시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

요약

여기에서, 우리는 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트를 이용한 재흡수 구덩이 분석을 위한 간단하고 효과적인 분석 절차를 제시한다.

초록

성숙한 파골세포는 산과 효소의 분비를 통해 뼈를 분해할 수 있는 다핵 세포입니다. 그들은 다양한 질병 (예 : 골다공증 및 골암)에서 중요한 역할을하므로 연구의 중요한 대상입니다. 시험관 내에서, 그들의 활성은 재흡수 구덩이의 형성에 의해 분석 될 수있다. 이 프로토콜에서는 인산칼슘(CaP) 코팅된 세포 배양 플레이트를 사용하는 간단한 피트 분석 방법을 설명하며, 이는 쉽게 시각화되고 정량화될 수 있습니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 유래된 파골세포 전구체를 파골세포형성 자극의 존재 하에 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 인큐베이션 9일 후, 파골세포를 고정시키고 형광 이미징을 위해 염색하는 한편, CaP 코팅은 칼세인에 의해 역염색되었다. 재흡수된 영역을 정량화하기 위해, 플레이트 상의 CaP 코팅을 5% AgNO3로 염색하고 브라이트필드 이미징에 의해 시각화하였다. 재흡수 구덩이 면적을 ImageJ를 사용하여 정량화하였다.

서문

파골세포 (OCs)는 조혈 줄기 세포 (HSCs)로부터 유래 된 조직 특이적 대식세포이며, 조골 세포¹과 함께 뼈 리모델링에 중추적 인 역할을합니다. 전신 또는 국부적으로 뼈를 파괴하는 성 호르몬 유도, 면역학적 및 악성 골 장애는 폐경기 관련 골다공증², 류마티스 관절염³, 치주 질환⁴, 골수종 골 질환⁵, 및 골용해성 골 전이⁶를 포함하는 과도한 골형성 활성에 기인한다. 대조적으로, OC 형성 및 기능의 결함은 또한 골페트로시스⁷를 야기할 수 있다. HSCs는 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF, 유전자 기호 ACP5) 자극 하에 OC 선조로 분화를 겪는다. NF-κB 리간드 (RANKL, 유전자 기호 TNFSF11)의 M-CSF 및 수용체 활성화제 둘 다의 존재하에, OC 선조는 단핵 OCs로 더 분화되고 이어서 융합되어 다핵 OCs ^8,9,10이 된다. 사이토카인 M-CSF 및 RANKL 둘 다 칼시토닌 수용체 (CT), 핵 인자 κB의 수용체 활성화제 (RANK), 양성자 펌프 V-ATPase, 클로라이드 채널 7 알파 서브유닛 (CIC-7), 인테그린 β3, 타르트레이트 내성 산 포스파타제 (TRAP, 유전자 기호 ACP5), 리소좀 시스테인 프로테아제 카텝신 K (CTSK), 및 매트릭스 메탈로펩티다제 9 (MMP9)와 같은 파골세포 마커의 유도에 필수적이며 충분하다. 활성화된 OCs는 주름진 경계(^11,12)를 갖는 액틴 링의 형성을 통해 뼈 표면 상에 밀봉 구역을 형성한다. 밀봉 영역 내에서, OCs는 양성자 펌프 V-ATPase 12,13, MMP9¹⁴ 및 CTSK¹⁵를 통해 양성자 분비를 통해 재흡수를 매개하여^, 라쿠나의 형성을 유도한다.

시험관내 실험을 위해, OC 선조는 마우스의 대퇴 골 및 경골 16,17로부터 골수 대식세포의 확장뿐만 아니라, 혈액 샘플 및 버피 코트 ^18,19,20으로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 단리에 의해, 또는 불멸화된 뮤린 단핵구 세포 RAW 264.7 ^21,22의 분화에 의해 수득될 수 ^있다.

본 프로토콜에서, 우리는 일차 PBMCs로부터 유래된 OCs를 사용하는 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트에서의 파골세포 재흡수 검정을 기술한다. 여기에 사용된 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트 방법은 Patntirapong et ^al.17 및 Maria et ^al.21에 의해 이전에 기술된 방법으로부터 채택되고 정제된다. OC 전구체를 얻기 위해, PBMCs는 밀도 구배 원심분리에 의해 단리되고 앞서 기술된 바와 같이 팽창된다(²⁰).

