SASP)으로 알려진 전염증성 사이토카인을 분비하여, 섬유증 및 기능성 기관을 유도하고 종양 개시 및 진행을 촉진한다(10). 더욱이, 노년기 암세포는 후성유전학적 및 유전자-발현 리프로그래밍을 통해 크로마틴 리모델링 및 지속적인 DNA-손상 반응(DDR)11,12의 활성화와 병행하여, 새로운 암-줄기-세포 특성을 새롭게 획득한다3. 노화가 가능한 종양은 노화가 불가능한 종양(13)에 비해 치료 개입에 더 잘 반응하지만, 노화 세포의 지속성은 혈청용해제에 의해 효과적으로 확인되고 제거되지 않으면 장기간 예후가 좋지 않을 수 있다5. 어느 쪽이든, 노화를 평가하는 신뢰할 수있는 방법은 치료 치료의 예후뿐만 아니라 노인 세포를 목표로하는 새로운 전략 개발에도 중요한 임상 적 관심사입니다.

다른 트리거에 관계없이, 노화 세포는 큰 액포를 갖는 확대, 평탄화, 다핵 형태학, 상당히 확장된 핵, 핵에서 H3K9me3 풍부 노화 관련 헤테로크로마틴(SAHF)의 형성, DNA 손상 마커 γH2AX 초점의 지속적인 축적, 활성화된 p53-p21CIP1 및 Rb-p16INK4a 등 몇 가지 공통된 특징을 나타낸다. 세포 주기 조절 메카니즘, 안정한 G1 세포 주기 정지, SASP의 대규모 유도, 및 상승된 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal) 활성14. 노화를 정의하기에 충분한 단일 마커가 없기 때문에, 노화 검출의 황금 표준으로 간주되는 SA-β-gal 활성에 대한 효소 염색은 일반적으로 TIS15를 검출하기 위해 H3K9me3 및 Ki67에 대한 면역 조직화학 염색과 결합됩니다. 그러나, 화학적 염색체-기반 SA-β-gal은 정량화하기가 어렵다. 여기에서는 5-도데카노일아미노플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드(C12 FDG) 형광 기반 SA-β-gal(fSA-β-gal) 검출을 γH2AX 및 EdU 혼입 DNA에 대한 면역형광 염색과 결합하여 속도, 감도 및 상세한 단일 세포 이미지를 유세포 분석기 및 현미경으로 제공할 수 없는 공간 정보와 결합한 고급 이미징 유세포 분석기 시스템을 사용하여C12FDG+EdU-γH2AX+ 노인 세포를 확인했습니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 이미지를 신속하게 생성할 수 있으므로 세포 내에서 형광 신호를 배치하고 정량화할 수 있으며, 표준 파이프라인을 구축하여 여러 샘플을 신속하게 분석할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 노화를 유도하기 위해 마포스파미드 또는 다우노루비신 처리를 이용한 DLBCL 세포주

참고: 이 프로토콜은 부착성 암세포에도 적용됩니다. 세포 크기에 따라, 시드 1-2 × 10개의 5개 세포를 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 넣고 플레이트를5 %CO2, 37°C 인큐베이터에서 밤새 처리 전에 인큐베이션한다. 프로토콜 단계는 서스펜션 셀과 동일하지만 두 가지 예외가 있습니다. 먼저, 세포는 단계 3.4 후에 플레이트 밖으로 트립신화될 필요가 있다. 둘째, 세척 단계는 트립신화 전에 원심분리 없이 수행된다.

  1. DLBCL 세포를 계수하고 1 × 10 6 세포/mL를 웰당 배지 4 mL에 넣고6 -웰 배양 플레이트에 넣는다. DLBCL 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하십시오.
  2. MAF (5 μg / mL) 또는 DN (20 ng / mL)을 세포 배양물에 넣고 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하십시오.
    참고: MAF 및 DN은 안정적이지 않습니다. DMSO에 용해시킨 후, 원액을 분취하여 -20°C에서 보관해야 한다. 동결 / 해동 사이클은 피해야합니다.
  3. 플레이트를 3일 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
  4. 3일간 배양한 후, DLBCL 세포를 15 mL 멸균 원심분리 튜브에 수집하고, 100 × g, 4°C에서 5분 동안 스핀시켰다.
  5. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 4 mL의 신선한 배지로 재현탁시키고, 현탁액을 다시 6-웰 플레이트에 첨가한다.
  6. 세포 플레이트를 분석을 위해 수확하기 전에 또 다른 2일 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 배양한다.

