Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

Resumo

Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.

Resumo

Os osteoclasstos maduros são células multinucleadas que podem degradar o osso através da secreção de ácidos e enzimas. Eles desempenham um papel crucial em várias doenças (por exemplo, osteoporose e câncer ósseo) e, portanto, são objetos importantes de pesquisa. In vitro, sua atividade pode ser analisada pela formação de poços de resorção. Neste protocolo, descrevemos um método simples de ensaio de poços usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio (CaP), que podem ser facilmente visualizadas e quantificadas. Precursores osteoclastas derivados de células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) foram cultivados nas placas revestidas na presença de estímulos osteoclastogênicos. Após 9 dias de incubação, os osteoclastas foram fixadas e manchadas para imagens de fluorescência, enquanto o revestimento cap foi contra-manchado por calcein. Para quantificar a área resorbedada, o revestimento cap em placas foi manchado com 5% AgNO₃ e visualizado por imagens de campo brilhante. A área do poço de resorção foi quantificada por meio do ImageJ.

Introdução

Os osteoclalts (OCs) são macrófagos específicos do tecido derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), desempenhando um papel fundamental na remodelagem óssea juntamente com os osteoblastos¹. Distúrbios ósseos induzidos por hormônios sexuais, imunológicos e malignos que destroem osso sisticamente ou localmente são devido ao excesso de atividade osteoclástica, incluindo osteoporose relacionada à menopausa², artrite reumatoide³, doença periodontal⁴, doença óssea de mieloma⁵ e metástase^{óssea osteolítica 6}. Em contraste, defeitos na formação e função de OC também podem causar osteopetrose⁷. Os HSCs sofrem diferenciação em progenitores oC sob fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). Na presença tanto do M-CSF quanto do ativador receptor de ligante NF-κB (RANKL, símbolo genético TNFSF11), os progenitores OC se diferenciam ainda mais em OCs mononucleares e, posteriormente, fundem-se para se tornarem OCs multinucleados ^8,9,10. Ambas as citocinas M-CSF e RANKL são indispensáveis e suficientes para a indução de marcadores osteoclásticos como receptor de calcitonina (TC), ativador receptor do fator nuclear κ B (RANK), bomba de prótons V-ATPase, subunidade alfa do canal 7 cloreto (CIC-7), integrin β3, fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP, símbolo genético ACP5), catarsina de cissinosa lysomal protease K (CTSK) e matriz metallopeptidase 9 (MMP9). Os OCs ativados formam uma zona de vedação na superfície óssea através da formação de um anel de actina com uma borda de babados^11,12. Dentro da zona de vedação, os OCs mediam a resorção através de prótons secretando através da bomba de prótons V-ATPase^12,13, MMP9¹⁴ e CTSK¹⁵, levando à formação de lacunas.

Para experimentos in vitro, progenitores oC podem ser obtidos pela expansão de macrófagos de medula óssea do fêmur e tíbia^16,17, bem como pelo isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) a partir de amostras de sangue e casacos buffy 18,19,20, ou pela diferenciação das células monocíticas murinas imortalizadas RAW 264,7 ^21,22.

No presente protocolo, descrevemos um ensaio de ressorção osteoclástica em placas de cultura celular revestidas de CaP usando OCs derivados de PBMCs primários. O método de placas de cultura celular revestida de CaP utilizado aqui são adotados e refinados a partir do método descrito anteriormente por Patntirapong et ^al.17 e Maria et ^al.21. Para obter precursores de OC, os PBMCs são isolados por centrifugação gradiente de densidade e expandidos como descrito anteriormente²⁰.

Protocolo

O protocolo foi revisado e aprovado pelo comitê de ética local (aprovação nº 287/2020B02).

