Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Özet

Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.

Özet

Olgun osteoklastlar, asit ve enzimlerin salgılanması yoluyla kemiği parçalayabilen çok çekirdekli hücrelerdir. Çeşitli hastalıklarda (örneğin, osteoporoz ve kemik kanseri) çok önemli bir rol oynarlar ve bu nedenle önemli araştırma nesneleridirler. In vitro, aktiviteleri rezorpsiyon çukurlarının oluşumu ile analiz edilebilir. Bu protokolde, kolayca görselleştirilebilen ve nicelleştirilebilen kalsiyum fosfat (CaP) kaplı hücre kültürü plakalarını kullanan basit bir çukur testi yöntemi tanımlamaktayız. İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) türetilen osteoklast öncülleri, osteoklastojenik uyaranların varlığında kaplanmış plakalar üzerinde kültüre alındı. 9 günlük inkübasyondan sonra, osteoklastlar floresan görüntüleme için sabitlendi ve boyanırken, CaP kaplaması kalsein ile karşı boyandı. Emilen alanı ölçmek için, plakalar üzerindeki CaP kaplama% 5_AgNO3 ile boyandı ve parlak alan görüntüleme ile görselleştirildi. Rezorpsiyon çukuru alanı ImageJ kullanılarak ölçüldü.

Giriş

Osteoklastlar (OC'ler), hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) türetilen ve osteoblastlarla birlikte kemik yeniden şekillenmesinde önemli bir rol oynayan dokuya özgü makrofajlardır¹. Kemiği sistemik veya lokal olarak tahrip eden cinsiyet hormonuna bağlı, immünolojik ve malign kemik bozuklukları, menopoza bağlı osteoporoz², romatoid artrit³, periodontal hastalık⁴, miyelom kemik hastalığı⁵ ve osteolitik kemik metastazı⁶ dahil olmak üzere aşırı osteoklastik aktiviteye bağlıdır. Buna karşılık, OC oluşumu ve fonksiyonundaki kusurlar da osteopetroz^7'ye neden olabilir. HSC'ler, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF, gen sembolü ACP5) stimülasyonu altında OC progenitörlerine farklılaşır. Hem M-CSF hem de NF-κB ligandının reseptör aktivatörü varlığında (RANKL, gen sembolü TNFSF11), OC progenitörleri mononükleer OC'lere daha da farklılaşır ve daha sonra çok çekirdekli OC'ler ^8,9,10 olmak üzere kaynaşır. Hem sitokinler M-CSF hem de RANKL, kalsitonin reseptörü (BT), nükleer faktör κ B (RANK) reseptör aktivatörü, proton pompası V-ATPaz, klorür kanalı 7 alfa alt birimi (CIC-7), integrin β3, tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP, gen sembolü ACP5), lizozomal sistein proteaz kathepsin K (CTSK) ve matriks metallopeptidaz 9 (MMP9) gibi osteoklastik belirteçlerin indüksiyonu için vazgeçilmez ve yeterlidir. Aktif OC'ler,^11,12 numaralı fırfırlı bir aktin halkasının oluşumu yoluyla kemik yüzeyinde bir sızdırmazlık bölgesi oluşturur. Sızdırmazlık bölgesi içinde, OC'ler proton pompası V-ATPaz 12,13^, MMP9¹⁴ ve CTSK¹⁵ aracılığıyla protonları salgılayarak rezorpsiyona aracılık eder ve lakuna oluşumuna yol açar.

In vitro deneyler için, OC progenitörleri, kemik iliği makrofajlarının farelerin femurundan ve tibia 16,17'den genişlemesinin yanı sıra, insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) kan örneklerinden ve kabarık ceketlerden^18,19,20'den izole edilmesiyle veya ölümsüzleştirilmiş murin monositik hücrelerinin farklılaştırılmasıyla elde ^edilebilir.

Bu protokolde, birincil PBMC'lerden türetilen OC'leri kullanarak CaP kaplı hücre kültürü plakalarında osteoklastik rezorpsiyon testini tanımladık. Burada kullanılan CaP kaplı hücre kültürü plakaları yöntemi, daha önce Patntirapong ve ^ark.17 ve Maria ve ^ark.21 tarafından açıklanan yöntemden uyarlanmış ve rafine edilmiştir. OC öncüllerini elde etmek için, PBMC'ler yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile izole edilir ve daha önce açıklandığı gibi^{genişletilir 20}.

Protokol

Protokol yerel etik kurul tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (onay numarası 287/2020B02).

1. Kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakalarının hazırlanması

1. Kalsiyum stok çözeltisinin hazırlanması (Tris tamponunda 25 mM CaCl 2·_2H 2 O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O)
   1. 1,0 M Tris tamponu hazırlayın ve 1 M HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın.
   2. Manyetik karıştırıcı üzerine bir cam kab yerleştirin ve 100 mL 1,0 M Tris tamponu ekleyin.
   3. 0.368 g CaCl 2 ·_2H 2 O, 8.0 g NaCl ve 0.305 g MgCl₂ · 6H₂O ağırlığında olun ve Tris tamponunda birer birer çözün.
   4. 1 M HCl. Oda sıcaklığında saklayın.
2. Fosfat stok çözeltisinin hazırlanması (11,1 mM Na₂HPO₄· H₂O, Tris tamponunda 42 mM NaHCO₃ )
   1. Manyetik karıştırıcı üzerine bir cam kab yerleştirin ve 100 mL 1,0 M Tris tamponu ekleyin.
   2. 0,158 g Na₂HPO₄· ağırlığında _H2O ve 0.353 g NaHCO₃ ve Tris tamponunda tek tek çözünür.
   3. 1 M HCl. Oda sıcaklığında saklayın.
3. 96 delikli hücre kültürü plakalarının ön kalsifikasyonu
   1. 15 mL 1.0 M Tris tamponu, 7.5 mL kalsiyum stoğu (adım 1.1.4) çözeltisi ve 7.5 mL fosfat stok çözeltisi (adım 1.2.3) karıştırarak 30 mL çalışma çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreyle filtreleyin.
   2. Düz tabanlı 96 kuyucuklu bir hücre kültürü plakası hazırlayın. Her bir kuyucuğa 300 μL kalsiyum fosfat çözeltisi (adım 1.3.1.) pipetin. Plakayı bir kapakla örtün ve plakayı 3 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Kalsiyum fosfat çözeltisinin hazırlanması (2.25 mM Na₂HPO₄· H 2 O, 4 mM CaCl 2·2H₂O, 0,14 M NaCl, ddH₂ O'da 50 mM Tris tabanı)
   1. Manyetik karıştırma boncuğuna sahip bir beherde 40 mL deiyonize suya 2 mL 1 M HCl ekleyin ve 0,016 g Na₂HPO₄· çözün H2 O, 0.0295 g CaCl 2·_{2H 2}O, 0.409 g NaCl ve 0.303 g Tris baz tek tek.
   2. 1 M HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın. hacmi 50 mL'ye doldurmak için deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreyle filtreleyin.
5. 96 delikli hücre kültürü plakalarının kalsifikasyonu
   1. Önceden kalsifiye edilmiş 96 delikli hücre kültürü plakalarından ön kalsifikasyon çözeltisini aspire edin ve her bir oyuğa 300 μL kalsiyum fosfat çözeltisi (adım 1.4.2) ekleyin. Plakaları bir kapakla örtün ve 1 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. Çözeltiyi dökmek için plakayı ters çevirin ve plakayı üç kez deiyonize suyla iyice yıkayın. Düzgün bir yüzey sağlamak için plakayı hemen bir saç kurutma makinesi veya sıkıştırılmış CO 2 veya N₂ gazı kullanarak kurulayın.
   3. Kaplanmış plakayı UV radyasyonu ile temiz bir tezgahta 1 saat boyunca sterilize edin. Kaplanmış plakayı hemen kullanın veya plakayı parafilm ile kapatın ve oda sıcaklığında saklayın.

2. PBMC'lerin insan periferik kanından izolasyonu

1. Kan bağışçısından yazılı bilgilendirilmiş onam aldıktan sonra damardan 15 mL kan alın (etik oy: 287/2020B02).
2. 15 mL taze kanı eşit hacimde PBS ile seyreltin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek veya karışımı bir pipetin içine ve dışına çekerek karıştırın.
3. Tüp başına 15 mL yoğunluk gradyanı çözeltisi (örneğin, Ficoll, Malzeme Tablosu) içeren 50 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. Tüpü eğin ve 30 mL seyreltilmiş kan örneğini 15 mL yoğunluk gradyanı çözeltisine dikkatlice katlayın (seyreltilmiş kan örneği: yoğunluk gradyanı çözeltisi, 1: 0.5-1 oranı).
   NOT: Numuneyi üst üste koyarken, yoğunluk gradyanı çözeltisini seyreltilmiş kan örneği ile karıştırmamaya dikkat edin.
4. Frensiz sallanan kova rotorunda 20 °C'de 20 dakika boyunca 810 x g'de santrifüj.
5. Üst tabakayı aspire ederek mononükleer hücre tabakasını (lenfositler, monositler ve trombositler) interfazda bozulmadan bırakın.
6. Mononükleer hücre tabakasını dikkatlice yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın.
7. Tüpü PBS ile doldurun, 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de karıştırın ve santrifüj yapın (fren bu aşamadan itibaren kullanılabilir).
8. Süpernatantı dikkatlice tamamen çıkarın. Hücre peletini 50 mL PBS'de yeniden askıya alın ve 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice tamamen çıkarın.
9. Trombositlerin çıkarılması için, hücre peletini 50 mL PBS'de yeniden askıya alın ve 20 ° C'de 10 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice tamamen çıkarın.
10. OC progenitörlerinin genişlemesi için resuspended hücreleri hücre kültürü şişelerine aktarın.

3. OC progenitörlerinin genişletilmesi

1. PBMC'leri 20 ng/mL M-CSF içeren tam α-MEM'de (%10 FBS, %1 Pen/Strep, %1 amfoterisin B) yeniden askıya alın. 2,5 x 10^{5 hücre/cm2} yoğunlukta tohum PBMC'leri. Genellikle, 15-20 mL taze kandan izole edilen hücreler bir 75^cm2 şişede (1.5-2 x 10⁷ hücre) ekilebilir.
2. Hücreleri, bağlı hücreler istenen bir akıcılığa ulaşana kadar her üç günde bir 20 ng / mL M-CSF içeren taze tam α-MEM ile besleyin. Tipik verimler, hücreler% 95 birleştiğinde 1.5-2 x 10⁶ hücre / şişedir. Genellikle, genişleme süresi 6 gün sürer.
   NOT: Öncüllerin osteoklastojenik potansiyeli, ekim süresinin uzamasıyla azalabilir.

4. CaP kaplı plakalarda osteoklastogenezin indüksiyonu

1. Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için, CaP kaplı plakaları 37 °C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca 50 μL FBS ile inkübe edin.
2. OC öncüllerini ayırmak için, ölü veya yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için şişeyi PBS ile iki kez yıkayın. 30 dakika boyunca 75^cm2 şişe başına 4 mL tripsin (Malzeme Tablosu) ekleyin.
   1. Sindirimi durdurmak için 4 mL komple α-MEM ekleyin, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri dikkatlice ayırın ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
   2. Neubauer odası veya benzerini kullanarak toplam hücre sayısını belirleyin.
3. Hücreleri 350 x g'da 7 dakika santrifüjleme ile pelet edin. Pelet, 1 x 10⁶ hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için 20 ng / mL M-CSF ve 20 ng / mL RANKL içeren yeterli tam α-MEM'de yeniden askıya alın.
4. CaP kaplamalı 96 delikli plaka ve pipetten aspirat FBS çözeltisi, kuyu başına 200 μL hücre süspansiyonu (2 x 10⁵ hücre/kuyu).
5. OC öncüllerini istenen zaman diliminde veya deneysel tasarımla ilgili istenen reaktiflerle inkübe edin. Genellikle, 6 gün sonra ve rezorpsiyon çukurları oluştuğunda çok sayıda büyük ve çok çekirdekli OC gözlenebilir. Her üç günde bir 20 ng / mL M-CSF ve 20 ng / mL RANKL içeren taze komple α-MEM ortamına sahip hücreleri besleyin.
6. Kuluçka sonunda, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve tekrar PBS ile yıkayın.
7. Sabit OC'leri floresan boyama için doğrudan kullanın veya 4 °C'de saklayın.

5. OC'lerin ve CaP kaplamanın floresan boyanması

1. Sabit hücreleri 5 dakika boyunca geçirgenlik tamponu (PBS'de% 0.1 Triton) ile inkübe edin.
2. PBS'de 100 μL AlexaFluor 546 etiketli falloidin çözeltisi ile 30 dakika boyunca lekeli aktin filamentleri ve boyama çözeltisini aspire eder. Çekirdekleri boyamak için 10 dakika boyunca 100 μL Hoechst 33342 boyama çözeltisi (PBS'de 10 μg / mL) ekleyin. DAPI de kullanılabilir.
3. 10 dakika boyunca PBS'de 100 μL 10 μM kalsein ile leke CaP kaplama. PBS ile üç kez yıkayın ve fotoğraf çekin.
4. Floresan görüntülemeden sonra aynı plakalar Von Kossa boyama ile rezorpsiyon çukuru alanını ölçmek için kullanılabilir. Bunu yapmak için, plakaları iki kez deiyonize suyla yıkayın.

6. Toplam rezorpsiyon çukuru alanının nicelleştirilmesi

1. CaP kaplamayı Von Kossa boyama ile boyamak için, kuyucukların dibindeki kaplama kahverengiye dönene kadar, UV radyasyonu altında kuyu başına 50 μL% 5 AgNO₃ ile 1 saat boyunca deiyonize suda inkübe edin.
2. Plakayı üç kez deiyonize suyla yıkayın ve parlak alan görüntüleri alın. 1,25x hedefi gibi çok az büyütmeye sahip bir hedef, tüm kuyuyu tek bir görüntüde yakalamak için kullanılabilir. Bu, sonraki görüntü analizini kolaylaştırır. Kuyunun tüm alanını yakalamak için alternatif yöntemler uygulanabilir.
3. ImageJ ile bir görüntü dosyası açma: Dosya | Açık | Resim | Tip | 8 bit. Görüntünün sağ alt köşesindeki ölçek birimini Düz Çizgi | | analiz edin Ölçeği ayarlayın. "Bilinen mesafe" battaniyesine uzunluğu girin, Uzunluk birimi'ne yeni ölçek birimi girin ve Genel kutusunu işaretleyin.
4. Analiz edilecek ölçüm parametrelerini listeleyin: | analiz edin Ölçümleri ayarlayın. Ölçümleri Ayarla penceresinde, Alan ve Eşikle sınırla kutularını işaretleyin.
5. Çukurların alanını ölçme: Resim | | ayarlama Eşik. Eşik penceresinde, Koyu arka plan onay kutusunu işaretleyin ve Otomatik'i tıklatın. Çukurların alanı kırmızıya döner. Eşik penceresini kapatın ve | Çözümle'yi seçin Ölçün. Sonuç dosyasını kaydetme: Dosya | Farklı Kaydet.

7. OC sayısının ve boyutunun ve normalleştirilmiş rezorpsiyon çukuru alanının nicelleştirilmesi

1. ImageJ ile osteoklastların floresan görüntüsünü açın ve ölçek birimini doğrulayın (bkz. adım 6.3).
2. Analiz edilecek ölçüm parametrelerini listeleyin: Analiz | Ölçümleri ayarlayın. Ölçümleri Ayarla penceresinde, Alan kutusunu işaretleyin.
3. YG Yöneticisi ve Çokgen seçimlerini kullanarak OC'leri ana hatlarıyla belirtin: | analiz edin Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi. Araç setinde Poligon seçimleri'ne tıklayın, bir OC'yi (aktin halkalı ve ≥ üç çekirdeğe sahip hücreler) özetleyin ve YG Yöneticisi penceresinde [t] Ekle'ye tıklayın. Tüm OC'ler dahil edilene kadar anahat oluşturmayı tekrarlayın.
4. OC'lerin sayısını ve boyutunu ölçme: YG Yöneticisi'nde tüm öğeleri seçin ve Ölç'ü tıklayın. Sonuç dosyasını kaydetme: Dosya | Farklı Kaydet (Şekil 3E).
5. Floresan görüntülerin çukur alanını ölçün. Adım 7.3'teki görüntüyle ilişkili kaplamanın floresan görüntüsünü açın ve ölçek birimini doğrulayın (bkz. adım 6.3).
   1. Analiz edilecek ölçüm parametrelerini listeleyin (bkz. adım 6.4). Görüntü | | ayarlama Eşik. Eşik penceresinde, tüm kutuların işaretini kaldırın ve Otomatik'i tıklatın. Çukurların alanı kırmızıya döner. Eşik penceresini kapatın ve | Çözümle'yi seçin Ölçün. Sonuç dosyasını kaydedin.
6. Normalleştirilmiş çukur alanını OC numarasına göre hesaplayın.

Sonuçlar

Hücre kültürü plakalarının altındaki kalsiyum fosfat kaplama, 3 günlük ön kalsifikasyon ve 1 günlük kalsifikasyon adımından oluşan iki kaplama adımında gerçekleştirildi. Şekil 1'de gösterildiği gibi, 96 kuyucuklu plakaların dibinde eşit olarak dağılmış kalsiyum fosfat elde edilmiştir. Yapılan yıkama adımlarından sonra kaplama tabana çok iyi yapışmıştır.

Tartışmalar

Burada, PBMC'lerden in vitro olarak türetilen ve genişletilen OC'leri kullanarak osteoklastik rezorpsiyon testi için basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Kullanılan CaP kaplamalı hücre kültürü plakaları, laboratuvarda bulunan malzemeler kullanılarak kolayca hazırlanabilir ve görselleştirilebilir. Bu protokolde benimsenen sıralanmamış PBMC'lere ek olarak, murin monositik hücreler²¹ ve kemik iliği makrofaj hücreleri^{17'den üretilen OC'ler...}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Silver nitrate
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B	Biochrom	03-028-1B	Amphotericin B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Calcium chloride Dihydrate
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	fetal bovine serum
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Fixation buffer	Biolegend	420801	Paraformaldehyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Hydrochloric acid
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Recombinant Human M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Magnesium chloride
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl	Merk	S7653-250G	Sodium chloride
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate of Soda
PBS	Lonza	17-512F	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL	PeproTech	310-01	Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Recombinant cell-dissociation enzymes