פרוטוקול בדיקת בור פשוט להדמיה וכימות של ספיגה אוסטאוקלסטית במבחנה

Summary

כאן אנו מציגים הליך בדיקה פשוט ויעיל לבדיקות בור ספיגה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט.

Abstract

אוסטאוקלסטים בוגרים הם תאים רב-גרעיניים שיכולים לפרק את העצם באמצעות הפרשת חומצות ואנזימים. הם ממלאים תפקיד מכריע במחלות שונות (למשל, אוסטאופורוזיס וסרטן העצמות) ולכן הם מושאי מחקר חשובים. במבחנה, ניתן לנתח את פעילותם על ידי היווצרות של בורות ספיגה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת בדיקת בור פשוטה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט (CaP), שניתן לדמיין ולכמת בקלות. מבשרי אוסטאוקלסט שמקורם בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMCs) עברו תרבית על הלוחות המצופים בנוכחות גירויים אוסטאוקלסטוגניים. לאחר 9 ימי דגירה, אוסטאוקלסטים תוקנו והוכתמו לצורך הדמיה פלואורסצנטית בעוד שציפוי CaP הוכתם על ידי קלצין. כדי לכמת את האזור המחודש, ציפוי ה-CaP על הצלחות הוכתם ב-5% AgNO₃ והודגם על ידי הדמיית שדה בהיר. אזור בור הספיגה כומת באמצעות ImageJ.

Introduction

אוסטאוקלסטים (OCs) הם מקרופאגים ספציפיים לרקמות שמקורם בתאי גזע המטופויאטיים (HSCs), וממלאים תפקיד מרכזי בשיפוץ העצם יחד עם אוסטאובלסטים¹. הפרעות עצם הנגרמות על ידי הורמוני מין, אימונולוגיות וממאירות שהורסות את העצם באופן מערכתי או מקומי נובעות מפעילות אוסטאוקלסטית עודפת, כולל פעילות אוסטאוקלסטית נוספת הקשורה לגיל המעבר², דלקת מפרקים שגרונית³, מחלת חניכיים⁴, מחלת עצם מיאלומה⁵ וגרורות עצם אוסטאוליטיות⁶. לעומת זאת, פגמים בהיווצרות OC ובתפקוד יכולים גם הם לגרום לאוסטיאופטרוזיס⁷. HSCs עוברים התמיינות לאבות OC תחת גירוי גורם מגרה מושבה מקרופאגים (M-CSF, סמל הגן ACP5). בנוכחות הן M-CSF והן מפעיל הקולטנים של ליגנד NF-κB (RANKL, סמל הגן TNFSF11), אבות OC מתמיינים עוד יותר ל-OCs חד-גרעיניים ולאחר מכן מתמזגים והופכים ל-OCs מרובי^{גרעינים 8,9,10}. שני הציטוקינים M-CSF ו- RANKL הם הכרחיים ומספיקים להשראת סמנים אוסטאוקלסטיים כגון קולטן קלציטונין (CT), מפעיל קולטן של גורם גרעיני κ B (RANK), משאבת פרוטון V-ATPase, כלוריד ערוץ 7 תת-יחידה אלפא (CIC-7), אינטגרין β3, חומצה פוספטאז חומצה עמידה לטרטרט (TRAP, סמל הגן ACP5), ציסטאין ליזוזומי פרוטאז פרוטאז קתפסין K (CTSK), ומטריצה מטאלופטידז 9 (MMP9). OCs מופעלים יוצרים אזור איטום על פני העצם באמצעות היווצרות של טבעת אקטין עם גבול^{מקופל 11,12}. בתוך אזור האיטום, OCs מתווכים ספיגה באמצעות פרוטונים מפרישים באמצעות משאבת הפרוטונים V-ATPase^12,13, MMP9¹⁴ ו- CTSK¹⁵, מה שמוביל להיווצרות לקונה.

עבור ניסויים במבחנה, ניתן להשיג אבות OC על ידי הרחבה של מקרופאגים של מח עצם מעצם הירך והטיביה של עכברים^16,17, כמו גם על ידי בידוד של תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם אנושי (PBMCs) מדגימות דם ומצופים באפיים 18,19,20, או על ידי התמיינות של התאים המונוציטיים המורין המונצחים RAW 264.7 ^21,22.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים בדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית בלוחות תרבית תאים מצופים CaP באמצעות OCs שמקורם ב-PBMCs ראשוניים. שיטת לוחות תרבית התאים המצופה CaP המשמשת כאן מאומצת ומעודנת מהשיטה שתוארה קודם לכן על ידי Patntirapong et ^al.17 ו- Maria et ^al.21. כדי להשיג מבשרי OC, PBMCs מבודדים על ידי צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות ומורחבים כפי שתואר קודם לכן²⁰.