1. Preparação de placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio

1. Preparação de solução de estoque de cálcio (25 mM CaCl₂·2H₂O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O no buffer Tris)
   1. Prepare o buffer tris de 1,0 M e ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl.
   2. Configure um béquer de vidro em um agitador magnético e adicione 100 mL de tampão tris de 1,0 M.
   3. Pesar 0,368 g de CaCl₂·2H₂O, 8,0 g de NaCl e 0,305 g de MgCl₂·6H₂O e dissolver-se no buffer Tris um a um.
   4. Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Armazenar à temperatura ambiente.
2. Preparação da solução de estoque fosfato (11,1 mM Na₂HPO₄· H₂O, 42 mM NaHCO₃ em tampão Tris)
   1. Configure um béquer de vidro em um agitador magnético e adicione 100 mL de tampão tris de 1,0 M.
   2. Pese 0,158 g de Na₂HPO₄· H₂O e 0,353 g de NaHCO₃ e dissolver-se em tampão Tris um a um.
   3. Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Armazenar à temperatura ambiente.
3. Pré-calcificação de placas de cultura celular de 96 poços
   1. Prepare 30 mL de solução de trabalho misturando 15 mL de tampão tris de 1,0 M, 7,5 mL de caldo de cálcio (etapa 1.1.4) solução e 7,5 mL de solução de estoque fosfato (etapa 1.2.3). Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm.
   2. Prepare uma placa de cultura celular de 96 poços com fundo plano. Pipeta 300 μL de solução de fosfato de cálcio (passo 1.3.1.) para cada poço. Cubra a placa com uma tampa e incubar a placa a 37 °C por 3 dias.
4. Preparação da solução de fosfato de cálcio (2,25 mM Na₂HPO₄· H₂O, 4 mM CaCl₂·2H₂O, 0,14 M NaCl, 50 mM Tris base em ddH₂O)
   1. Adicione 2 mL de 1 M HCl a 40 mL de água deionizada em um béquer com uma conta de agitação magnética e dissolva 0,016 g de Na₂HPO₄· H₂O, 0,0295 g de CaCl_{2·2H 2}O, 0,409 g de NaCl, e 0,303 g de Tris base um a um.
   2. Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl. Adicione água deionizada para encher o volume a 50 mL. Filtre a solução com um filtro de 0,2 μm.
5. Calcificação de placas de cultura celular de 96 poços
   1. Solução de pré-calcificação aspirada a partir das placas de cultura celular pré-calcificadas de 96 poços e adicionar 300 μL de solução de fosfato de cálcio (passo 1.4.2) a cada poço. Cubra as placas com tampa e incubar a 37 °C durante 1 dia.
   2. Vire a placa para derramar a solução e lave a placa três vezes com água desionizada completamente. Seque a placa imediatamente usando um secador de cabelo ou gás CO₂ ou N₂ comprimido para manter uma superfície uniforme.
   3. Esterilize a placa revestida por radiação UV em um banco limpo por 1h. Use a placa revestida imediatamente ou sele a placa com parafilme e armazene-a em temperatura ambiente.

2. Isolamento de PBMCs do sangue periférico humano

1. Retire 15 mL de sangue da veia após obter o consentimento por escrito informado do doador de sangue (voto ético: 287/2020B02).
2. Diluir 15 mL de sangue fresco com um volume igual de PBS e misturar invertendo o tubo várias vezes ou desenhando a mistura dentro e fora de uma pipeta.
3. Prepare um tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL de solução de gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll, Tabela de Materiais) por tubo. Incline o tubo e coloque cuidadosamente 30 mL de amostra de sangue diluído na solução de gradiente de densidade de 15 mL (amostra de sangue diluída: solução de gradiente de densidade, proporção de 1:0,5-1).
   NOTA: Ao sobrepor a amostra, preste atenção para não misturar a solução gradiente de densidade com a amostra de sangue diluída.
4. Centrifugar a 810 x g por 20 min a 20 °C em um rotor de balde balançando sem freio.
5. Aspirar a camada superior deixando a camada de célula mononuclear (linfócitos, monócitos e trombocitos) imperturbável na interfase.
6. Transfira cuidadosamente a camada de célula mononuclear para um novo tubo cônico de 50 mL.
7. Encha o tubo com PBS, misture e centrífuga a 300 x g por 10 min a 20 °C (o freio pode ser usado a partir desta fase).
8. Remova cuidadosamente o supernatante completamente. Resuspense a pelota celular em 50 mL de PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 20 °C. Remova cuidadosamente o supernatante completamente.
9. Para a remoção de plaquetas, resuspenque a pelota celular em 50 mL de PBS e centrífuga a 200 x g por 10 min a 20 °C. Remova cuidadosamente o supernatante completamente.
10. Transfira células resuspended para frascos de cultura celular para expansão de progenitores OC.

