Un protocole de dosage en fosse simple pour visualiser et quantifier la résorption ostéoclastique in vitro

Résumé

Nous présentons ici une procédure de dosage simple et efficace pour les essais en fosse de résorption utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium.

Résumé

Les ostéoclastes matures sont des cellules multinucléées qui peuvent dégrader les os par la sécrétion d’acides et d’enzymes. Ils jouent un rôle crucial dans diverses maladies (p. ex. ostéoporose et cancer des os) et sont donc des objets de recherche importants. In vitro, leur activité peut être analysée par la formation de fosses de résorption. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple de dosage en fosse utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium (CaP), qui peuvent être facilement visualisées et quantifiées. Des précurseurs d’ostéoclastes dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été cultivés sur les plaques revêtues en présence de stimuli ostéoclastogènes. Après 9 jours d’incubation, les ostéoclastes ont été fixés et colorés pour l’imagerie par fluorescence tandis que le revêtement CaP a été contre-coloré par la calcéine. Pour quantifier la zone résorbée, le revêtement CaP sur les plaques a été coloré avec 5% d’AgNO₃ et visualisé par imagerie en champ clair. La zone de la fosse de résorption a été quantifiée à l’aide d’ImageJ.

Introduction

Les ostéoclastes (OC) sont des macrophages spécifiques aux tissus dérivés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), jouant un rôle central dans le remodelage osseux avec les ostéoblastes¹. Les troubles osseux induits par les hormones sexuelles, immunologiques et malins qui détruisent les os de manière systémique ou locale sont dus à une activité ostéoclastique excessive, y compris l’ostéoporose liée à la ménopause², la polyarthrite rhumatoïde³, la maladie parodontale⁴, la maladie osseuse myélomateuse⁵ et les métastases osseuses ostéolytiques⁶. En revanche, des défauts dans la formation et la fonction du CO peuvent également provoquer une ostéopétrose⁷. Les CSH subissent une différenciation en progéniteurs OC sous stimulation du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF, symbole du gène ACP5). En présence à la fois de M-CSF et d’activateur de récepteur du ligand NF-κB (RANKL, symbole du gène TNFSF11), les progéniteurs OC se différencient davantage en OC mononucléaires et fusionnent ensuite pour devenir^des OC multinucléés ^8,9,10. Les cytokines M-CSF et RANKL sont indispensables et suffisantes pour l’induction de marqueurs ostéoclastiques tels que le récepteur de la calcitonine (CT), l’activateur du récepteur du facteur nucléaire κ B (RANK), la pompe à protons V-ATPase, la sous-unité alpha du canal chlorure 7 (CIC-7), l’intégrine β3, la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP, symbole du gène ACP5), la cystéine protéase lysosomale cathepsine K (CTSK) et la métallopeptidase matricielle 9 (MMP9). Les CO activés forment une zone d’étanchéité à la surface osseuse par la formation d’un anneau d’actine avec une bordure ébouriffée^11,12. Dans la zone d’étanchéité, les CO médient la résorption par la sécrétisation de protons via la pompe à protons V-ATPase ^12,13, MMP9¹⁴ et CTSK¹⁵, conduisant à la formation de lacunes.

Pour les expériences in vitro, les progéniteurs OC peuvent être obtenus par expansion des macrophages de la moelle osseuse à partir du fémur et du tibia^{de souris 16,17}, ainsi que par isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) à partir d’échantillons de sang et de pelages bouffants ^18,19,20, ou par différenciation des cellules monocytaires murines immortalisées RAW 264,7 ^21,22.

Dans le présent protocole, nous décrivons un test de résorption ostéoclastique dans des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP à l’aide d’OC dérivés de PBMC primaires. La méthode des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisée ici est adoptée et affinée à partir de la méthode décrite précédemment par Patntirapong et ^al.17 et Maria et ^al.21. Pour obtenir des précurseurs OC, les PBMC sont isolés par centrifugation par gradient de densité et élargis comme décrit précédemment²⁰.

Protocole

Le protocole a été examiné et approuvé par le comité d’éthique local (numéro d’approbation 287/2020B02).