프로토콜

이 프로토콜은 지역 윤리위원회 (승인 번호 287/2020B02)에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 인산칼슘이 코팅된 세포배양접시의 제조

1. 칼슘 원액의 제조 (트리스 완충액 중 25 mM CaCl2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM_MgCl2·6H2O)
   1. 1.0 M 트리스 완충액을 준비하고 1 M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.
   2. 마그네틱 교반기에 유리 비커를 설치하고 1.0M Tris 버퍼 100mL를 첨가합니다.
   3. 0.368 g의 CaCl2·2H2O, 8.0 g의 NaCl, 및 0.305 g의_MgCl2·6H2O를 칭량하고 트리스 완충액에 하나씩 용해시킨다.
   4. 1 M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 실온에서 보관하십시오.
2. 인산염 원액의 제조 (11.1 mM_Na2HPO4· _H2O, 42 mM NaHCO3 트리스 완충액)
   1. 마그네틱 교반기에 유리 비커를 설치하고 1.0M Tris 버퍼 100mL를 첨가합니다.
   2. 무게 0.158 g의_Na2HPO4· _H2O및 0.353 g의 NaHCO3를 트리스 완충액에 하나씩 용해시킨다.
   3. 1 M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 실온에서 보관하십시오.
3. 96-웰 세포 배양 플레이트의 사전 석회화
   1. 1.0 M Tris 버퍼 15 mL, 칼슘 스톡 7.5 mL (단계 1.1.4) 용액 및 7.5 mL의 인산염 원액을 혼합하여 작업 용액 30 mL를 제조하였다 (단계 1.2.3). 용액을 0.2 μm 필터로 여과한다.
   2. 평평한 바닥을 가진 96-웰 세포 배양 플레이트를 준비하십시오. 300 μL의 인산칼슘 용액(단계 1.3.1)을 각 웰에 피펫한다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 플레이트를 3일 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
4. 인산칼슘 용액의 제조 (2.25 mM_Na2HPO4· _H2O, 4 mM_CaCl2·2H2O, 0.14 M NaCl,_ddH2O의 50 mM 트리스 염기)
   1. 자기 교반 비드로 비이커에 탈이온수 40 mL에 1 M HCl 2 mL를 첨가하고 0.016 g의_Na2HPO4· _H2O, 0.0295 g의_CaCl2·_2H2O, 0.409 g의 NaCl, 및 0.303 g의 트리스 염기를 하나씩 포함한다.
   2. 1 M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하십시오. 탈이온수를 첨가하여 부피를 50 mL로 채운다. 용액을 0.2 μm 필터로 여과한다.
5. 96-웰 세포 배양 플레이트의 석회화
   1. 예비석회화된 96-웰 세포 배양 플레이트로부터의 흡인물 예비석회화 용액을 300 μL의 인산칼슘 용액(단계 1.4.2)을 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 37°C에서 1일 동안 인큐베이션한다.
   2. 접시를 뒤집어 용액을 붓고 탈이온수로 접시를 세 번 철저히 씻으십시오. 균일한 표면을 유지하기 위해 헤어드라이어 또는 압축된 CO2 또는_N2 가스를 사용하여 플레이트를 즉시 건조시킨다.
   3. 코팅 된 플레이트를 1 시간 동안 깨끗한 벤치에서 UV 방사선으로 멸균하십시오. 코팅 된 플레이트를 즉시 사용하거나 플레이트를 파라 필름으로 밀봉하고 실온에서 보관하십시오.

2. 인간 말초 혈액에서 PBMC의 분리

1. 헌혈자로부터 서면 정보에 입각 한 동의를 얻은 후 정맥에서 15 mL의 혈액을 채취하십시오 (윤리적 투표 : 287/2020B02).
2. 신선한 혈액 15 mL를 동일한 부피의 PBS로 희석하고 튜브를 여러 번 뒤집거나 혼합물을 피펫 안팎으로 끌어 당겨 혼합하십시오.
3. 튜브 당 15 mL의 밀도 구배 용액 (예를 들어, Ficoll, Table of Materials)을 함유하는 50 mL 원뿔형 튜브를 준비한다. 튜브를 기울이고 희석된 혈액 샘플 30 mL를 밀도 구배 용액 15 mL 상에 조심스럽게 층으로 쌓는다(희석된 혈액 샘플: 밀도 구배 용액, 1:0.5-1 비율).
   참고 : 샘플을 오버레이 할 때 밀도 구배 용액을 희석 된 혈액 샘플과 혼합하지 않도록주의하십시오.
4. 브레이크가 없는 스윙 버킷 로터에서 20°C에서 20분 동안 810 x g 에서 원심분리한다.
5. 단핵 세포층 (림프구, 단핵구 및 혈전세포)을 간상에서 방해받지 않고 남겨두고 상층을 흡인하십시오.
6. 단핵 세포층을 새로운 50 mL 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
7. 튜브를 PBS로 채우고, 20°C에서 10분 동안 300 x g 에서 혼합하고, 원심분리한다(브레이크는 이 단계부터 사용될 수 있다).
8. 조심스럽게 상청액을 완전히 제거하십시오. 세포 펠렛을 50 mL의 PBS에 재현탁시키고, 20°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다. 조심스럽게 상청액을 완전히 제거하십시오.
9. 혈소판의 제거를 위해, 세포 펠릿을 50 mL의 PBS에 재현탁시키고, 20°C에서 10분 동안 200 x g 에서 원심분리한다. 조심스럽게 상청액을 완전히 제거하십시오.
10. OC 전구물질의 확장을 위해 재현탁된 세포를 세포 배양 플라스크로 옮긴다.

3. OC 선조의 확장

1. PBMC를 20ng/mL M-CSF 함유 완전 α-MEM(10% FBS, 1% 펜/스트렙, 1% 암포테리신 B)에 재현탁합니다. 2.5 x 10⁵ cells/^cm2의 밀도로 PBMC를 시드합니다. 보통, 15-20 mL 신선한 혈액으로부터 분리된 세포는 하나의 75^cm2 플라스크 (1.5-2 x 10⁷ 세포)에 시딩될 수 있다.
2. 부착 된 세포가 원하는 합류점에 도달 할 때까지 사흘마다 20 ng / mL M-CSF 함유 된 신선한 완전 α-MEM을 세포에 공급하십시오. 전형적인 수율은 세포가 95 % 합류 할 때 1.5-2 x 10⁶ 세포 / 플라스크입니다. 일반적으로 확장 기간은 6 일간 지속됩니다.
   참고 : 전구체의 osteoclastogenic 잠재력은 장기간의 재배 시간에 따라 감소 할 수 있습니다.

4. CaP 코팅 플레이트에서 파골세포 형성의 유도

1. 세포 부착을 용이하게 하기 위해, CaP 코팅된 플레이트를 50 μL의 FBS로 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
2. OC 전구체를 분리하기 위해, 플라스크를 PBS로 두 번 세척하여 죽은 세포 또는 비부착성 세포를 제거한다. 75^cm2 플라스크 당 트립신 4 mL (재료 표)를 30 분 동안 첨가하십시오.
   1. 4 mL의 완전한 α-MEM을 첨가하여 소화를 중지시키고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 조심스럽게 분리하고 세포를 50 mL 튜브로 옮깁니다.
   2. 노이바우어 챔버 또는 이와 유사한 것을 사용하여 총 세포 수를 결정한다.
3. 세포를 350 x g에서 7분 동안 원심분리하여 펠릿화 한다. 펠렛을 20 ng/mL M-CSF 및 20 ng/mL RANKL을 함유하는 충분한 완전한 α-MEM에 재현탁하여 1 x 10⁶ 세포/mL의 농도를 얻는다.
4. CaP 코팅된 96-웰 플레이트로부터의 흡인물 FBS 용액과 웰 당 200 μL의 세포 현탁액 피펫 (2 x 10⁵ 세포/웰).
5. OC 전구체를 원하는 시간 기간 동안 또는 실험 설계와 관련된 원하는 시약과 함께 인큐베이션한다. 일반적으로 많은 수의 크고 다핵 OC는 6 일 후에 그리고 재 흡수 구덩이가 형성 될 때 관찰 될 수 있습니다. 사흘마다 20 ng/mL M-CSF 및 20 ng/mL RANKL을 함유하는 신선한 완전 α-MEM 배지로 세포를 공급하십시오.
6. 배양이 끝나면 세포를 PBS로 두 번 세척하고, 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 다시 PBS로 세척한다.
7. 고정된 OC를 형광 염색을 위해 직접 사용하거나 4°C에서 보관한다.

5. OC 및 CaP 코팅의 형광 염색

1. 고정된 세포를 투과 완충액 (PBS 중 0.1% 트리톤)으로 5분 동안 인큐베이션한다.
2. 스테인 액틴 필라멘트를 PBS 중의 100 μL AlexaFluor 546 표지된 phalloidin 용액과 함께 30분 동안 염색 용액을 흡인하였다. 100 μL의 Hoechst 33342 염색 용액 (PBS 중 10 μg/mL)을 10분 동안 첨가하여 핵을 염색한다. DAPI도 사용할 수 있습니다.
3. 10분 동안 PBS 중의 10 μM 칼세인 중 100 μL의 오염 CaP 코팅. PBS로 세 번 씻고 이미지를 찍습니다.
4. 형광 이미징 후 동일한 플레이트를 사용하여 Von Kossa 염색에 의해 재흡수 피트 면적을 정량할 수 있다. 이렇게하려면 플레이트를 탈 이온수로 두 번 씻으십시오.

