Ensayo de gravitaxis a gran escala de larvas de Caenorhabditis dauer

Resumen

El presente protocolo describe métodos para realizar un ensayo gravitacional a gran escala con larvas de Caenorhabditis dauer. Este protocolo permite una mejor detección del comportamiento del eje gravitacional en comparación con un ensayo basado en placas.

Resumen

La sensación de gravedad es un proceso importante y relativamente poco estudiado. La detección de la gravedad permite a los animales navegar por su entorno y facilita el movimiento. Además, la sensación de gravedad, que ocurre en el oído interno de los mamíferos, está estrechamente relacionada con la audición, por lo tanto, comprender este proceso tiene implicaciones para la investigación auditiva y vestibular. Existen ensayos de gravitaxis para algunos organismos modelo, incluyendo Drosophila. Los gusanos individuales han sido previamente ensayados para determinar su preferencia de orientación a medida que se asientan en solución. Sin embargo, no se ha descrito un ensayo fiable y robusto para el eje gravititario de Caenorhabditis . El presente protocolo describe un procedimiento para realizar ensayos de eje gravitacional que se puede utilizar para probar cientos de dauers de Caenorhabditis a la vez. Este ensayo a gran escala y a larga distancia permite la recopilación detallada de datos, revelando fenotipos que pueden pasarse por alto en un ensayo estándar basado en placas. El movimiento de Dauer a lo largo del eje vertical se compara con los controles horizontales para garantizar que el sesgo direccional se deba a la gravedad. La preferencia gravitáctica se puede comparar entre cepas o condiciones experimentales. Este método puede determinar los requisitos moleculares, celulares y ambientales para el eje gravitacional en gusanos.

Introducción

Detectar la atracción gravitacional de la Tierra es crucial para la orientación, el movimiento, la coordinación y el equilibrio de muchos organismos. Sin embargo, los mecanismos moleculares y los neurocircuitos de la sensación de gravedad son poco conocidos en comparación con otros sentidos. En los animales, la sensación de gravedad interactúa y puede ser superada por otros estímulos para influir en el comportamiento. Las señales visuales, la retroalimentación propioceptiva y la información vestibular pueden integrarse para generar un sentido de conciencia corporal en relación con el entorno de un animal ^1,2. Por el contrario, la preferencia gravíctica puede ser alterada en presencia de otros estímulos ^3,4,5. Por lo tanto, el comportamiento gravitáctico es ideal para estudiar la sensación de gravedad y comprender la compleja integración sensorial del sistema nervioso y la toma de decisiones.

C. elegans es un organismo modelo especialmente útil para estudiar el eje gravitacional debido a su ciclo de vida polifénico. Cuando se exponen a factores estresantes durante el desarrollo, incluyendo calor, hacinamiento o falta de alimentos, las larvas de C. elegans se convierten en dauers, que son altamente resistentes al estrés⁶. Como dauers, los gusanos realizan comportamientos característicos, como la nictación, en la que los gusanos "se paran" sobre sus colas y agitan sus cabezas, lo que puede facilitar la dispersión a mejores hábitats⁷. Los ensayos de gravitaxis de C. elegans y C. japonica sugieren que las larvas de dauer gravitan negativamente, y que este comportamiento se observa más fácilmente en dauers que en adultos ^8,9. Las pruebas del eje gravitacional en otras cepas de Caenorhabditis pueden revelar una variación natural en el comportamiento gravitáctico.