1. Préparation de plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium

1. Préparation de la solution mère de calcium (25 mM CaCl₂·2H₂O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O dans le tampon Tris)
   1. Préparez un tampon Tris de 1,0 M et ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl.
   2. Installez un bécher en verre sur un agitateur magnétique et ajoutez 100 mL de tampon Tris de 1,0 M.
   3. Peser 0,368 g de CaCl₂·2H₂O, 8,0 g de NaCl et 0,305 g de MgCl₂·6H₂O et dissoudre dans le tampon Tris un par un.
   4. Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Conserver à température ambiante.
2. Préparation de la solution mère de phosphate (11,1 mM Na₂HPO₄· H₂O, 42 mM NaHCO₃ dans le tampon Tris)
   1. Installez un bécher en verre sur un agitateur magnétique et ajoutez 100 mL de tampon Tris de 1,0 M.
   2. Peser 0,158 g de Na₂HPO₄· _H2O et 0,353 g de NaHCO₃ et dissoudre dans le tampon Tris un par un.
   3. Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Conserver à température ambiante.
3. Pré-calcification des plaques de culture cellulaire à 96 puits
   1. Préparer 30 mL de solution de travail en mélangeant 15 mL de tampon Tris de 1,0 M, 7,5 mL de solution de calcium (étape 1.1.4) et 7,5 mL de solution mère de phosphate (étape 1.2.3). Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm.
   2. Préparez une plaque de culture cellulaire de 96 puits avec un fond plat. Pipette 300 μL de solution de phosphate de calcium (étape 1.3.1.) dans chaque puits. Couvrir la plaque avec un couvercle et incuber la plaque à 37 °C pendant 3 jours.
4. Préparation d’une solution de phosphate de calcium (2,25 mM Na₂HPO₄· H 2 O, 4 mM CaCl₂·2H₂O, 0,14 M NaCl, 50 mM De base Tris en ddH₂O)
   1. Ajouter 2 mL de 1 M HCl à 40 mL d’eau désionisée dans un bécher avec une bille d’agitation magnétique et dissoudre 0,016 g de Na₂HPO₄· _H2O, 0,0295 g de CaCl₂·2H₂O, 0,409 g de NaCl et 0,303 g de base Tris un par un.
   2. Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Ajouter de l’eau désionisée pour remplir le volume à 50 mL. Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm.
5. Calcification de plaques de culture cellulaire à 96 puits
   1. Aspirer la solution de précalcification des plaques de culture cellulaire pré-calcifiées à 96 puits et ajouter 300 μL de solution de phosphate de calcium (étape 1.4.2) à chaque puits. Couvrir les plaques avec un couvercle et incuber à 37 °C pendant 1 jour.
   2. Retournez la plaque pour verser la solution et lavez la plaque trois fois avec de l’eau désionisée à fond. Séchez immédiatement la plaque à l’aide d’un sèche-cheveux ou d’un gaz CO₂ ou_N2 comprimé pour maintenir une surface uniforme.
   3. Stériliser la plaque enduite par rayonnement UV dans un banc propre pendant 1 h. Utilisez immédiatement la plaque revêtue ou scellez la plaque avec un parafilm et conservez-la à température ambiante.

2. Isolement des PBMC du sang périphérique humain

1. Prélever 15 mL de sang dans la veine après avoir obtenu le consentement éclairé écrit du donneur de sang (vote éthique: 287/2020B02).
2. Diluer 15 mL de sang frais avec un volume égal de PBS et mélanger en inversant le tube plusieurs fois ou en tirant le mélange dans et hors d’une pipette.
3. Préparer un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de solution de gradient de densité (p. ex. Ficoll, Table des matériaux) par tube. Inclinez le tube et superposez soigneusement 30 mL d’échantillon de sang dilué sur la solution de gradient de densité de 15 mL (échantillon de sang dilué : solution de gradient de densité, rapport 1:0,5-1).
   REMARQUE: Lors de la superposition de l’échantillon, veillez à ne pas mélanger la solution de gradient de densité avec l’échantillon de sang dilué.
4. Centrifuger à 810 x g pendant 20 min à 20 °C dans un rotor à godet oscillant sans frein.
5. Aspirer la couche supérieure en laissant la couche cellulaire mononucléaire (lymphocytes, monocytes et thrombocytes) intacte à l’interphase.
6. Transférez soigneusement la couche cellulaire mononucléaire dans un nouveau tube conique de 50 mL.
7. Remplissez le tube avec du PBS, du mélange et de la centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 20 °C (le frein peut être utilisé à partir de cette étape).
8. Retirez soigneusement le surnageant complètement. Remettre en suspension la pastille de la cellule dans 50 mL de PBS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 20 °C. Retirez soigneusement le surnageant complètement.
9. Pour l’élimination des plaquettes, remettre la pastille de cellule dans 50 mL de PBS et centrifuger à 200 x g pendant 10 min à 20 °C. Retirez soigneusement le surnageant complètement.
10. Transférer les cellules remises en suspension dans des flacons de culture cellulaire pour l’expansion des progéniteurs OC.