2. 염색용 용액 준비(표 1)

3. 다른 노화 마커를 갖는 염색 DLBCL 세포

참고: 개별 마커(즉, 퍼시픽 블루-EdU,C12FDG 또는 알렉사 플루오르 647-γH2AX)로 염색된 세포 샘플은 측정 동안 형광 유출을 보정하기 위해 보상 매트릭스를 생성하도록 준비된다. 고도로 제안되었지만, 이 단계는 상이한 형광단들 사이에서 방출 스펙트럼들의 생략가능한 중첩(보상 계수 값 ≤ 0.1)이 있을 때 현탁될 수 있다. 그러나 사용자는 다른 기기와 형광 패널을 사용할 때 표준화 된 보상 단계를 결정해야합니다.

  1. 1:1,000의 비율로 10 mM EdU 용액을 단계 1.6에서 생성된 DLBCL 세포 배양물에 첨가한다(최종 EdU 농도는 10 μM이다). 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 3시간 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
  2. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 100 mM 클로로퀸 용액을 최종 농도 75 μM로 첨가한다 (논의 참조). 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 30분 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
  3. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 20 mMC12FDG 용액을 1:1,000에서 20 μM의 최종 C12FDG 농도에 첨가한다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
  4. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 1:50에 100 mM 2-페닐에틸-β-D-티오갈락토시드(PETG) 용액을 첨가하여 fSA-β-gal 염색을 중단시켰다(최종 PETG 농도 2 mM). 플레이트를 부드럽게 돌려 혼합합니다.
  5. 세포를 15 mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고 100 × g, 4°C에서 5분 동안 스핀한다. 상청액을 버리고 세포를 4 mL의 인산완충식염수(PBS)로 세척한다.
  6. PBS 세척 단계를 반복한다. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 500 μL의 4% 파라포름알데히드 고정 용액에 재현탁시킨다.
  7. 실온에서 10분 인큐베이션한 후, 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 세포를 PBS 4 mL로 세척한다.
  8. PBS 세척 단계를 반복한다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 사포닌 투과화 완충액에 재현탁시키고, 현탁액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 실온에서 10분 인큐베이션한 후, 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다.
  9. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 200 μL의 일차 항체 용액 (항체 인큐베이션 용액 중 1:500 γH2AX 항체)에 재현탁시킨다. 어둠 속에서 하룻밤 동안 4°C에서 인큐베이션한다.
  10. 튜브를 250 × g, 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 100 μL의 사포닌 세척 용액으로 세척한다.
  11. 세척 단계를 추가로 두 번 반복하십시오. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 500 μL의 EdU 검출 칵테일에 재현탁시킨다.
  12. 어둠 속에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 사포닌 세척액 1mL로 세척한다.
  13. 세척 단계를 두 번 반복하십시오. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 PBS의 20-50 μL에 재현탁시킨다. 샘플 측정을 위해 섹션 4로 진행하십시오.