Protocol

הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (אישור מספר 287/2020B02).

1. הכנת צלחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט

1. הכנת תמיסת מלאי סידן (25 mM CaCl₂·2H₂O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O במאגר Tris)
   1. הכינו מאגר Tris של 1.0 M והתאימו את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl.
   2. הגדר זכוכית על מערבל מגנטי והוסף 100 מ"ל של חיץ Tris 1.0 M.
   3. שקלו 0.368 גרם של CaCl₂·2H₂O, 8.0 גרם של NaCl ו-0.305 גרם של MgCl₂·6H₂O והתמוססו ב-Tris buffer אחד אחד.
   4. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl. חנות בטמפרטורת החדר.
2. הכנת תמיסת מלאי פוספט (11.1 mM Na₂HPO₄· H₂O, 42 mM NaHCO₃ במאגר Tris)
   1. הגדר זכוכית על מערבל מגנטי והוסף 100 מ"ל של חיץ Tris 1.0 M.
   2. שקול 0.158 גרם של Na₂HPO₄· H₂O ו-0.353 גרם של NaHCO₃ ומתמוססים ב-Tris buffer אחד אחד.
   3. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl. חנות בטמפרטורת החדר.
3. הסתיידות מוקדמת של לוחות תרבית תאים של 96 בארות
   1. הכינו 30 מ"ל של תמיסת עבודה על ידי ערבוב של 15 מ"ל של 1.0 M Tris buffer, 7.5 מ"ל של תמיסת מלאי סידן (שלב 1.1.4) ו-7.5 מ"ל של תמיסת מלאי פוספט (שלב 1.2.3). סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
   2. הכינו צלחת תרבית תאים של 96 בארות עם תחתית שטוחה. פיפטה 300 μL של תמיסת סידן פוספט (שלב 1.3.1.) לכל באר. כסו את הצלחת במכסה ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
4. הכנת תמיסת סידן פוספט (2.25 mM Na₂HPO₄· H₂O, 4 mM CaCl₂·2H₂O, 0.14 M NaCl, 50 mM בסיס Tris ב- ddH₂O)
   1. הוסף 2 מ"ל של 1 M HCl עד 40 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה בכוס עם חרוז ערבוב מגנטי והמסת 0.016 גרם של Na₂HPO₄· H₂O, 0.0295 גרם של CaCl₂·2H₂O, 0.409 גרם של NaCl, ו-0.303 גרם של בסיס טריס בזה אחר זה.
   2. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות 1 M HCl. הוסף מים שעברו דה-יוניזציה כדי למלא את הנפח ל-50 מ"ל. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
5. הסתיידות של לוחות תרבית תאים של 96 בארות
   1. שאפו לתמיסת קדם-הסתיידות מלוחות תרבית התאים של 96 הקידוחים מראש והוסיפו 300 μL של תמיסת סידן פוספט (שלב 1.4.2) לכל באר. מכסים את הצלחות במכסה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד.
   2. הופכים את הצלחת כדי לשפוך את התמיסה ושוטפים את הצלחת שלוש פעמים במים שעברו דה-יוניזציה ביסודיות. מייבשים את הצלחת באופן מיידי באמצעות מייבש שיער או גז CO₂ או N₂ דחוס כדי לשמור על משטח אחיד.
   3. לעקר את הצלחת המצופה על ידי קרינת UV בספסל נקי למשך שעה אחת. השתמשו בצלחת המצופה באופן מיידי או אטמו את הצלחת בפרפילם ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר.

2. בידוד של PBMCs מדם היקפי אנושי

1. שואבים 15 מ"ל דם מהווריד לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב מתורם הדם (הצבעה אתית: 287/2020B02).
2. מדללים 15 מ"ל של דם טרי בנפח שווה של PBS ומערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים או על ידי משיכת התערובת פנימה והחוצה מתוך פיפטה.
3. הכינו צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל תמיסת שיפוע צפיפות של 15 מ"ל (לדוגמה, פיקול, טבלת חומרים) לכל צינור. הטו את הצינור ושכבו בזהירות 30 מ"ל של דגימת דם מדוללת על תמיסת שיפוע הצפיפות של 15 מ"ל (דגימת דם מדוללת: תמיסת שיפוע צפיפות, יחס של 1:0.5-1).
   הערה: בעת כיסוי המדגם, שים לב לא לערבב את תמיסת שיפוע הצפיפות עם דגימת הדם המדוללת.
4. צנטריפוגה ב 810 x g במשך 20 דקות ב 20 °C ברוטור דלי מתנדנד ללא בלם.
5. שואפים לשכבה העליונה ומשאירים את שכבת התאים החד-גרעיניים (לימפוציטים, מונוציטים ופקמבוציטים) ללא הפרעה באינטרפאזה.
6. העבר בזהירות את שכבת התא החד-גרעיני לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
7. מלאו את הצינור ב-PBS, ערבבו וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס (ניתן להשתמש בבלם משלב זה ואילך).
8. בזהירות להסיר supernatant לחלוטין. בצעו החייאה של כדור התא ב-50 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant לחלוטין.
9. להסרת טסיות דם, החייאת גלולת התא ב-50 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant לחלוטין.
10. העברת תאים שעברו החייאה לצלוחיות תרבית תאים להרחבת אבות ה-OC.

