治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

要約

ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。

要約

化学療法薬は、癌細胞に回復不能なDNA損傷を誘発し、アポトーシスまたは早期老化をもたらす可能性がある。アポトーシス細胞死とは異なり、老化は癌細胞の増殖を抑制する根本的に異なる機構である。何十年にもわたる科学的研究により、がん細胞や間質細胞を調節する腫瘍や微小環境における老化がん細胞の複雑な病理学的影響が明らかになってきました。新しい証拠は、老化が癌治療中の強力な予後因子であることを示唆しているため、癌サンプル中の老化細胞の迅速かつ正確な検出が不可欠である。本稿では、がん細胞における治療誘発性老化(TIS)を可視化・検出する方法を提示する。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)細胞株をマフォスファミド(MAF)またはダウノルビシン(DN)で処理し、老化マーカー、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)、DNA合成マーカー5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)、およびDNA損傷マーカーγ-H2AX(γH2AX)について調べた。フローサイトメーターイメージングは、高解像度の単一細胞画像を短時間で生成し、がん細胞の3つのマーカーを同時に視覚化および定量化するのに役立ちます。

概要

様々な刺激が細胞老化を誘発し、細胞が安定した細胞周期停止の状態に入る原因となり得る。これらの刺激には、内因性シグナル伝達変化または外因性ストレスが含まれる。内因性シグナルには、進行性テロメア短縮、テロメア構造の変化、エピジェネティック修飾、プロテオスタシス障害、ミトコンドリア機能障害、および癌遺伝子の活性化が含まれる。外因性ストレスには、炎症性および/または組織損傷シグナル、放射線または化学的処置、および栄養欠乏^{が含まれる}1,2,3,4。異なるタイプの老化の中で、最も一般的に見られ、よく研究されているのは、複製性老化、癌遺伝子誘発性老化(OIS)、放射線誘発性老化、および治療誘発性老化(TIS)である。OISは、異常な癌遺伝子活性化によって生じる複製ストレスによって引き起こされる遺伝毒性損傷に対する急性細胞応答であり、腫瘍前病変から本格的な腫瘍への病理学的進行をある程度防ぐことができる。TISは、腫瘍細胞が化学療法薬または電離放射線によってストレスを受けているときに起こります^5,6。

老化は、その非常にダイナミックな性質のために病理学において諸刃の剣と考えられている。当初、分裂細胞の循環プールから損傷細胞を除去し、臓器の正常な機能を保護し、腫瘍増殖を阻害する有益な腫瘍抑制機構として記載されていた^7,8,9。しかし、新たな証拠は老化の暗い側面を示唆している。老化細胞は、老化関連分泌表現型(SASP)として知られる炎症誘発性サイトカインを分泌し、線維症および機能不全の器官をもたらし、腫瘍の開始および進行を促進する¹⁰。さらに、老化癌細胞は、クロマチンリモデリングおよび持続的DNA損傷応答(DDR)^11,12の活性化と並行してエピジェネティックおよび遺伝子発現リプログラミングを受け、新たに新しい癌幹細胞特性を獲得する³。老化可能な腫瘍は、老化が不可能な腫瘍と比較して治療介入に対してよりよく応答するが¹³、老化細胞の持続性は、それらが血清分解薬によって効果的に同定および排除されない場合、長期予後不良につながる可能性がある⁵。いずれにせよ、老化を評価するための信頼できる方法は、治療治療の予後だけでなく、老化細胞を標的とする新規戦略の開発にとっても、重要な臨床的関心がある。

異なるトリガーにかかわらず、老化細胞は、大きな液胞を有する拡大、扁平化、多核形態、有意に拡張された核、核内のH3K9me3リッチ老化関連ヘテロクロマチン(SAHF)の形成、DNA損傷マーカーγH2AX病巣の持続的な蓄積、活性化p53-p21^{CIP1およびRb-p16 INK4a}を含むいくつかの共通の特徴を示す。 細胞周期調節機構、安定したG1細胞周期停止、SASPの大量誘導、および老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−gal)活性の上昇¹⁴。老化を定義するのに十分な単一のマーカーはないため、老化検出のゴールドスタンダードと考えられているSA-β-gal活性の酵素染色は、通常、H3K9me3およびKi67の免疫組織化学染色と組み合わせてTIS¹⁵を検出します。しかしながら、化学的発色系SA−β−galは定量化が困難である。ここでは、5-ドデカノイルアミノフルオレセイン-ジ-D-ガラクトピラノシド(_C12FDG)蛍光ベースのSA-β-gal(fSA-β β-gal)検出とγH2AXおよびEdU組み込みDNAの免疫蛍光染色を組み合わせて、速度、感度、詳細な単一細胞画像とフローサイトメトリーおよび顕微鏡では提供できない空間情報を組み合わせた高度なイメージングフローサイトメーターシステムを使用して、_C12 ^FDG+EdU-γH2AX⁺老化細胞を同定しました。この方法により、細胞内の蛍光シグナルの位置決めと定量を可能にする高解像度画像の迅速な生成が可能になり、標準パイプラインを構築することで複数のサンプルの迅速な分析がライセンスされます。