Los mecanismos para la sensación de gravedad se han caracterizado en Euglena, Drosophila, Ciona y varias otras especies utilizando ensayos de eje gravitacional 3,10,11. Mientras tanto, los estudios del eje gravitacional en Caenorhabditis inicialmente proporcionaron resultados mixtos. Un estudio de la preferencia orientacional de C. elegans encontró que los gusanos se orientan con la cabeza hacia abajo en solución, sugiriendo una preferencia gravitáctica positiva¹². Mientras tanto, aunque los dauers de C. japonica fueron identificados desde el principio como gravitácticos negativos⁸, este comportamiento solo recientemente se ha descrito en C. elegans⁹. Varios desafíos surgen en el desarrollo de un ensayo de gravitaxis representativo en gusanos. Las cepas de Caenorhabditis se mantienen en placas de agar; Por esta razón, los ensayos de comportamiento suelen utilizar placas de agar como parte de su diseño experimental^13,14,15. El primer ensayo de eje gravitacional reportado en Caenorhabditis se realizó colocando una placa de lado en un ángulo de 90 ° con respecto a la placa de control horizontal⁸. Sin embargo, el comportamiento del eje gravitacional no siempre es robusto en estas condiciones. Mientras que los gusanos adultos pueden ser ensayados para la preferencia orientativa en la solución¹², esta preferencia direccional también puede depender del contexto, lo que lleva a diferentes comportamientos si los gusanos se arrastran en lugar de nadar. Además, C. elegans es sensible a otros estímulos, incluyendo la luz y los campos electromagnéticos^16,17, que interfieren con sus respuestas a la gravedad⁹. Por lo tanto, un ensayo de eje gravitacional actualizado que protege contra otras variables ambientales es importante para diseccionar los mecanismos de este proceso sensorial.

En el presente protocolo, se describe un ensayo para observar el eje gravitacional de Caenorhabditis. La configuración para este estudio se basa en parte en un método desarrollado para estudiar la integridad neuromuscular^18,19. Las larvas de Dauer se cultivan y aíslan utilizando procedimientos estándar²⁰. Luego se inyectan en cámaras hechas de dos pipetas serológicas de 5 ml llenas de agar. Estas cámaras pueden orientarse vertical u horizontalmente y colocarse dentro de una jaula de Faraday oscura durante 12-24 h para protegerse contra la luz y los campos electromagnéticos. La ubicación de cada gusano en las cámaras se registra y se compara con los taxis verticales de una cepa de referencia como C. elegans N2.

Protocolo

Las cepas utilizadas en el presente estudio son C. elegans (N2) y C. briggsae (AF16) (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una población mixta de dauers para cada ensayo.

1. Preparación de la cámara

1. Trabajar en una campana extractora. Configure el espacio de trabajo con un mechero Bunsen, 1-2 cuchillas de afeitar, alicates, pinzas y una superficie de corte de plástico (consulte la Tabla de materiales).
2. Para cada cámara, reunir dos pipetas serológicas de 5 ml. Retire el tapón de algodón de una pipeta con pinzas. Sostenga una cuchilla de afeitar sobre el quemador Bunsen hasta que esté caliente con unos alicates. Utilice la cuchilla calentada para cortar el extremo cónico de la segunda pipeta de modo que toda la pipeta tenga un diámetro uniforme (figura 1A).
3. Trabajando rápidamente, acerque los dos extremos de pipeta modificados a la llama, derritiéndolos ligeramente. Une estos extremos presionándolos firmemente entre sí, asegurándote de que las paredes de ambas pipetas sean continuas. Si hay huecos visibles después de unirse, sepárelos y repita este paso (Figura 1A, B).

2. Llenado de las cámaras con agar

1. Preparar NGM con agar al 4% de acuerdo con los procedimientos estándar de lombriz²¹. Mientras el agar aún está fundido, llene cada cámara uniéndolo a una pipeta serológica y extrayendo lentamente la solución. Selle la punta con una película de parafina antes de retirar la cámara del pipetedor. Coloque la cámara plana (paralela a la mesa de trabajo) para que se enfríe.
   NOTA: Cubrir el matraz con envoltura adhesiva (ver Tabla de materiales) después del autoclave ayuda a evitar que se formen burbujas en la solución¹⁸.
   1. Para minimizar cualquier variación en la consistencia del agar debido a un enfriamiento desigual, sostenga la pipeta (consulte la Tabla de materiales) paralela a la mesa de trabajo mientras dibuja el agar. Coloque las cámaras planas en la mesa de trabajo y deje que el agar se endurezca antes de moverse.
      NOTA: El porcentaje de agar y el contenido multimedia se pueden adaptar al experimento. El agar al 4% es más rígido que la concentración de aproximadamente el 2% utilizada para verter la placa y evita que los gusanos excaven a través del medio en nuestras manos. Sin embargo, otros experimentadores han observado el comportamiento de madriguera de gusanos adultos en hasta un 9% de agar^18,19.
2. Una vez enfriado, caliente una llave hexagonal de 3 mm (u otra herramienta metálica del mismo tamaño, consulte la Tabla de materiales) sobre un mechero Bunsen. Presiónelo firmemente en la pared de cada cámara a unos 5 mm a un lado de la línea media, creando una pequeña abertura en el plástico (Figura 1C). Use una cuchilla calentada para quitar el algodón y los extremos cónicos de la cámara y selle estos extremos con una película de parafina.
   NOTA: Una vez preparada, cada cámara debe utilizarse en un plazo de 1 día o mantenerse a 4 °C durante varios días. Cubra cualquier abertura expuesta con una película de parafina para evitar que el agar se seque.