6. 총 재흡수 구덩이 면적의 정량화

1. CaP 코팅을 폰 코사 염색으로 염색하기 위해, 웰 바닥의 코팅이 갈색으로 변할 때까지 UV 방사 하에 웰 당 탈이온수 중 50 μL의 5% AgNO3와 함께 1시간 동안 인큐베이션한다.
2. 탈이온수로 접시를 세 번 씻고 밝은 필드 이미지를 찍으십시오. 1.25x 목표와 같이 배율이 거의없는 물체를 사용하여 하나의 이미지로 전체 우물을 캡처 할 수 있습니다. 이렇게 하면 후속 이미지 분석이 용이해집니다. 웰의 전체 영역을 캡처하기 위한 대안적인 방법이 적용될 수 있다.
3. ImageJ: 파일 |로 이미지 파일 열기 오픈 | 이미지 | 유형 | 8비트. 직선 |선을 사용하여 이미지의 오른쪽 아래 모서리에 있는 배율 단위를 확인합니다 . | 분석 배율을 설정합니다. "알려진 거리" 담요에 길이를 입력하고 길이 단위로 새 배율 단위를 입력한 다음 전역(Global) 확인란을 선택합니다.
4. 분석할 측정 파라미터 나열: 분석 | 측정을 설정합니다. 측정값 설정 창에서 영역 및 임계값으로 제한 상자를 선택합니다.
5. 구덩이의 면적을 측정하십시오 : 이미지 | | 조정 임계값. 임계값 창에서 어두운 배경을 선택하고 자동을 클릭합니다. 구덩이 부위가 빨간색으로 변합니다. 임계값 창을 닫고 | 분석을 선택합니다. 측정. 결과 파일 저장: 파일 | 다른 이름으로 저장.

7. OC 수 및 크기의 정량화 및 정규화 된 재 흡수 구덩이 영역

1. ImageJ로 파골세포의 형광 이미지를 열고 스케일 단위를 확인합니다(단계 6.3 참조).
2. 분석할 측정 파라미터 나열: 분석 | 측정을 설정합니다. 측정 설정 창에서 영역 상자를 선택합니다.
3. ROI 관리자 및 다각형 선택을 사용하여 OC의 개요 설명: | 분석 도구 | ROI 관리자. 도구 집합에서 다각형 선택을 클릭하고 하나의 OC(액틴 링이 있는 셀과 세 개의 핵이 ≥ 셀)에 윤곽을 표시한 다음 ROI 관리자 창에서 [t] 추가를 클릭합니다. 모든 OC가 포함될 때까지 윤곽선을 반복합니다.
4. OC의 수 및 크기 측정: ROI 관리자에서 모든 항목을 선택하고 측정을 클릭합니다. 결과 파일 저장: 파일 | 다른 이름으로 저장 (그림 3E).
5. 형광 이미지의 피트 영역을 측정합니다. 단계 7.3에서 화상과 상관된 코팅의 형광 이미지를 열고 스케일 유닛을 검증한다(단계 6.3 참조).
   1. 분석할 측정 파라미터를 나열한다(단계 6.4 참조). 이미지 | 선택 | 조정 임계값. 임계값 창에서 모든 상자의 선택을 취소하고 자동을 클릭합니다. 구덩이의 영역이 빨간색으로 바뀝니다. 임계값 창을 닫고 | 분석을 선택합니다. 측정. 결과 파일을 저장합니다.
6. OC 번호로 정규화된 피트 면적을 계산합니다.

결과

세포 배양 플레이트의 바닥에 인산칼슘 코팅은 3-일 예비 석회화 및 1-일 석회화 단계를 포함하는 두 가지 코팅 단계로 수행되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 균일하게 분포된 인산칼슘은 96-웰 플레이트의 바닥에 얻어졌다. 코팅은 세척 단계를 수행한 후에 바닥에 매우 잘 부착되었다.

토론

여기서는 PBMCs로부터 시험관내에서 유도되고 확장된 OCs를 이용한 파골세포 재흡수 분석에 대한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 사용된 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트는 실험실에서 이용 가능한 재료를 사용하여 쉽게 제조되고 시각화될 수 있다. 이 프로토콜에 채택된 분류되지 않은 PBMCs 이외에도, 뮤린 단핵구 세포(²¹ ) 및 골수 대식세포 세포(¹⁷

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Silver nitrate
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B	Biochrom	03-028-1B	Amphotericin B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Calcium chloride Dihydrate
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	fetal bovine serum
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Fixation buffer	Biolegend	420801	Paraformaldehyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Hydrochloric acid
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Recombinant Human M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Magnesium chloride
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl	Merk	S7653-250G	Sodium chloride
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate of Soda
PBS	Lonza	17-512F	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL	PeproTech	310-01	Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Recombinant cell-dissociation enzymes