プロトコル

1. 細胞老化を誘導するマフォスファミドまたはダウノルビシン処理によるDLBCL細胞株

注:このプロトコルは、付着がん細胞に対しても機能します。細胞サイズに応じて、種子1〜2×¹⁰⁵ 個の細胞を6ウェルプレートの1ウェルに浸し、処理前にプレートを5%_CO2、37°Cインキュベーター中で一晩インキュベートする。プロトコルの手順は浮遊細胞の場合と同じですが、2 つの例外があります。まず、ステップ3.4の後に細胞をプレートからトリプシン処理する必要があります。第2に、洗浄工程は、トリプシン処理の前に遠心分離なしで行われる。

1. DLBCL細胞および種子1×106細胞/mLを¹ ウェルあたり4mLの培地でカウントし、6ウェル培養プレートに入れます。10%ウシ胎児血清(FBS)および100U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地でDLBCL細胞を培養する。
2. MAF(5 μg/mL)またはDN(20 ng/mL)を細胞培養物に加え、プレートを静かに揺らして混合します。
   メモ: MAF と DN は安定していません。DMSOに溶解した後、原液を小分けし、-20°Cで保存すべきである。 凍結/解凍サイクルは避けるべきです。
3. プレートを5%_CO2、37°Cのインキュベーター内で3日間インキュベートする。
4. 3日間のインキュベーション後、DLBCL細胞を15mL滅菌遠沈管に集め、100× g、4°Cで5分間スピンさせた。
5. 上清を捨て、細胞ペレットを4 mLの新鮮な培地で再懸濁し、懸濁液を6ウェルプレートに戻します。
6. 分析のために回収する前に、細胞プレートを5%_CO2、37°Cのインキュベーター内でさらに2日間培養する。

2. 染色用溶液の調製(表1)

3. 異なる老化マーカーでDLBCL細胞を染色する

注:個々のマーカー(パシフィックブルーEdU、C₁₂FDG、またはAlexa Fluor 647-γH2AX)で染色された細胞サンプルは、測定中の蛍光スピルオーバーを補正するための補償マトリックスを生成するために調製されます。強く示唆されていますが、異なる蛍光色素分子間で発光スペクトルの省略可能な重複(補償係数値≤0.1)がある場合、このステップは中断される可能性があります。ただし、ユーザーは、異なる機器や蛍光パネルを使用する場合、標準化された補償手順を決定する必要があります。

1. ステップ1.6から生成したDLBCL細胞培養物に10mM EdU溶液を1:1,000の割合で加える(最終EdU濃度は10μM)。プレートを穏やかに揺らして混合し、5%_CO2、37°Cのインキュベーター内で3時間インキュベートする。
2. プレートをインキュベーターから取り出し、100 mM クロロキン溶液を終濃度 75 μM になるように加えます (ディスカッションを参照)。プレートを穏やかに揺らして混合し、5%_CO2、37°Cのインキュベーター内で30分間インキュベートする。
3. プレートをインキュベーターから取り出し、₂₀mM C 12 FDG 溶液を 1:1,000 で加え、最終 C₁₂FDG 濃度 20 μM にします。プレートを静かに揺らして混合し、5%_CO2、37 °C インキュベーター内で 1 時間インキュベートします。
4. プレートをインキュベーターから取り出し、100 mM 2-フェニルエチル-β-D-チオガラクトシド(PETG)溶液を1:50で加えて、fSA-β-gal染色(最終PETG濃度2 mM)を停止します。プレートを静かに回転させて混合します。
5. 細胞を15mL滅菌遠沈管に移し、100 × g、4°Cで5分間スピンさせた。上清を捨て、4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄する。
6. PBS洗浄工程を繰り返す。上清を捨て、細胞ペレットを500μLの4%パラホルムアルデヒド固定溶液に再懸濁する。
7. 室温で10分間インキュベートした後、250× gで遠心分離機、室温で5分間培養する。上清を捨て、4mLのPBSで細胞を洗浄する。
8. PBS洗浄工程を繰り返す。上清を捨て、細胞ペレットを200 μLのサポニン透過バッファーに再懸濁し、懸濁液を新しい1.5 mLチューブに移します。室温で10分間インキュベートした後、250× gで遠心分離機、室温で5分間培養する。
9. 上清を捨て、細胞ペレットを200 μLの一次抗体溶液(抗体インキュベーション溶液中の1:500 γH2AX抗体)に再懸濁する。暗所で一晩4°Cでインキュベートする。
10. チューブを250 × g、4°Cで5分間遠心分離する。上清を捨て、100μLのサポニン洗浄液で洗浄する。
11. 洗浄ステップをさらに2回繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを500μLのEdU検出カクテルに再懸濁する。
12. 暗所で室温で30分間インキュベートする。250× g、室温で5分間遠心分離する。上清を捨て、1mLのサポニン洗浄液で洗浄する。
13. 洗浄工程を2回繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを20〜50μLのPBSに再懸濁する。サンプル測定については、セクション 4 に進みます。

4. イメージングフローサイトメーターシステムを用いた老化マーカーのイメージング

1. 廃液ボトルを空にします。スピードビーズ、滅菌器、クリーナー、デバブラー、シース、すすぎ試薬(脱イオン水)のレベルをチェックして、機器の電源を入れる前に十分な液体を確認してください( 材料表を参照)。
2. 計測器とイメージングソフトウェアの電源を入れます( 図1Aのソフトウェアインタフェースを参照)。
3. スタートアップ ボタンをクリックして、 流体工学とシステムキャリブレーションを初期化します。
   メモ: この手順には約 45 分かかります。
4. 倍率を40倍に設定し、流体速度を低く設定し、実験に必要なレーザーをオンにします。405 nm、488 nm、および 642 nm レーザーをオンにして、それぞれ EdU-Pacific blue、C 12 FDG、Alexa Fluor 647-γH2AX(または Alexa Fluor 647-Ki67)を測定します。散乱チャンネルには Ch6、明視野には Ch1 と Ch9 を設定します。
5. レーザーの強度を設定するために、最も高い蛍光を有すると予想されるサンプルから始めます。サンプルチューブを静かにひっくり返して混合します。チューブの蓋を開き、サンプルチューブをドックに挿入します。 [読み込み] をクリックして開始します。
6. 散布図を開き、X 軸と Y 軸のフィーチャArea_M01とアスペクトRatio_M01をそれぞれ選択します。アスペクト比より上のゲートを0.5に設定して、下側と右側のダブレットと細胞凝集体を除外し、左側にスピードビーズ集団を除外します(図1B)。
7. ヒストグラムプロットを開き、X 軸の勾配RMS_M01_Ch01機能を選択します。一重項集団を選択し、集束した細胞を選択するゲートを設定します(図1C)。
   メモ:イメージングシステムは、自動的にスピードビーズを使用してイメージングの焦点を調整します。ただし、ヒストグラムのピークの右半分を、最も焦点を絞った母集団に対して選択することをお勧めします。
8. ヒストグラムプロットを開き、各カラーチャンネル(Ch2、7、および11)のX軸の生の最大ピクセル強度を選択します。レーザー出力を調整します (つまり、Ch2、7、および 11 のレーザーはそれぞれ 488 nm、405 nm、および 642 nm レーザー)、過飽和を避けるために、各蛍光色素の Raw Max Pixel 値が 100 ~ 4,000 になるようにします。
   メモ: この実験では、レーザー出力の設定は、レーザー 488 nm、405 nm、および 642 nm の場合、それぞれ 50 mW、200 mW、および 50 mW です。
9. 記録する焦点を絞った母集団を選択し、[ 集録] をクリックして、一貫した設定でDLBCLサンプルを測定します。測定用のサンプルを変更する場合は、[ 戻る] をクリックしてサンプルチューブを回収します。 Load を押してサンプルを 破棄 します。
10. すべてのサンプルが測定されたら、明視野と散乱レーザーをオフにします。単色コントロールサンプルを測定して補正マトリックスを生成します。
11. シャットダウンをクリックして、イメージングシステムを閉じます。
12. 画像解析ソフトでデータを解析します。
    1. 画像解析ソフトウェアの スポットウィザード ツールを使用して、生細胞画像中の核γH2AX病巣を自動的にカウントおよび定量します。2 つの細胞集団 (1 つは高い細胞集団ともう 1 つは低いスポット数) を選択して、スポットウィザードをトレーニングして、さらに自動スポットカウント分析を行います。

結果

画像解析ソフトウェアを用いて、単色対照サンプルの記録データをロードして補正マトリックスを生成した。 補足図S1に示すように、EdUからC12 FDGへの無視できない(係数値≥_0.1)光スピルオーバーはクロストーク係数値0.248で検出されましたが、他のチャネル間のクロストークは有意ではありませんでした。4つの異なるDLBCL細胞株を5μg/mL MAFまたは20ng/mL DNで処理して細胞老?...

ディスカッション

この方法は、明視野イメージングおよびフローサイトメトリーベースの定量化を用いて、化学療法治療時の4つの異なるDLBCL細胞株の老化侵入能力を調べた。単一細胞レベルでは、治療されたKARPAS422およびWSU-DLCL2細胞において主要なC₁₂ ^FDG+EdU-Ki67⁺老化集団を検出することに成功し、OCI-LY1細胞においてより少ない程度であったが、^SU-DHL6細胞株は治療に対して耐性?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575