4. 이미징 유세포 분석기 시스템을 사용하여 노화 마커 이미징

  1. 폐액 병을 비우십시오. 장비를 켜기 전에 충분한 유체를 확보하기 위해 속도 비드, 멸균기, 클리너, 디버블러, 시스 및 헹굼 시약 (탈 이온수)의 수준을 확인하십시오 ( 재료 표 참조).
  2. 계측기 및 이미징 소프트웨어를 켭니다( 그림 1A의 소프트웨어 인터페이스 참조).
  3. 시작 버튼을 클릭하여 유체 공학 및 시스템 교정을 초기화합니다.
    참고: 이 절차는 약 45분 정도 걸립니다.
  4. 배율을 40x로 설정하고 유체 속도를 낮게 설정한 다음 실험에 필요한 레이저를 켭니다. 405nm, 488nm 및 642nm 레이저를 켜서 EdU-pacific blue,C12FDG 및 Alexa Fluor 647-γH2AX(또는 Alexa Fluor 647-Ki67)를 각각 측정합니다. 분산형 채널에는 Ch6을, 브라이트필드에는 Ch1과 Ch9를 설정합니다.
  5. 레이저의 강도를 설정하기 위해 가장 높은 형광을 가질 것으로 예상되는 샘플부터 시작하십시오. 샘플 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 튜브 뚜껑을 열고 샘플 튜브를 도크에 삽입합니다. 로드 를 클릭하여 시작하십시오.
  6. 산점도를 열고 X축과 Y축에 대해 각각 Area_M01 피쳐와 종횡비 Ratio_M01을 선택합니다. 게이트를 종횡비 0.5 이상으로 설정하여 아래와 오른쪽의 더블릿 및 셀 응집체를 제외하고, 왼쪽에는 스피드 비드 모집단을 제외합니다(그림 1B).
  7. 히스토그램 플롯을 열고 X축에 대한 그라디언트 RMS_M01_Ch01 피쳐를 선택합니다. 일중항 모집단을 선택하고 집중된 셀을 선택할 게이트를 설정합니다(그림 1C).
    주: 이미징 시스템은 자동으로 스피드 비드를 사용하여 이미징을 위한 초점을 조정합니다. 그러나 가장 집중된 모집단에 대해 히스토그램 피크의 오른쪽 절반을 선택하는 것이 좋습니다.
  8. 히스토그램 플롯을 열고 각 색상 채널(Ch2, 7 및 11)에 대해 X축에 대해 원시 최대 픽셀 강도를 선택합니다. 레이저 파워(즉, Ch2, 7 및 11의 경우 각각 488nm, 405nm 및 642nm 레이저)를 조정하여 과포화를 피하기 위해 각 형광색이 100에서 4,000 사이의 원시 최대 픽셀 값을 갖도록 합니다.
    참고: 이 실험에서 레이저 전력 설정은 레이저 488nm, 405nm 및 642nm의 경우 각각 50mW, 200mW 및 50mW입니다.
  9. 기록할 집중 모집단을 선택하고 획득 을 클릭하여 일관된 설정으로 DLBCL 샘플을 측정합니다. 측정을 위해 샘플을 변경할 때 반환 을 클릭하여 샘플 튜브를 복구하십시오. 로드 를 눌러 샘플을 삭제 합니다.
  10. 모든 샘플이 측정 된 후 밝은 필드와 산란 레이저를 끕니다. 단색 제어 샘플을 측정하여 보정 매트릭스를 생성합니다.
  11. 종료를 클릭하여 이미징 시스템을 닫습니다.
  12. 이미지 분석 소프트웨어의 데이터를 분석합니다.
    1. 이미지 분석 소프트웨어의 스팟 마법사 도구를 사용하여 라이브 셀 이미지에서 핵 γH2AX 초점을 자동으로 계산하고 정량화할 수 있습니다. 두 개의 세포 집단(하나는 높은 세포와 낮은 반점 카운트)을 선택하여 추가 자동 스팟 카운트 분석을 위해 스팟 마법사를 훈련시킵니다.

결과

보상 매트릭스는 단색 제어 샘플의 기록된 데이터를 로딩하여 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. 보충 그림 S1에 나타난 바와 같이, EdU에서 C12 FDG로의 무시할 수 없는(계수 값 ≥0.1) 광 유출은 누화 계수 값 0.248로 검출된 반면, 다른 채널들 사이의 누화는 유의하지 않았다. 네 개의 상이한 DLBCL 세포주를 5 μg/mL MAF 또는 20 ng/mL DN로 처리하여 세포 노화를 유도하고 ?...

토론

이 방법은 화학 요법 치료시 네 개의 다른 DLBCL 세포주의 노화 진입 능력을 밝은 필드 이미징 및 유세포 측정 기반 정량화로 조사했습니다. 단일 세포 수준에서, 우리는 처리 된 KARPAS422 및 WSU-DLCL2 세포에서 주요C12 FDG + EdU-Ki67 + 노인성 집단을 성공적으로 검출했으며, OCI-LY1 세포에서는 SU-DHL6 세포주가 치료에 내성을 갖는 반면, OCI-LY1 세포에서는 더 적은 정도까지 성?...

공개

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 Johannes Kepler University Linz (BERM16108001)의 Yong Yu에 대한 보조금으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) AntibodyBiolegend613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)Fisher Scientific11590276
Chloroquin -diphosphatSigma aldrichC6628
Cleanser (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay KitThermo ScientificC10418
DaunorubicinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)Millipore1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)LuminexCN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamide cyclohexylamineNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydeFisher Scientific11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) Sigma aldrichP4902
saponinSigma aldrich47036
SheathMilliporeBSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStreamLuminex400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)VWRJT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575

참고문헌

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