Essai gravitaire à grande échelle des larves de Caenorhabditis dauer

Résumé

Le présent protocole décrit les méthodes permettant d’effectuer un essai gravitaire à grande échelle avec des larves de Caenorhabditis dauer. Ce protocole permet une meilleure détection du comportement de l’axe gravitationnel par rapport à un test sur plaque.

Résumé

La sensation de gravité est un processus important et relativement peu étudié. La détection de la gravité permet aux animaux de naviguer dans leur environnement et facilite les mouvements. De plus, la sensation de gravité, qui se produit dans l’oreille interne des mammifères, est étroitement liée à l’audition - ainsi, la compréhension de ce processus a des implications pour la recherche auditive et vestibulaire. Des essais gravitationnels existent pour certains organismes modèles, dont la drosophile. Les vers simples ont déjà été testés pour leur préférence d’orientation lorsqu’ils s’installent en solution. Cependant, un essai fiable et robuste pour Caenorhabditis gravitaxis n’a pas été décrit. Le présent protocole décrit une procédure pour effectuer des tests gravitaires qui peuvent être utilisés pour tester des centaines de Caenorhabditis dauers à la fois. Ce test à grande échelle et à longue distance permet une collecte de données détaillées, révélant des phénotypes qui peuvent être manqués sur un essai standard sur plaque. Le mouvement de Dauer le long de l’axe vertical est comparé aux commandes horizontales pour s’assurer que la polarisation directionnelle est due à la gravité. La préférence gravitactique peut alors être comparée entre les souches ou les conditions expérimentales. Cette méthode permet de déterminer les exigences moléculaires, cellulaires et environnementales pour la gravitaxie chez les vers.

Introduction

La détection de l’attraction gravitationnelle de la Terre est cruciale pour l’orientation, le mouvement, la coordination et l’équilibre de nombreux organismes. Cependant, les mécanismes moléculaires et les neurocircuits de la sensation de gravité sont mal compris par rapport à d’autres sens. Chez les animaux, la sensation de gravité interagit avec et peut être dépassée par d’autres stimuli pour influencer le comportement. Des indices visuels, une rétroaction proprioceptive et des informations vestibulaires peuvent être intégrés pour générer un sentiment de conscience corporelle par rapport à l’environnement d’un animal ^1,2. Inversement, la préférence gravitactique peut être altérée en présence d’autres stimuli ^3,4,5. Par conséquent, le comportement gravitactique est idéal pour étudier la sensation de gravité et comprendre l’intégration sensorielle complexe du système nerveux et la prise de décision.

C. elegans est un organisme modèle particulièrement utile pour étudier la gravitaxie en raison de son cycle de vie polyphénique. Lorsqu’elles sont exposées à des facteurs de stress pendant le développement, notamment la chaleur, le surpeuplement ou le manque de nourriture, les larves de C. elegans se transforment en dauers, qui sont très résistants au stress⁶. En tant que dauers, les vers adoptent des comportements caractéristiques, tels que la nictation, dans laquelle les vers « se tiennent » sur leur queue et agitent la tête, ce qui peut faciliter la dispersion vers de meilleurs habitats⁷. Les essais gravitaxis de C. elegans et de C. japonica suggèrent que les larves de dauer ont un gravitax négatif, et que ce comportement est plus facilement observé chez les dauers que chez les adultes ^8,9. Le test de l’axe de gravité dans d’autres souches de Caenorhabditis peut révéler une variation naturelle du comportement gravitactique.