3. הרחבת אבות OC

1. PBMCs Resuspend α-MEM שלם (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% אמפוטריצין B) המכילים 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF. PBMCs זרעים בצפיפות של 2.5 x 10⁵ תאים / ס"מ². בדרך כלל, תאים מבודדים מ 15-20 מ"ל דם טרי ניתן לזרוע בבקבוק אחד 75 ס"מ² (1.5-2 x 10⁷ תאים).
2. הזן את התאים עם α-MEM שלם טרי המכיל 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF בכל יום שלישי עד שהתאים המחוברים מגיעים למפגש הרצוי. תפוקות אופייניות הן 1.5-2 x 10⁶ תאים/בקבוקונים כאשר התאים נפגשים ב-95%. בדרך כלל, תקופת ההרחבה נמשכת 6 ימים.
   הערה: הפוטנציאל האוסטיאוקלסטוגני של המבשרים יכול לרדת עם זמן גידול ממושך.

4. אינדוקציה של אוסטאוקלסטוגנזה בלוחות מצופים CaP

1. כדי להקל על הידבקות התאים, הדגירה של הלוחות המצופים CaP עם 50 μL של FBS למשך שעה אחת באינקובטור של 37 °C.
2. כדי לנתק את מבשרי ה-OC, שטפו את הבקבוקון עם PBS פעמיים כדי להסיר תאים מתים או שאינם דבקים. הוסף 4 מ"ל של טריפסין (טבלת חומרים) לכל 75 ס"מ² בקבוקונים, למשך 30 דקות.
   1. מוסיפים 4 מ"ל של α-MEM שלם כדי לעצור את העיכול, מנתקים בזהירות את התאים באמצעות מגרד תאים ומעבירים את התאים לצינור של 50 מ"ל.
   2. קבע את מספר התא הכולל באמצעות תא נויבאואר או דומה.
3. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 350 x g. בצעו שימוש חוזר בכדור α-MEM שלם מספיק המכיל 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF ו-20 ננוגרם/מ"ל RANKL כדי לקבל ריכוז של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל.
4. תמיסת FBS משואפת מצלחת CaP מצופה 96 קידוחים ופיפטה 200 μL של תרחיף התא לבאר (2 x 10⁵ תאים/באר).
5. דגירה של מבשרי ה- OC לתקופת הזמן הרצויה או עם הריאגנטים הרצויים הרלוונטיים לתכנון הניסוי. בדרך כלל, ניתן לצפות במספרים גבוהים של OCs גדולים ורב-גרעיניים לאחר 6 ימים וכאשר נוצרים בורות ספיגה. תאי הזנה עם מדיום α-MEM מלא ורענן המכיל 20 ננוגרם/מ"ל M-CSF ו-20 ננוגרם/מ"ל RANKL בכל יום שלישי.
6. בסוף הדגירה, לשטוף תאים עם PBS פעמיים, לתקן עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות, ולשטוף עם PBS שוב.
7. השתמש ב- OCs הקבועים ישירות לצביעה פלואורסצנטית או אחסן בטמפרטורה של 4 °C (74 °F).

5. צביעה פלואורסצנטית של OCs וציפוי CaP

1. דגירה של התאים הקבועים עם מאגר חדירה (0.1% טריטון ב-PBS) למשך 5 דקות.
2. חוטי אקטין עם 100 μL של AlexaFluor 546 מסומן תמיסת פלואידין ב- PBS במשך 30 דקות ושואפים לתמיסת הכתם. הוסף 100 μL של תמיסת צביעה Hoechst 33342 (10 מיקרוגרם /מ"ל ב- PBS) למשך 10 דקות כדי להכתים גרעינים. ניתן גם להשתמש ב-DAPI.
3. ציפוי CaP כתם עם 100 μL של 10 μM calcein ב- PBS למשך 10 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולצלם תמונות.
4. לאחר הדמיה פלואורסצנטית ניתן להשתמש באותם לוחות כדי לכמת את אזור בור הספיגה על ידי צביעת פון קוסה. כדי לעשות זאת, לשטוף את הצלחות עם מים deionized פעמיים.