3. Expansão de progenitores oC

1. Resuspend PBMs em α-MEM completo (10% FBS, 1% Caneta/Estreptococos, 1% anfotericina B) contendo 20 ng/mL M-CSF. PBMCs de sementes a uma densidade de 2,5 x 10⁵ células/cm². Normalmente, células isoladas de 15-20 mL de sangue fresco podem ser semeadas em um frasco de 75 cm² (1,5-2 x 10⁷ células).
2. Alimente as células com α-MEM completos frescos contendo 20 ng/mL M-CSF todos os dias até que as células anexadas atinjam uma confluência desejada. Os rendimentos típicos são 1,5-2 x 10⁶ células/frascos quando as células são 95% confluentes. Normalmente, o período de expansão dura 6 dias.
   NOTA: O potencial osteoclastogênico dos precursores pode diminuir com o tempo de cultivo prolongado.

4. Indução de osteoclastogênese em placas revestidas de CAP

1. Para facilitar a adesão celular, incubar as placas revestidas de CaP com 50 μL de FBS por 1h em uma incubadora de 37 °C.
2. Para separar os precursores de OC, lave o frasco com PBS duas vezes para remover células mortas ou não aderentes. Adicione 4 mL de trippsina (Tabela de Materiais) por frasco de 75 cm² , por 30 min.
   1. Adicione 4 mL de α-MEM completos para parar a digestão, desprender cuidadosamente as células usando um raspador de células e transfira as células para um tubo de 50 mL.
   2. Determine o número total de células usando uma câmara de Neubauer ou similar.
3. Pelota as células por centrifugação por 7 min a 350 x g. Resuspenque a pelota em α-MEM completo suficiente contendo 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL para obter uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL.
4. Solução aspirada FBS a partir da placa revestida de CaP 96-well e pipeta 200 μL de suspensão celular por poço (2 x 10⁵ células/bem).
5. Incubar os precursores de OC para o período de tempo desejado ou com os reagentes desejados relevantes para o design experimental. Normalmente, um alto número de OCs grandes e multinucleados pode ser observado após 6 dias e quando os poços de resorção estão se formando. Células de alimentação com meio α-MEM completo fresco contendo 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL a cada três dias.
6. Ao final da incubação, lave as células com PBS duas vezes, fixe com 4% de paraformaldeído por 10 minutos e lave com PBS novamente.
7. Use os OCs fixos diretamente para coloração de fluorescência ou armazene a 4 °C.

5. Coloração de fluorescência de OCs e revestimento cap

1. Incubar as células fixas com tampão de permeabilização (Triton de 0,1% em PBS) por 5 min.
2. Coloritos de filamentos com 100 μL de solução de falotóide etiquetada AlexaFluor 546 na PBS por 30 minutos e aspirar a solução de coloração. Adicione 100 μL de solução de coloração Hoechst 33342 (10 μg/mL em PBS) por 10 minutos para coloração de núcleos. DAPI também pode ser usado.
3. Colorir revestimento CaP com 100 μL de calceina de 10 μM em PBS por 10 min. Lave três vezes com PBS e tire imagens.
4. Após a fluorescência, as mesmas placas podem ser usadas para quantificar a área do poço de resorção pela coloração de Von Kossa. Para isso, lave as placas com água deionizada duas vezes.