Les mécanismes de sensation de gravité ont été caractérisés chez Euglena, Drosophila, Ciona et diverses autres espèces en utilisant les essais^{de gravité 3,10,11}. Pendant ce temps, les études gravitaxis à Caenorhabditis ont initialement fourni des résultats mitigés. Une étude de la préférence d’orientation de C. elegans a révélé que les vers s’orientent la tête baissée en solution, suggérant une préférence gravitactique positive¹². Pendant ce temps, bien que C. japonica dauers ait été identifié très tôt comme étant négativement gravitactique⁸, ce comportement n’a été décrit que récemment dans C. elegans⁹. Plusieurs défis se posent dans le développement d’un essai de gravité représentatif chez les vers. Les souches de Caenorhabditis sont maintenues sur des plaques de gélose; Pour cette raison, les tests comportementaux utilisent généralement des plaques de gélose dans le cadre de leur conception expérimentale^13,14,15. Le premier essai d’axe gravitationnel signalé chez Caenorhabditis a été réalisé en plaçant une plaque sur le côté à un angle de 90° par rapport à la plaque de contrôle horizontale⁸. Cependant, le comportement de l’axe gravitationnel n’est pas toujours robuste dans ces conditions. Alors que les vers adultes peuvent être testés pour la préférence d’orientation dans la solution¹², cette préférence directionnelle peut également dépendre du contexte, conduisant à des comportements différents si les vers rampent plutôt que de nager. De plus, C. elegans est sensible à d’autres stimuli, y compris la lumière et les champs électromagnétiques^16,17, qui interfèrent avec leurs réponses à la gravité⁹. Par conséquent, un test gravitaxique mis à jour qui protège contre d’autres variables environnementales est important pour disséquer les mécanismes de ce processus sensoriel.

Dans le présent protocole, un essai d’observation de l’axe gravitationnel de Caenorhabditis est décrit. La configuration de cette étude est basée en partie sur une méthode développée pour étudier l’intégrité neuromusculaire^18,19. Les larves de Dauer sont cultivées et isolées selon les procédures standard²⁰. Ils sont ensuite injectés dans des chambres fabriquées à partir de deux pipettes sérologiques de 5 ml remplies d’agar-agar. Ces chambres peuvent être orientées verticalement ou horizontalement et placées dans une cage de Faraday sombre pendant 12-24 h pour se protéger contre la lumière et les champs électromagnétiques. L’emplacement de chaque ver dans les chambres est enregistré et comparé aux taxis verticaux d’une souche de référence telle que C. elegans N2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Les souches utilisées dans la présente étude sont C. elegans (N2) et C. briggsae (AF16) (voir le tableau des matériaux). Une population mixte de dauers a été utilisée pour chaque essai.

1. Préparation de la chambre

1. Travailler dans une hotte. Configurez l’espace de travail avec un brûleur Bunsen, 1-2 lames de rasoir, des pinces, une pince à épiler et une surface de coupe en plastique (voir le tableau des matériaux).
2. Pour chaque chambre, prélever deux pipettes sérologiques de 5 mL. Retirez le bouchon de coton d’une pipette avec une pince à épiler. Tenez une lame de rasoir sur le brûleur Bunsen jusqu’à ce qu’il soit chaud à l’aide d’une pince. Utilisez la lame chauffée pour trancher l’extrémité conique de la deuxième pipette de manière à ce que la pipette entière ait un diamètre uniforme (Figure 1A).
3. En travaillant rapidement, rapprochez les deux extrémités modifiées de la pipette de la flamme et faites-les fondre légèrement. Joignez ces extrémités en les pressant fermement ensemble, en veillant à ce que les parois des deux pipettes soient continues. Si des espaces sont visibles après l’assemblage, séparez-les et répétez cette étape (Figure 1A,B).

2. Remplir les chambres avec de la gélose

1. Préparer NGM avec de la gélose à 4% selon les procédures standard^{de ver 21}. Pendant que la gélose est encore fondue, remplissez chaque chambre en la fixant à un pipeteur sérologique et en aspirant lentement la solution. Scellez l’embout avec un film de paraffine avant de retirer la chambre du pipeteur. Posez la chambre à plat (parallèle à la paillasse) pour refroidir.
   NOTA: Couvrir la fiole d’une pellicule alimentaire (voir tableau des matières) après l’autoclavage aide à prévenir la formation de bulles dans la solution¹⁸.
   1. Pour minimiser les variations de consistance de la gélose dues à un refroidissement inégal, maintenez la pipette (voir le tableau des matériaux) parallèle à la paillasse pendant que vous tirez la gélose pendant que vous tirez la gélose Posez les chambres à plat sur la paillasse et laissez la gélose durcir avant de la déplacer.
      REMARQUE: Le pourcentage de gélose et le contenu multimédia peuvent être adaptés à l’expérience. La gélose à 4% est plus rigide que la concentration d’environ 2% utilisée pour le coulage des plaques et empêche les vers de s’enfouir dans le milieu dans nos mains. Cependant, d’autres expérimentateurs ont observé le comportement fouisseur des vers adultes dans jusqu’à 9% de gélose^18,19.
2. Une fois refroidi, chauffer une clé hexagonale de 3 mm (ou un autre outil métallique de la même taille, voir Tableau des matériaux) sur un brûleur Bunsen. Appuyez fermement dans la paroi de chaque chambre à environ 5 mm d’un côté de la ligne médiane, créant une petite ouverture dans le plastique (Figure 1C). Utilisez une lame chauffée pour enlever le coton et les extrémités effilées de la chambre et scellez ces extrémités avec un film de paraffine.
   NOTE: Une fois préparée, chaque chambre doit être utilisée dans un délai de 1 jour ou maintenue à 4 °C pendant plusieurs jours. Couvrez toutes les ouvertures exposées avec un film de paraffine pour empêcher la gélose de se dessécher.

3. Isoler les larves de dauer

1. 10-15 jours avant l’expérience, couper chaque souche sur 2-3 grandes plaques NGM avec des bactéries OP50 et envelopper avec un film de paraffine. Après 10-15 jours, chaque plaque doit être complètement affamée avec des milliers de larves de dauer présentes sur l’agar-agar, les murs et les couvercles.
   REMARQUE: Faites des assiettes à l’avance en utilisant une recette épaisse OP50 pour un encombrement maximal (voir le tableau des matériaux). La formation de Dauer peut également être induite par d’autres méthodes, notamment l’ajout de phéromones ou par croissance à des températures plus élevées²².
2. Recueillir les vers en rinçant les couvercles et les plaques avec un tampon M9 et en pipetant la solution dans des tubes à centrifuger de 15 mL. Faire tourner à 1 600 x g pendant 30-60 s à température ambiante et aspirer la majeure partie du tampon M9 avec une pipette ou un aspirateur à vide.
3. Isoler les dauers en les traitant avec 1 % de SDS suivi d’un gradient de flottation du saccharose de 30 % suivant le rapport publié précédemment²⁰.
   1. Ajouter 7 ml de solution de SDS à 1 % à chaque pastille de vers. Laissez les vers dans la FDS pendant 30 min; Faites tourner les tubes en continu pendant ce temps pour permettre l’aération. Rincer 3-5x avec M9 pour enlever le détergent.
   2. Ensuite, ajoutez 5 mL de M9 suivi de 5 mL de solution de saccharose froide filtrée à 60 %. Bien mélanger, puis centrifuger à 1 600 x g pendant 5 min à température ambiante pour créer un gradient de séparation.
4. Remplir les nouveaux tubes à centrifuger de 15 ml avec 2 ml de tampon M9. Écraser les extrémités des pipettes Pasteur en verre pour élargir l’alésage et utiliser ces pipettes pour transférer la couche supérieure de la solution (contenant des baraudes isolées) du gradient de saccharose vers les nouveaux tubes. Rincer les dauers 3-5x avec M9.
   REMARQUE: Il y aura des milliers de dauers isolés en solution à ce stade. Ils peuvent être utilisés immédiatement ou maintenus aérés en alternant dans 5-7 mL M9 pendant la nuit.

4. Ajout de dauers à la chambre

1. Centrifuger les baraudes à 1 600 x g pendant 5 min à température ambiante et aspirer la majeure partie de la solution M9 à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur à vide. Pour estimer la densité des vers, comptez manuellement le nombre de vers dans trois gouttelettes distinctes de 1 μL sous un microscope à dissection. Utilisez la moyenne de ces comptages pour estimer le nombre de vers par μL.
   REMARQUE : Certains pipetteurs de petit volume peuvent être incapables d’atteindre le fond d’un tube à centrifuger de 15 mL; Dans ce cas, une gouttelette concentrée de vers peut d’abord être transférée dans un morceau de film de paraffine.
2. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 10, 20 ou 200 μL pour élargir l’alésage. Réglez la micropipette à un volume légèrement supérieur au volume d’aspiration prévu. Aspirez environ 1 à 2 μL de la solution de vers concentrée (idéalement entre 100 et 300 vers) et laissez une petite quantité d’air pénétrer dans la pointe.
   REMARQUE: Un grand nombre de vers (1,000+) dans une chambre peut augmenter la gamme de distances parcourues en raison de la surpopulation⁹.
3. Poussez doucement l’embout de la pipette dans la gélose tout en appuyant sur la micropipette. Cela créera un site d’injection dans la gélose sans obstruer l’embout. Relâchez les vers dans l’agar-agar. Utilisez un film de paraffine pour sceller l’ouverture.