6. כימות שטח בור הספיגה הכולל

1. כדי להכתים את ציפוי CaP בכתם Von Kossa, יש לדגום עם 50 μL של 5% AgNO₃ במים שעברו דה-יוניזציה לבאר תחת קרינת UV במשך שעה אחת, עד שהציפוי בתחתית הבארות הפך חום.
2. שטפו את הצלחת שלוש פעמים במים שעברו דה-יוניזציה וצלמו תמונות של שדה בהיר. מטרה עם הגדלה מועטה, כגון מטרה של פי 1.25, יכולה לשמש כדי ללכוד את כל הבאר בתמונה אחת. זה מקל על ניתוח התמונה הבאה. ניתן ליישם שיטות חלופיות ללכידת כל שטח הבאר.
3. פתיחת קובץ תמונה עם ImageJ: קובץ | | פתוח תמונה | סוג | 8 סיביות. אמת את יחידת קנה המידה בפינה השמאלית התחתונה של התמונה באמצעות קו ישר | לנתח | קבע קנה מידה. הזן את האורך בשמיכת "המרחק הידוע", הזן יחידת קנה מידה חדשה ביחידת אורך וסמן את התיבה גלובל.
4. רשימת פרמטרים למדידה שיש לנתח: ניתוח | הגדר מדידות. בחלון הגדר מדידות, סמן את התיבות אזור והגבלה לסף.
5. מדוד את שטח הבורות: תמונה | התאמת | סף. בחלון סף, סמן את תיבת הסימון רקע כהה ולחץ על אוטומטי. אזור הבורות הופך לאדום. סגור את חלון הסף ובחר נתח | למדוד. שמירת קובץ התוצאה: קובץ | שמור כ.

7. כימות של מספר וגודל OC, ואזור בור ספיגה מנורמל

1. פתח תמונה פלואורסצנטית של אוסטאוקלסטים עם ImageJ ואמת את יחידת קנה המידה (ראה שלב 6.3).
2. רשימת פרמטרים למדידה שיש לנתח: ניתוח | הגדר מדידות. בחלון הגדר מדידות, סמן את התיבה אזור .
3. תאר את ה-OCs באמצעות בחירות של מנהל ROI ומצולע: נתח | כלים | מנהל החזר ההשקעה. לחץ על בחירות מצולע בערכת הכלים, תאר/י OC אחד (תאים עם טבעת אקטין ≥ שלושה גרעינים) ולחץ על הוסף [t] בחלון ROI Manager. חזור על התוויה עד שכל ה- OCs ייכללו.
4. מדוד את המספר והגודל של OCs: בחר את כל הפריטים ב-ROI Manager ולחץ על מדידה. שמירת קובץ התוצאה: קובץ | שמירה בשם (איור 3E).
5. מדוד את אזור הבור של תמונות פלואורסצנטיות. פתח את התמונה הפלואורסצנטית של הציפוי בקורלציה עם התמונה בשלב 7.3 ווודא את יחידת קנה המידה (ראה שלב 6.3).
   1. רשום פרמטרים למדידה שיש לנתח (ראה שלב 6.4). בחר | תמונה התאמת | סף. בחלון סף, בטל את הסימון של כל התיבות ולחץ על אוטומטי. אזור הבורות הופך לאדום. סגור את חלון הסף ובחר נתח | למדוד. שמור את קובץ התוצאות.
6. חשב שטח בור מנורמל לפי מספר OC.

תוצאות

ציפוי הסידן פוספט בתחתית לוחות תרבית התאים בוצע בשני שלבי ציפוי הכוללים הסתיידות מוקדמת של 3 ימים ושלב הסתיידות של יום אחד. כפי שניתן לראות באיור 1, סידן פוספט בעל פיזור אחיד הושג בתחתית הלוחות בני 96 הבארות. הציפוי נדבק היטב לתחתית לאחר שלבי הכביסה שבוצעו.

Discussion

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה לבדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית באמצעות OCs הנגזרים ומורחבים במבחנה מ- PBMCs. ניתן להכין בקלות את לוחות תרביות התאים המשומשים בציפוי CaP ולדמיין אותם באמצעות חומרים זמינים במעבדה. בנוסף ל-PBMCs לא ממוינים שאומצו בפרוטוקול זה, OCs שנוצרו מתאים מונוציטיים של מורין

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Silver nitrate
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B	Biochrom	03-028-1B	Amphotericin B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Calcium chloride Dihydrate
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	fetal bovine serum
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Fixation buffer	Biolegend	420801	Paraformaldehyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Hydrochloric acid
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Recombinant Human M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Magnesium chloride
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl	Merk	S7653-250G	Sodium chloride
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate of Soda
PBS	Lonza	17-512F	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL	PeproTech	310-01	Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Recombinant cell-dissociation enzymes