Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

Resumen

Aquí, presentamos un procedimiento de ensayo simple y efectivo para ensayos de fosas de reabsorción utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio.

Resumen

Los osteoclastos maduros son células multinucleadas que pueden degradar el hueso a través de la secreción de ácidos y enzimas. Desempeñan un papel crucial en diversas enfermedades (por ejemplo, osteoporosis y cáncer de hueso) y, por lo tanto, son importantes objetos de investigación. In vitro, su actividad puede ser analizada por la formación de pozos de reabsorción. En este protocolo, describimos un método simple de ensayo de fosa utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio (CaP), que se pueden visualizar y cuantificar fácilmente. Los precursores de osteoclastos derivados de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se cultivaron en las placas recubiertas en presencia de estímulos osteoclastogénicos. Después de 9 días de incubación, los osteoclastos se fijaron y teñeron para obtener imágenes de fluorescencia, mientras que el recubrimiento de CaP se contrateñió con calceína. Para cuantificar el área reabsorbida, el recubrimiento de CaP en las placas se tiñó con 5% de AgNO₃ y se visualizó mediante imágenes de campo brillante. El área del pozo de reabsorción se cuantificó utilizando ImageJ.

Introducción

Los osteoclastos (AO) son macrófagos específicos del tejido derivados de células madre hematopoyéticas (HSC), que desempeñan un papel fundamental en la remodelación ósea junto con los osteoblastos¹. Los trastornos óseos inducidos por hormonas sexuales, inmunológicos y malignos que destruyen el hueso sistémica o localmente se deben al exceso de actividad osteoclástica, incluida la osteoporosis relacionada con la menopausia^{2, la} artritis reumatoide³, la enfermedad periodontal⁴, la enfermedad ósea mieloma⁵ y la metástasis ósea osteolítica⁶. Por el contrario, los defectos en la formación y función de LA OC también pueden causar osteopetrosis⁷. Las HSC se diferencian en progenitores de OC bajo la estimulación del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). En presencia tanto de M-CSF como del activador del receptor del ligando NF-κB (RANKL, símbolo del gen TNFSF11), los progenitores de OC se diferencian aún más en AO mononucleares y posteriormente se fusionan para convertirse en AO multinucleados ^8,9,10. Ambas citoquinas M-CSF y RANKL son indispensables y suficientes para la inducción de marcadores osteoclásticos como el receptor de calcitonina (CT), el activador del receptor del factor nuclear κ B (RANK), la bomba de protones V-ATPasa, la subunidad alfa del canal de cloruro 7 (CIC-7), la integrina β3, la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP, símbolo de gen ACP5), la cisteína lisosomal proteasa catepsina K (CTSK) y la metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9). Los AO activados forman una zona de sellado en la superficie ósea a través de la formación de un anillo de actina con un borde erizado^11,12. Dentro de la zona de sellado, los AO median la reabsorción a través de la secreción de protones a través de la bomba de protones V-ATPasa ^12,13, MMP9¹⁴ y CTSK¹⁵, lo que lleva a la formación de lagunas.

Para experimentos in vitro, los progenitores de OC se pueden obtener mediante la expansión de macrófagos de médula ósea del fémur y la tibia de ratones ^16,17, así como mediante el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de muestras de sangre y capas buffy 18,19,20, o por diferenciación de las células monocíticas murinas inmortalizadas RAW 264.7 ^21,22.

En el presente protocolo, describimos un ensayo de reabsorción osteoclástica en placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizando AO derivados de PBMC primarios. El método de placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizado aquí se adopta y refina a partir del método descrito anteriormente por Patntirapong et ^al.17 y Maria et ^al.21. Para obtener precursores de OC, los PBMC se aíslan por centrifugación por gradiente de densidad y se expanden como se describió anteriormente²⁰.

Protocolo

El protocolo fue revisado y aprobado por el comité de ética local (número de aprobación 287/2020B02).

1. Preparación de placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio

1. Preparación de solución madre de calcio (25 mM CaCl₂·2H₂O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O en tampón Tris)
   1. Prepare el tampón Tris de 1.0 M y ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl.
   2. Coloque un vaso de precipitados de vidrio en un agitador magnético y agregue 100 ml de tampón Tris de 1.0 M.
   3. Pesar 0,368 g de CaCl_{2·2H 2}O, 8,0 g de NaCl y 0,305 g de MgCl₂·6H₂O y disolver en tampón Tris uno por uno.
   4. Ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl. Almacene a temperatura ambiente.
2. Preparación de solución madre de fosfato (11.1 mM Na₂HPO₄· H₂O, 42 mM NaHCO₃ en tampón Tris)
   1. Coloque un vaso de precipitados de vidrio en un agitador magnético y agregue 100 ml de tampón Tris de 1.0 M.
   2. Pesar 0,158 g de Na₂HPO₄· H₂O y 0,353 g de NaHCO₃ y disolver en tampón Tris uno por uno.
   3. Ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl. Almacene a temperatura ambiente.
3. Precalcificación de placas de cultivo celular de 96 pocillos
   1. Preparar 30 ml de solución de trabajo mezclando 15 ml de tampón Tris de 1,0 M, 7,5 ml de solución de caldo de calcio (paso 1.1.4) y 7,5 ml de solución madre de fosfato (paso 1.2.3). Filtre la solución con un filtro de 0,2 μm.
   2. Prepare una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo plano. Pipetear 300 μL de solución de fosfato de calcio (paso 1.3.1.) a cada pocillo. Cubra el plato con una tapa e incube el plato a 37 °C durante 3 días.
4. Preparación de solución de fosfato de calcio (2.25 mM Na₂HPO₄· H₂O, 4 mM CaCl₂·2H₂O, 0.14 M NaCl, 50 mM Base Tris en ddH₂O)
   1. Añadir 2 mL de 1 M HCl a 40 mL de agua desionizada en un vaso de precipitados con una cuenta de agitación magnética y disolver 0,016 g de Na₂HPO₄· H₂O, 0,0295 g de CaCl₂·2H₂O, 0,409 g de NaCl y 0,303 g de base Tris uno por uno.
   2. Ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl. Agregue agua desionizada para llenar el volumen a 50 mL. Filtre la solución con un filtro de 0,2 μm.
5. Calcificación de placas de cultivo celular de 96 pocillos
   1. Aspire la solución de precalcificación de las placas de cultivo celular de 96 pocillos precalcificadas y agregue 300 μL de solución de fosfato de calcio (paso 1.4.2) a cada pocillo. Cubra las placas con una tapa e incube a 37 °C durante 1 día.
   2. Gire la placa para verter la solución y lave la placa tres veces con agua desionizada a fondo. Seque la placa inmediatamente con un secador de pelo o gas CO₂ o N₂ comprimido para mantener una superficie uniforme.
   3. Esterilizar la placa recubierta por radiación UV en un banco limpio durante 1 h. Use la placa recubierta inmediatamente o selle la placa con parafilm y guárdela a temperatura ambiente.

2. Aislamiento de PBMC de sangre periférica humana

1. Extraer 15 ml de sangre de la vena después de obtener el consentimiento informado por escrito del donante de sangre (voto ético: 287/2020B02).
2. Diluya 15 ml de sangre fresca con un volumen igual de PBS y mezcle invirtiendo el tubo varias veces o extrayendo la mezcla dentro y fuera de una pipeta.
3. Prepare un tubo cónico de 50 ml que contenga 15 ml de solución de gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll, Tabla de materiales) por tubo. Incline el tubo y coloque cuidadosamente 30 ml de muestra de sangre diluida sobre la solución de gradiente de densidad de 15 ml (muestra de sangre diluida: solución de gradiente de densidad, relación 1: 0.5-1).
   NOTA: Al superponer la muestra, preste atención a no mezclar la solución de gradiente de densidad con la muestra de sangre diluida.
4. Centrifugar a 810 x g durante 20 min a 20 °C en un rotor de cucharón basculante sin freno.
5. Aspirar la capa superior dejando la capa celular mononuclear (linfocitos, monocitos y trombocitos) sin perturbaciones en la interfase.
6. Transfiera cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
7. Llene el tubo con PBS, mezcle y centrífique a 300 x g durante 10 min a 20 °C (el freno se puede usar a partir de esta etapa).
8. Retire con cuidado el sobrenadante por completo. Resuspendir el pellet celular en 50 mL de PBS y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 20 °C. Retire con cuidado el sobrenadante por completo.
9. Para la eliminación de plaquetas, resuspender el pellet celular en 50 ml de PBS y centrifugar a 200 x g durante 10 min a 20 °C. Retire con cuidado el sobrenadante por completo.
10. Transfiera las células resuspendidas a los matraces de cultivo celular para la expansión de los progenitores de OC.

3. Expansión de los progenitores de OC

1. Resuspend PBMC en α-MEM completo (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% anfotericina B) que contienen 20 ng/mL M-CSF. PbMC de semillas a una densidad de 2,5 x 10⁵ células/^cm2. Por lo general, las células aisladas de 15-20 ml de sangre fresca se pueden sembrar en un matraz de 75 cm² (1.5-2 x 10⁷ células).
2. Alimente las células con α-MEM completo fresco que contenga 20 ng/ ml de M-CSF cada tres días hasta que las células unidas alcancen la confluencia deseada. Los rendimientos típicos son 1.5-2 x 10⁶ celdas / matraz cuando las células son 95% confluentes. Por lo general, el período de expansión dura 6 días.
   NOTA: El potencial osteoclastogénico de los precursores puede disminuir con el tiempo de cultivo prolongado.

4. Inducción de osteoclastogénesis en placas recubiertas de CaP

1. Para facilitar la adhesión celular, incubar las placas recubiertas de CaP con 50 μL de FBS durante 1 h en una incubadora de 37 °C.
2. Para separar los precursores de OC, lave el matraz con PBS dos veces para eliminar las células muertas o no adherentes. Añadir 4 mL de tripsina (Tabla de Materiales) por matraz de 75 cm² , durante 30 min.
   1. Agregue 4 ml de α-MEM completo para detener la digestión, separe cuidadosamente las células usando un raspador celular y transfiera las células a un tubo de 50 ml.
   2. Determine el número total de celdas utilizando una cámara de Neubauer o similar.
3. Pellet las células por centrifugación durante 7 min a 350 x g. Resuspend el pellet en suficiente α-MEM completo que contenga 20 ng/mL M-CSF y 20 ng/mL RANKL para obtener una concentración de 1 x 10⁶ células/mL.
4. Aspirar la solución FBS de la placa de 96 pocillos recubierta de CaP y pipeta 200 μL de suspensión celular por pocillo (2 x 10⁵ células/pocillo).
5. Incubar los precursores de OC durante el período de tiempo deseado o con los reactivos deseados relevantes para el diseño experimental. Por lo general, se puede observar un alto número de AO grandes y multinucleados después de 6 días y cuando se están formando pozos de reabsorción. Células de alimentación con medio α-MEM completo fresco que contiene 20 ng/mL M-CSF y 20 ng/mL RANKL cada tres días.
6. Al final de la incubación, lave las células con PBS dos veces, fije con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y lave con PBS nuevamente.
7. Utilice los AO fijos directamente para la tinción de fluorescencia o guárdelo a 4 °C.

5. Tinción por fluorescencia de AO y recubrimiento de CaP

1. Incubar las células fijas con tampón de permeabilización (0,1% Tritón en PBS) durante 5 min.
2. Manche los filamentos de actina con 100 μL de solución de faloidina marcada con AlexaFluor 546 en PBS durante 30 min y aspire la solución de tinción. Añadir 100 μL de solución de tinción Hoechst 33342 (10 μg/mL en PBS) durante 10 min para teñir los núcleos. También se puede utilizar DAPI.
3. Recubrimiento de CaP de tinción con 100 μL de calceína de 10 μM en PBS durante 10 min. Lavar tres veces con PBS y tomar imágenes.
4. Después de las imágenes de fluorescencia, las mismas placas se pueden usar para cuantificar el área del pozo de reabsorción mediante tinción de Von Kossa. Para hacerlo, lave las placas con agua desionizada dos veces.

6. Cuantificación del área total del pozo de reabsorción

1. Para teñir el recubrimiento de CaP con tinción de Von Kossa, incubar con 50 μL de AgNO₃ al 5% en agua desionizada por pozo bajo radiación UV durante 1 h, hasta que el recubrimiento en el fondo de los pozos se haya vuelto marrón.
2. Lave el plato tres veces con agua desionizada y tome imágenes de campo brillante. Un objetivo con poca ampliación, como un objetivo de 1,25x, se puede utilizar para capturar todo el pozo en una imagen. Esto facilita el análisis posterior de la imagen. Se pueden aplicar métodos alternativos para capturar toda el área del pozo.
3. Abrir un archivo de imagen con ImageJ: File | Abrir | Imagen | Tipo | 8 bits. Verifique la unidad de escala en la esquina inferior derecha de la imagen utilizando línea recta | Analizar | Establecer escala. Introduzca la longitud en la manta de "distancia conocida", introduzca la nueva unidad de escala en Unidad de longitud y marque la casilla Global.
4. Enumerar los parámetros de medición a analizar: Analizar | Establecer medidas. En la ventana Establecer medidas, marque las casillas Área y Límite al umbral.
5. Medir el área de pozos: Imagen | Ajustar | Umbral. En la ventana Umbral, marque la casilla Fondo oscuro y haga clic en Automático. El área de los pozos se vuelve roja. Cierre la ventana Umbral y seleccione Analizar | Medida. Guarde el archivo de resultados: archivo | Guardar como.

7. Cuantificación del número y tamaño de OC, y área normalizada del pozo de reabsorción

1. Abra una imagen de fluorescencia de osteoclastos con ImageJ y verifique la unidad de escala (consulte el paso 6.3).
2. Enumerar los parámetros de medición a analizar: Analizar | Establecer medidas. En la ventana Establecer medidas, marque la casilla Área .
3. Describa los OC mediante las selecciones de ROI Manager y Polygon: Analice | Herramientas | Gestor de ROI. Haga clic en Selecciones de polígono en el conjunto de herramientas, delinee un OC (celdas con anillo de actina y ≥ tres núcleos) y haga clic en Agregar [t] en la ventana de ROI Manager. Repita el esquema hasta que se incluyan todos los AO.
4. Medir el número y el tamaño de los OC: seleccione todos los elementos en ROI Manager y haga clic en Medir. Guarde el archivo de resultados: archivo | Guardar como (Figura 3E).
5. Mida el área del pozo de las imágenes de fluorescencia. Abra la imagen fluorescente del recubrimiento correlacionado con la imagen en el paso 7.3 y verifique la unidad de escala (consulte el paso 6.3).
   1. Enumere los parámetros de medición que se van a analizar (consulte el paso 6.4). Seleccione | de imagen Ajustar | Umbral. En la ventana Umbral, desactive todas las casillas y haga clic en Automático. El área de los pozos se vuelve roja. Cierre la ventana Umbral y seleccione Analizar | Medida. Guarde el archivo de resultados.
6. Calcule el área de pozo normalizada por número OC.

Resultados

El recubrimiento de fosfato de calcio en la parte inferior de las placas de cultivo celular se realizó en dos pasos de recubrimiento que comprenden una precalcificación de 3 días y una etapa de calcificación de 1 día. Como se muestra en la Figura 1, se obtuvo fosfato de calcio distribuido uniformemente en la parte inferior de las placas de 96 pocillos. El recubrimiento se adhirió muy bien al fondo después de los pasos de lavado realizados.

Discusión

Aquí describimos un método simple y confiable para un ensayo de reabsorción osteoclástica utilizando AO derivados y expandidos in vitro de PBMC. Las placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizadas se pueden preparar y visualizar fácilmente utilizando materiales disponibles en el laboratorio. Además de los PBMC no clasificados adoptados en este protocolo, los AO generados a partir de células monocíticas murinas²¹ y células macrófagos de médula ósea¹⁷

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Silver nitrate
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B	Biochrom	03-028-1B	Amphotericin B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Calcium chloride Dihydrate
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	fetal bovine serum
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Fixation buffer	Biolegend	420801	Paraformaldehyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Hydrochloric acid
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Recombinant Human M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Magnesium chloride
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl	Merk	S7653-250G	Sodium chloride
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate of Soda
PBS	Lonza	17-512F	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL	PeproTech	310-01	Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Recombinant cell-dissociation enzymes