5. Exécution et notation du test

REMARQUE: La gravité peut être testée dans diverses conditions pouvant affecter le comportement⁹.

1. Pour éliminer autant de variables que possible, placez les chambres dans une cage de Faraday sombre (voir Tableau des matériaux) à température ambiante.
2. Étiquetez chaque chambre et suspendez-la verticalement dans la cage de Faraday (effectuez cette opération à l’aide de ruban adhésif). Testez simultanément les contrôles horizontaux en posant certaines chambres à plat dans les mêmes conditions environnementales. Testez les souches expérimentales contre les vers N2 orientés verticalement en tant que témoin positif. Utiliser des chambres orientées horizontalement contenant des barauers N2 comme témoin négatif supplémentaire.
   REMARQUE : Les essais horizontaux et verticaux doivent être effectués dans le même cadre au sein du laboratoire afin de minimiser la variabilité environnementale entre les deux conditions. Un grand incubateur peut être utilisé pour abriter les deux cages de Faraday.
3. Les dauers commencent à se disperser du site de départ après quelques heures et mettent plusieurs heures à atteindre chaque extrémité de la chambre. Laissez les chambres intactes pendant ce temps et marquez dans les 12 à 24 heures suivant l’injection.
   REMARQUE: N’utilisez pas un paralytique (tel que l’azoture de sodium) pour immobiliser les vers qui ont atteint les extrémités des chambres. Étant donné que la distribution globale des vers est mesurée au lieu d’un indice de préférence (comme dans un test à deux choix), l’azoture de sodium est inutile et peut modifier les résultats.
4. Retirez et marquez les chambres de gravité une à la fois. Recherchez les baraudes vivantes sous un microscope à dissection et marquez leur emplacement à l’encre (Figure 1C,D). Ne marquez pas les vers à moins de 2,5 cm de chaque côté du site d’injection, car il est peu probable que ces vers présentent une préférence directionnelle.
   1. Évitez également de marquer des vers qui semblent morts ou qui sont piégés dans le liquide. Jetez toutes les chambres contenant >50% de vers morts ou nageurs.
      REMARQUE: Une fois que la chambre a été retirée de la zone d’essai, elle doit être notée rapidement pour la précision. Les dauers ne doivent être visibles qu’entre la surface de l’agar et la paroi de la pipette. Si un comportement fouisseur est observé, envisager d’augmenter la concentration de gélose dans les futurs essais.
5. Pour quantifier les résultats, utilisez un marqueur pour diviser chaque moitié de la chambre en sept sections de 3,5 cm à partir de 2,5 cm du site d’injection (sur certaines pipettes, 3,5 cm = 1 ml de volume). Utilisez un compteur de comptage manuel (voir le tableau des matières) pour compter le nombre de vers observés dans chaque section.
   NOTE: Il devrait y avoir sept sections de chaque côté de l’origine, qui peuvent être numérotées de -7 (bas) à +7 (haut). Ces nombres doivent correspondre aux mêmes emplacements relatifs en fonction de la façon dont les chambres ont été construites; La gélose est tirée de la fin -7 à la fin +7 à l’étape 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Comparaison de la gravité entre les espèces
En suivant la procédure décrite ci-dessus, la gravitaxie de C. briggsae dauer peut être comparée à l’axe gravitationnel et aux contrôles horizontaux de C. elegans . La distribution verticale (marron) de C. briggsae dauers est inclinée vers le sommet des chambres, avec un pourcentage élevé de vers atteignant +7 (Figure 2A). Contrairement aux contrôles horizontaux (aqua), dans lesquels les ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Comparaison avec les méthodes antérieures
Contrairement à la chimiotaxie, la gravitaxie chez Caenorhabditis ne peut pas être observée de manière fiable à l’aide d’un plan expérimental traditionnel sur plaque d’agar. Une boîte de Petri standard mesure 150 mm de diamètre, ce qui donne seulement 75 mm disponibles dans les deux sens pour que les dauers puissent démontrer la préférence gravitaire. Bien que la préférence d’orientation de C. elegans puisse être dosé...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers