インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル

要約

ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。

要約

成熟破骨細胞は、酸および酵素の分泌を介して骨を分解することができる多核細胞である。それらは様々な疾患(例えば、骨粗鬆症および骨癌)において重要な役割を果たし、したがって重要な研究対象である。 インビトロで、それらの活性は、再吸収ピットの形成によって分析することができる。このプロトコールでは、容易に可視化および定量化できるリン酸カルシウム(CaP)コーティング細胞培養プレートを用いた簡易ピットアッセイ法について記載する。ヒト末梢血単核球由来の破骨細胞前駆体(PBMC)を、破骨細胞形成刺激の存在下でコーティングプレート上で培養した。9日間のインキュベーション後、破骨細胞を固定し、蛍光イメージングのために染色し、一方、CaPコーティングをカルセインによって対比染色した。再吸収領域を定量化するために、プレート上のCaPコーティングを5%_AgNO3 で染色し、明視野画像によって可視化した。再吸収ピット面積をImageJを用いて定量した。

概要

破骨細胞(OC)は、造血幹細胞(HSC)に由来する組織特異的マクロファージであり、骨芽細胞¹とともに骨リモデリングにおいて極めて重要な役割を果たしている。骨を全身的または局所的に破壊する性ホルモン誘発性、免疫学的、および悪性骨障害は、閉経関連骨粗鬆症²、関節リウマチ³、歯周病⁴、骨髄腫骨疾患⁵、および骨溶解性骨転移⁶を含む過剰な破骨活動によるものである。対照的に、OC形成および機能の欠陥もまた、骨ペトロシス⁷を引き起こし得る。HSCは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、遺伝子記号ACP5)刺激下でOC前駆細胞に分化する。M−CSFおよびNF−κBリガンドの受容体アクチベーター(RANKL、遺伝子記号TNFSF11)の両方の存在下で、OC前駆細胞はさらに単核OCに分化し、続いて融合して多核OC8、^9、10になる。サイトカインM-CSFおよびRANKLはいずれも、カルシトニン受容体(CT)、核因子κBの受容体活....

プロトコル

このプロトコルは、地元の倫理委員会(承認番号287/2020B02)によってレビューされ、承認されました。

リン酸カルシウム被覆細胞培養プレートの作製

1. カルシウム原液の調製(トリス緩衝液中で25 mM CaCl 2·2H2O、1.37 mM NaCl、15 mM MgCl₂·_6H2O)
   1. 1.0 M トリス緩衝液を調製し、1 M HCl を使用して pH を 7.4 に調整します。
   2. マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩衝液を加える。
   3. 0.368gのCaCl_2・2H2O、8.0gのNaCl、0.305gのMgCl₂・_6H2Oの計量を行い、トリス緩衝液に1つずつ溶解する。
   4. 1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、室温で保存します。
2. リン酸塩原液の調製(11.H2O、トリス緩衝液中の_42mMNaHCO3)
   1. マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩....

結果

細胞培養プレートの底部へのリン酸カルシウムコーティングを、3日間の事前石灰化工程と1日間の石灰化工程とを含む2つのコーティング工程で行った。 図1に示すように、96穴プレートの底部に均一に分布したリン酸カルシウムが得られた。このコーティングは、洗浄工程を行った後に底部に非常によく付着した。

ディスカッション

ここでは、PBMCsから インビトロで 誘導および拡張されたOCsを用いた破骨細胞再吸収アッセイのための簡単で信頼性の高い方法を説明する。使用されるCaPコーティング細胞培養プレートは、ラボで利用可能な材料を使用して簡単に調製および視覚化することができます。このプロトコールで採用された未選別PBMCに加えて、マウス単球細胞²¹ および骨髄マクロファージ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Silver nitrate
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B	Biochrom	03-028-1B	Amphotericin B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Calcium chloride Dihydrate
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	fetal bovine serum
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Fixation buffer	Biolegend	420801	Paraformaldehyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Hydrochloric acid
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Recombinant Human M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Magnesium chloride
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl	Merk	S7653-250G	Sodium chloride
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate of Soda
PBS	Lonza	17-512F	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL	PeproTech	310-01	Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Recombinant cell-dissociation enzymes