6. Quantificação da área total do poço de resorção

1. Para colorir o revestimento cap com coloração von Kossa, incubar com 50 μL de 5% AgNO₃ em água deionizada por poço sob radiação UV por 1h, até que o revestimento na parte inferior dos poços tenha se tornado marrom.
2. Lave a placa três vezes com água deionizada e tire imagens de campo brilhante. Um objetivo com pouca ampliação, como um objetivo de 1,25x, pode ser usado para capturar todo o poço em uma imagem. Isso facilita a análise de imagem subsequente. Métodos alternativos para capturar toda a área do poço podem ser aplicados.
3. Abra um arquivo de imagem com ImageJ: Arquivo | | | de imagem Tipo | 8 bits. Verifique a unidade de escala no canto inferior direito da imagem usando linha reta | Analisar | Definir escala. Digite o comprimento no cobertor de "distância conhecida", digite nova unidade de escala na unidade de comprimento e verifique a caixa Global.
4. Parâmetros de medição da lista a serem analisados: Analisar | Definir medidas. Na janela Definir medidas, verifique a área e o limite para caixas de limiar.
5. Medir a área dos poços: Imagem | Ajuste | O limiar. Na janela Limiar, verifique o plano de fundo escuro e clique em Auto. A área dos poços fica vermelha. Feche a janela Limiar e selecione Analisar | Meça. Salvar o arquivo de resultado: Arquivo | Salve Como.

7. Quantificação do número e tamanho do OC e área normalizada do poço de resorção

1. Abra uma imagem de fluorescência de osteoclatos com ImageJ e verifique a unidade de escala (ver passo 6.3).
2. Parâmetros de medição da lista a serem analisados: Analisar | Definir medidas. Na janela Definir medidas, verifique a caixa Área .
3. Delineie os OCs usando as seleções ROI Manager e Polygon: Analise | Ferramentas | Gerente do ROI. Clique em seleções de Polígono em toolset, delineie um OC (células com anel de actina e ≥ três núcleos) e clique em Adicionar [t] na janela ROI Manager. Repita o delineamento até que todos os OCs estejam incluídos.
4. Medir número e tamanho de OCs: Selecione todos os itens no ROI Manager e clique em Medir. Salvar o arquivo de resultado: Arquivo | Salve Como (Figura 3E).
5. Meça a área do poço de imagens de fluorescência. Abra a imagem fluorescente do revestimento correlacionada com a imagem na etapa 7.3 e verifique a unidade de escala (ver etapa 6.3).
   1. Liste parâmetros de medição a serem analisados (ver etapa 6.4). Selecione | de imagem Ajuste | O limiar. Na janela Limiar, desmarque todas as caixas e clique em Auto. A área dos poços fica vermelha. Feche a janela Limiar e selecione Analisar | Meça. Salve o arquivo de resultado.
6. Calcule a área normalizada do poço pelo número de OC.

Resultados

O revestimento de fosfato de cálcio na parte inferior das placas de cultura celular foi realizado em duas etapas de revestimento que compreendem uma pré-calcificação de 3 dias e uma etapa de calcificação de 1 dia. Como mostrado na Figura 1, o fosfato de cálcio distribuído uniformemente foi obtido na parte inferior das placas de 96 poços. O revestimento aderiu muito bem ao fundo após as etapas de lavagem realizadas.

Discussão

Aqui descrevemos um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica usando OCs derivados e expandidos in vitro a partir de PBMCs. As placas de cultura celular revestidas de CaP usadas podem ser facilmente preparadas e visualizadas usando materiais disponíveis em laboratório. Além dos PBMCs não variados adotados neste protocolo, os OCs gerados a partir de células monócíticas murinas²¹ e células macrófagos de medula óssea¹⁷ também...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Silver nitrate
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B	Biochrom	03-028-1B	Amphotericin B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Calcium chloride Dihydrate
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	fetal bovine serum
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Fixation buffer	Biolegend	420801	Paraformaldehyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Hydrochloric acid
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Recombinant Human M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Magnesium chloride
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl	Merk	S7653-250G	Sodium chloride
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate of Soda
PBS	Lonza	17-512F	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL	PeproTech	310-01	Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Recombinant cell-dissociation enzymes