3. Aislar larvas de dauer

1. 10-15 días antes del experimento, troce cada cepa en 2-3 placas grandes de NGM con bacterias OP50 y envuélvalas con una película de parafina. Después de 10-15 días, cada plato debe estar completamente hambriento con miles de larvas de dauer presentes en el agar, las paredes y las tapas.
   NOTA: Haga platos con anticipación usando una receta OP50 gruesa para obtener el máximo hacinamiento (consulte la Tabla de materiales). La formación de Dauer también puede ser inducida a través de otros métodos, incluyendo la adición de feromonas o creciendo a temperaturas más altas²².
2. Recoja los gusanos enjuagando las tapas y placas con tampón M9 y pipeteando la solución en tubos centrífugos de 15 ml. Girar a 1.600 x g durante 30-60 s a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte del tampón M9 con una pipeta o aspirador de vacío.
3. Aislar los dauers tratando con SDS al 1% seguido de un gradiente de flotación de sacarosa al 30% siguiendo el informe publicado anteriormente²⁰.
   1. Agregue 7 ml de solución SDS al 1% a cada pellet de lombriz. Deje los gusanos en SDS durante 30 minutos; Gire los tubos continuamente durante este tiempo para permitir la aireación. Enjuague 3-5x con M9 para eliminar el detergente.
   2. A continuación, agregue 5 ml de M9 seguido de 5 ml de solución fría de sacarosa filtrada al 60%. Mezclar bien y luego centrifugar a 1.600 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para crear un gradiente de separación.
4. Llene los nuevos tubos de centrífuga de 15 ml con 2 ml de tampón M9. Aplastar los extremos de las pipetas de vidrio Pasteur para ensanchar el orificio y utilizar estas pipetas para transferir la capa superior de la solución (que contiene dauers aislados) del gradiente de sacarosa a los nuevos tubos. Enjuague los dauers 3-5x con M9.
   NOTA: Habrá miles de dauers aislados en solución en este punto. Pueden usarse inmediatamente o mantenerse aireados girando en 5-7 ml M9 durante la noche.

4. Adición de dauers a la cámara

1. Centrífuga a 1.600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte de la solución M9 con una pipeta o aspirador de vacío. Para estimar la densidad de gusanos, cuente manualmente el número de gusanos en tres gotas separadas de 1 μL bajo un microscopio de disección. Utilice el promedio de estos recuentos para aproximar el número de gusanos por μL.
   NOTA: Es posible que algunas pipetas de pequeño volumen no puedan alcanzar el fondo de un tubo de centrífuga de 15 ml; En este caso, una gota concentrada de gusanos se puede transferir primero a un trozo de película de parafina.
2. Corte el extremo de una punta de pipeta de 10, 20 o 200 μL para ensanchar el orificio. Ajuste la micropipeta a un volumen ligeramente mayor que el volumen de aspiración previsto. Aspire aproximadamente 1-2 μL de la solución de gusano concentrada (idealmente entre 100-300 gusanos) y permita que una pequeña cantidad de aire entre en la punta.
   NOTA: Un gran número de gusanos (1,000+) en una cámara puede aumentar el rango de distancias recorridas debido al hacinamiento⁹.
3. Empuje suavemente la punta de la pipeta en el agar mientras presiona la micropipeta. Esto creará un sitio de inyección en el agar sin obstruir la punta. Libera los gusanos en el agar. Use una película de parafina para sellar la abertura.

5. Ejecución y puntuación del ensayo

NOTA: La gravitaxis puede ser probada bajo diversas condiciones que pueden afectar el comportamiento⁹.

1. Para eliminar tantas variables como sea posible, coloque las cámaras dentro de una jaula oscura de Faraday (consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente.
2. Etiquete cada cámara y cuélguela verticalmente dentro de la jaula de Faraday (realice esto usando cinta de etiquetado). Pruebe los controles horizontales simultáneamente colocando algunas cámaras planas dentro de las mismas condiciones ambientales. Pruebe las cepas experimentales contra gusanos N2 orientados verticalmente como control positivo. Utilice cámaras orientadas horizontalmente que contengan dauers N2 como control negativo adicional.
   NOTA: Los ensayos horizontales y verticales deben realizarse en el mismo entorno dentro del laboratorio para minimizar la variabilidad ambiental entre las dos condiciones. Se puede usar una incubadora grande para albergar ambas jaulas de Faraday.
3. Los Dauers comienzan a dispersarse desde el sitio de inicio después de unas horas y tardan varias horas en llegar a cada extremo de la cámara. Deje las cámaras sin molestias durante este tiempo y marque dentro de las 12-24 h siguientes a la inyección.
   NOTA: No use un paralítico (como azida de sodio) para inmovilizar gusanos que han alcanzado los extremos de las cámaras. Debido a que se mide la distribución general de los gusanos en lugar de un índice de preferencia (como en un ensayo de dos opciones), la azida de sodio es innecesaria y puede alterar los resultados.
4. Retire y marque las cámaras del eje gravitacional una a la vez. Busque dauers vivos bajo un microscopio de disección y marque sus ubicaciones con tinta (Figura 1C, D). No marque los gusanos dentro de los 2,5 cm a cada lado del sitio de inyección, ya que es probable que estos gusanos no demuestren una preferencia direccional.
   1. Además, evite marcar gusanos que parecen muertos o están atrapados en el líquido. Deseche cualquier cámara que contenga >50% de gusanos muertos o nadadores.
      NOTA: Una vez que la cámara se ha retirado del área de prueba, debe puntuarse rápidamente para mayor precisión. Los dauers solo deben ser visibles entre la superficie del agar y la pared de la pipeta. Si se observa un comportamiento de madriguera, considere aumentar la concentración de agar en futuros ensayos.
5. Para cuantificar los resultados, utilice un marcador para dividir cada mitad de la cámara en siete secciones de 3,5 cm a partir de 2,5 cm de distancia del lugar de inyección (en algunas pipetas, 3,5 cm = 1 ml de volumen). Utilice un contador de conteo manual (consulte la Tabla de materiales) para calcular el número de gusanos observados en cada sección.
   NOTA: Debe haber siete secciones a cada lado del origen, que se pueden numerar de -7 (abajo) a +7 (arriba). Estos números deben corresponder a las mismas ubicaciones relativas basadas en cómo se construyeron las cámaras; El agar se extrae desde el extremo -7 hasta el extremo +7 en el paso 2.

Resultados

Comparando el graviteje entre especies
Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, el eje gravitacional de C. briggsae dauer se puede comparar con el eje gravitacional y los controles horizontales de C. elegans. La distribución vertical (granate) de C. briggsae dauers está sesgada hacia la parte superior de las cámaras, con un gran porcentaje de gusanos que alcanzan +7 (Figura 2A). En contraste con los controles horizontales (aqua), en...

Discusión

Comparación con métodos anteriores
A diferencia de la quimiotaxis, el eje gravitacional en Caenorhabditis no se puede observar de manera confiable utilizando un diseño experimental tradicional de placa de agar. Una placa de Petri estándar tiene 150 mm de diámetro, lo que resulta en solo 75 mm disponibles en cualquier dirección para que los dauers demuestren la preferencia del eje gravitatorio. Aunque la preferencia orientativa de C. elegans se puede ensayar en la solución

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers