Caenorhabditis Dauer larvalarının büyük ölçekli gravitaksis testi

Özet

Mevcut protokol, Caenorhabditis dauer larvaları ile büyük ölçekli bir gravitaksis testi yapmak için yöntemleri özetlemektedir. Bu protokol, plaka tabanlı bir tahlille karşılaştırıldığında gravitaksis davranışının daha iyi algılanmasını sağlar.

Özet

Yerçekimi hissi önemli ve nispeten az çalışılmış bir süreçtir. Yerçekimini algılamak, hayvanların çevrelerinde gezinmelerini sağlar ve hareketi kolaylaştırır. Ek olarak, memeli iç kulağında meydana gelen yerçekimi hissi, işitme ile yakından ilgilidir - bu nedenle, bu süreci anlamanın işitsel ve vestibüler araştırmalar için etkileri vardır. Gravitaksis testleri, Drosophila da dahil olmak üzere bazı model organizmalar için mevcuttur. Tek solucanlar daha önce çözeltiye yerleştikçe oryantasyon tercihleri için test edilmiştir. Bununla birlikte, Caenorhabditis gravitaksisi için güvenilir ve sağlam bir test tanımlanmamıştır. Mevcut protokol, bir seferde yüzlerce Caenorhabditis dauerini test etmek için kullanılabilecek gravitaksis tahlilleri yapmak için bir prosedürü özetlemektedir. Bu büyük ölçekli, uzun mesafeli tahlil, standart bir plaka tabanlı tahlilde gözden kaçırılabilecek fenotipleri ortaya çıkaran ayrıntılı veri toplamaya izin verir. Dikey eksen boyunca Dauer hareketi, yön yanlılığının yerçekiminden kaynaklandığından emin olmak için yatay kontrollerle karşılaştırılır. Yerçekimi tercihi daha sonra suşlar veya deneysel koşullar arasında karşılaştırılabilir. Bu yöntem, solucanlardaki gravitaksisler için moleküler, hücresel ve çevresel gereksinimleri belirleyebilir.

Giriş

Dünya'nın yerçekimi çekimini algılamak, birçok organizmanın yönelimi, hareketi, koordinasyonu ve dengesi için çok önemlidir. Bununla birlikte, yerçekimi duyusunun moleküler mekanizmaları ve nörodevresi, diğer duyularla karşılaştırıldığında yeterince anlaşılmamıştır. Hayvanlarda, yerçekimi hissi, davranışı etkilemek için diğer uyaranlarla etkileşime girer ve onları geride bırakabilir. Görsel ipuçları, propriyoseptif geri bildirim ve vestibüler bilgi, bir hayvanın çevresine göre vücut farkındalığı duygusu oluşturmak için entegre edilebilir ^1,2. Tersine, gravitaktik tercih, diğer uyaranların varlığında değiştirilebilir ^3,4,5. Bu nedenle, gravitaktik davranış, yerçekimi hissini incelemek ve sinir sisteminin karmaşık duyusal entegrasyonunu ve karar verme sürecini anlamak için idealdir.

C. elegans, polifenik yaşam döngüsü nedeniyle gravitaksisi incelemek için özellikle yararlı bir model organizmadır. Isı, aşırı kalabalık veya yiyecek eksikliği de dahil olmak üzere gelişim sırasında stresörlere maruz kaldığında, C. elegans larvaları strese karşı oldukça dirençli olan dauer'lere dönüşür⁶. Dauers olarak, solucanlar, solucanların kuyruklarında "durdukları" ve kafalarını salladıkları niktasyon gibi karakteristik davranışlar sergilerler, bu da daha iyi habitatlara dağılmayı kolaylaştırabilir⁷. C. elegans ve C. japonica'nın gravitaksis tahlilleri, dauer larvalarının negatif gravitik olduğunu ve bu davranışın dauerlerde yetişkinlere göre daha kolay gözlendiğini göstermektedir ^8,9. Gravitaksisin diğer Caenorhabditis suşlarında test edilmesi, gravitaktik davranışta doğal varyasyonları ortaya çıkarabilir.

Yerçekimi hissi mekanizmaları Euglena, Drosophila, Ciona ve gravitaksis tahlilleri^3,10,11 kullanan diğer çeşitli türlerde karakterize ^edilmiştir. Bu arada, Caenorhabdisit'teki gravitaksis çalışmaları başlangıçta karışık sonuçlar verdi. C. elegans'ın oryantasyon tercihi üzerine yapılan bir araştırma, solucanların çözelti içinde başları aşağı doğru yönlendirildiğini ve pozitif yerçekimi tercihini düşündürdüğünü bulmuştur¹². Bu arada, C. japonica dauers erken dönemde negatif gravitaktik⁸ olarak tanımlansa da, bu davranış sadece yakın zamanda C. elegans^9'da tanımlanmıştır. Solucanlarda temsili bir gravitaksis testi geliştirmede çeşitli zorluklar ortaya çıkmaktadır. Caenorhabditis suşları agar plakalarında tutulur; Bu nedenle, davranışsal testler tipik olarak deneysel tasarımlarının bir parçası olarak agar plakalarını kullanır^13,14,15. Caenorhabdisit'te bildirilen en erken gravitaksis testi, yatay kontrol plakası^8'e 90 ° açıyla yan tarafında bir plaka durarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, gravitaksis davranışı bu koşullar altında her zaman sağlam değildir. Yetişkin solucanlar çözüm^12'de oryantasyonel tercih için test edilebilirken, bu yön tercihi de bağlama bağlı olabilir ve solucanlar yüzmek yerine sürünüyorsa farklı davranışlara yol açabilir. Ek olarak, C. elegans, yerçekimine tepkilerine müdahale eden ışık ve elektromanyetik alanlar^16,17 de dahil olmak üzere diğer uyaranlara duyarlıdır⁹. Bu nedenle, diğer çevresel değişkenlere karşı kalkan oluşturan güncellenmiş bir gravitaksis testi, bu duyusal sürecin mekanizmalarını incelemek için önemlidir.