3. Expansion des progéniteurs OC

1. Remettre en suspension les PBMC en α-MEM complets (10 % FBS, 1 % Pen/Strep, 1 % amphotéricine B) contenant 20 ng/mL M-CSF. Semez des PBMC à une densité de 2,5 x 10⁵ cellules/cm². Habituellement, les cellules isolées de 15-20 mL de sang frais peuvent être ensemencées dans une fiole de 75 cm² (1,5-2 x 10⁷ cellules).
2. Nourrissez les cellules avec du α-MEM complet frais contenant 20 ng / mL de M-CSF tous les trois jours jusqu’à ce que les cellules attachées atteignent la confluence souhaitée. Les rendements typiques sont de 1,5-2 x 10⁶ cellules / flacon lorsque les cellules sont confluentes à 95%. Habituellement, la période d’expansion dure 6 jours.
   REMARQUE: Le potentiel ostéoclastogène des précurseurs peut diminuer avec un temps de culture prolongé.

4. Induction de l’ostéoclastogenèse dans les plaques revêtues de CaP

1. Pour faciliter l’adhésion cellulaire, incuber les plaques revêtues de CaP avec 50 μL de FBS pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.
2. Pour détacher les précurseurs de CO, lavez la fiole avec du PBS deux fois pour éliminer les cellules mortes ou non adhérentes. Ajouter 4 mL de trypsine (Table des matériaux) par flacon de 75 cm² , pendant 30 min.
   1. Ajouter 4 mL de α-MEM complet pour arrêter la digestion, détacher soigneusement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférer les cellules dans un tube de 50 mL.
   2. Déterminez le nombre total de cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer ou similaire.
3. Granulés les cellules par centrifugation pendant 7 min à 350 x g. Remettre en suspension la pastille dans suffisamment de α-MEM complet contenant 20 ng/mL M-CSF et 20 ng/mL RANKL pour obtenir une concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL.
4. Aspirer la solution FBS de la plaque de 96 puits revêtue de CaP et pipette 200 μL de suspension cellulaire par puits (2 x 10⁵ cellules/puits).
5. Incuber les précurseurs OC pendant la période souhaitée ou avec les réactifs souhaités pertinents pour la conception expérimentale. Habituellement, un nombre élevé d’OC de grande taille et multinucléés peut être observé après 6 jours et lorsque des fosses de résorption se forment. Cellules d’alimentation avec un milieu α-MEM complet frais contenant 20 ng/mL de M-CSF et 20 ng/mL de RANKL tous les trois jours.
6. À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec du PBS deux fois, fixez-les avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes et lavez à nouveau avec du PBS.
7. Utilisez les CO fixes directement pour la coloration par fluorescence ou stockez-les à 4 °C.

5. Coloration par fluorescence des CO et du revêtement CaP

1. Incuber les cellules fixes avec un tampon de perméabilisation (0,1% de Triton dans PBS) pendant 5 min.
2. Colorez les filaments d’actine avec 100 μL de solution de phalloïdine marquée AlexaFluor 546 dans du PBS pendant 30 min et aspirez la solution de coloration. Ajouter 100 μL de solution de coloration Hoechst 33342 (10 μg/mL dans le PBS) pendant 10 min pour colorer les noyaux. DAPI peut également être utilisé.
3. Revêtement De coloration CaP avec 100 μL de 10 μM de calccéine dans le PBS pendant 10 min. Lavez trois fois avec PBS et prenez des images.
4. Après l’imagerie par fluorescence, les mêmes plaques peuvent être utilisées pour quantifier la zone de la fosse de résorption par coloration de Von Kossa. Pour ce faire, lavez les assiettes à l’eau désionisée deux fois.

6. Quantification de la surface totale de la fosse de résorption

1. Pour tacher le revêtement CaP avec coloration Von Kossa, incuber avec 50 μL de 5% AgNO₃ dans de l’eau désionisée par puits sous rayonnement UV pendant 1 h, jusqu’à ce que le revêtement au fond des puits soit devenu brun.
2. Lavez la plaque trois fois avec de l’eau désionisée et prenez des images en champ lumineux. Un objectif avec peu de grossissement, tel qu’un objectif 1,25x, peut être utilisé pour capturer l’ensemble du puits dans une seule image. Cela facilite l’analyse ultérieure de l’image. D’autres méthodes pour capturer toute la zone du puits peuvent être appliquées.
3. Ouvrez un fichier image avec ImageJ: File | Ouvrir | | de l’image Type | 8 bits. Vérifiez l’unité d’échelle dans le coin inférieur droit de l’image à l’aide de la ligne droite | Analyser | Définir l’échelle. Entrez la longueur dans la couverture « distance connue », entrez une nouvelle unité d’échelle dans Unité de longueur et cochez la case Global.
4. Liste des paramètres de mesure à analyser : Analyser | Définir les mesures. Dans la fenêtre Définir les mesures, cochez les cases Zone et Limite au seuil.
5. Mesurer la surface des fosses : image | Ajuster | Seuil. Dans la fenêtre Seuil, cochez la case Arrière-plan sombre et cliquez sur Auto. La zone des fosses devient rouge. Fermez la fenêtre Seuil et sélectionnez Analyser | Mesure. Enregistrez le fichier de résultats : Fichier | Enregistrer sous.

7. Quantification du nombre et de la taille du CO, et de la zone normalisée de la fosse de résorption

1. Ouvrez une image de fluorescence d’ostéoclastes avec ImageJ et vérifiez l’unité d’échelle (voir étape 6.3).
2. Liste des paramètres de mesure à analyser : Analyser | Définir les mesures. Dans la fenêtre Définir les mesures, cochez la case Zone .
3. Décrire les OC à l’aide des sélections ROI Manager et Polygon : Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Sélections de polygones dans l’ensemble d’outils, dessinez un OC (cellules avec anneau d’actine et ≥ trois noyaux) et cliquez sur Ajouter [t] dans la fenêtre gestionnaire de retour sur investissement. Répétez la description jusqu’à ce que tous les CO soient inclus.
4. Mesurer le nombre et la taille des CO : sélectionnez tous les éléments dans le Gestionnaire de retour sur investissement et cliquez sur Mesurer. Enregistrez le fichier de résultats : Fichier | Enregistrer sous (Figure 3E).
5. Mesurez la zone de fosse des images de fluorescence. Ouvrez l’image fluorescente du revêtement en corrélation avec l’image de l’étape 7.3 et vérifiez l’unité d’échelle (voir l’étape 6.3).
   1. Énumérer les paramètres de mesure à analyser (voir étape 6.4). Sélectionnez | d’image Ajuster | Seuil. Dans la fenêtre Seuil, décochez toutes les cases et cliquez sur Auto. La zone des fosses devient rouge. Fermez la fenêtre Seuil et sélectionnez Analyser | Mesure. Enregistrez le fichier de résultats.
6. Calculez la surface normalisée de la fosse par numéro OC.

Résultats

Le revêtement de phosphate de calcium sur le fond des plaques de culture cellulaire a été effectué en deux étapes de revêtement comprenant une pré-calcification de 3 jours et une étape de calcification de 1 jour. Comme le montre la figure 1, du phosphate de calcium uniformément réparti a été obtenu au fond des plaques de 96 puits. Le revêtement a très bien adhéré au fond après les étapes de lavage effectuées.

Discussion

Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique utilisant des CO dérivés et développés in vitro à partir de PBMC. Les plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisées peuvent être facilement préparées et visualisées à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. En plus des PBMC non triés adoptés dans ce protocole, les OC générés à partir de cellules monocytaires murines²¹ et de cellules macrophages de moelle oss...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Silver nitrate
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B	Biochrom	03-028-1B	Amphotericin B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Calcium chloride Dihydrate
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	fetal bovine serum
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Fixation buffer	Biolegend	420801	Paraformaldehyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Hydrochloric acid
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Recombinant Human M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Magnesium chloride
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl	Merk	S7653-250G	Sodium chloride
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate of Soda
PBS	Lonza	17-512F	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL	PeproTech	310-01	Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Recombinant cell-dissociation enzymes