Bu protokolde, Caenorhabditis gravitaksis'i gözlemlemek için bir tahlil tanımlanmıştır. Bu çalışmanın kurulumu kısmen nöromüsküler bütünlüğü incelemek için geliştirilen bir yönteme dayanmaktadır^18,19. Dauer larvaları standart prosedürler²⁰ kullanılarak kültürlenir ve izole edilir. Daha sonra agar ile doldurulmuş iki adet 5 mL serolojik pipetten yapılmış odalara enjekte edilirler. Bu odalar dikey veya yatay olarak yönlendirilebilir ve ışığa ve elektromanyetik alanlara karşı koruma sağlamak için 12-24 saat boyunca karanlık bir Faraday kafesine yerleştirilebilir. Her solucanın odalardaki yeri kaydedilir ve C. elegans N2 gibi bir referans suşunun dikey taksileriyle karşılaştırılır.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan suşlar C. elegans (N2) ve C. briggsae (AF16) 'dir (bakınız Malzeme Tablosu). Her tahlil için karışık cinsiyetli bir dauer popülasyonu kullanıldı.

1. Oda hazırlığı

1. Bir duman davlumbazında çalışın. Çalışma alanını bir Bunsen brülörü, 1-2 tıraş bıçağı, pense, cımbız ve plastik kesme yüzeyi ile ayarlayın (bkz.
2. Her oda için iki adet 5 mL serolojik pipet toplayın. Pamuk fişini bir pipetten cımbızla çıkarın. Pense kullanarak ısınana kadar Bunsen brülörün üzerinde bir tıraş bıçağı tutun. Isıtılmış bıçağı kullanarak ikinci pipetin konik ucunu dilimleyin, böylece pipetin tamamı eşit bir çapa sahip olur (Şekil 1A).
3. Hızlı bir şekilde çalışarak, modifiye edilmiş iki pipet ucunu aleve yaklaştırın ve hafifçe eritin. Bu uçları birbirine sıkıca bastırarak birleştirin ve her iki pipetin duvarlarının sürekli olmasını sağlayın. Birleştirmeden sonra herhangi bir boşluk görülürse, bunları ayırın ve bu adımı tekrarlayın (Şekil 1A, B).

2. Odaların agar ile doldurulması

1. Standart solucan prosedürlerine göre %4 agar ile NGM hazırlayın²¹. Agar hala erimişken, her odayı serolojik bir pipetleyiciye bağlayarak ve çözeltiyi yavaşça çekerek doldurun. Odayı pipetörden çıkarmadan önce ucu parafin filmle kapatın. Soğuması için odayı düz (tezgaha paralel) yerleştirin.
   NOT: Otoklavlamadan sonra şişenin yapışkan sargı ile kaplanması (bkz. Malzeme Tablosu) çözelti^18'de kabarcıkların oluşmasını önlemeye yardımcı olur.
   1. Düzensiz soğutma nedeniyle agarın kıvamındaki herhangi bir değişikliği en aza indirmek için, agar'ı hazırlarken pipettörü ( bkz. Malzeme Tablosu) tezgahın üstüne paralel tutun. Odaları tezgahın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve hareket etmeden önce agarın sertleşmesine izin verin.
      NOT: Agar yüzdesi ve medya içeriği denemeye göre uyarlanabilir. % 4 agar, plaka dökme için kullanılan kabaca% 2 konsantrasyondan daha serttir ve solucanların ellerimizdeki ortamdan geçmesini önler. Bununla birlikte, diğer deneyciler yetişkin solucanlar tarafından% 9'a kadar agar^18,19'da yuvalama davranışını gözlemlemişlerdir.
2. Soğutulduktan sonra, 3 mm'lik bir altıgen anahtarı (veya aynı boyutta başka bir metal aleti , bkz. Her bir odanın duvarına, orta hattın bir tarafına yaklaşık 5 mm sıkıca bastırın ve plastikte küçük bir açıklık oluşturun (Şekil 1C). Odanın pamuklu ve konik uçlarını çıkarmak için ısıtılmış bir bıçak kullanın ve bu uçları parafin film ile kapatın.
   NOT: Hazırlandıktan sonra, her oda 1 gün içinde kullanılmalı veya birkaç gün boyunca 4 ° C'de tutulmalıdır. Agarın kurumasını önlemek için açıkta kalan açıklıkları parafin film ile örtün.

3. Dauer larvalarını izole etmek

1. Deneyden 10-15 gün önce, her bir suşu OP50 bakterisi ile 2-3 büyük NGM plakasına koyun ve parafin filmi ile sarın. 10-15 gün sonra, her plaka agar, duvarlar ve kapaklarda bulunan binlerce dauer larva ile tamamen aç bırakılmalıdır.
   NOT: Maksimum kalabalık için kalın bir OP50 tarifi kullanarak plakaları önceden yapın (bkz. Dauer oluşumu, feromonların eklenmesi veya daha yüksek sıcaklıklarda büyümesi de dahil olmak üzere diğer yöntemlerle de indüklenebilir²².
2. Kapakları ve plakaları M9 tamponuyla durulayarak ve çözeltiyi 15 mL santrifüj tüplerine pipetleyerek solucanları toplayın. Oda sıcaklığında 30-60 s için 1.600 x g'da döndürün ve M9 tamponunun çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin.
3. Dauer'leri% 1 SDS ile tedavi ederek izole edin, ardından daha önce yayınlanan rapor 20'yi takiben%^30'luk bir sakkaroz yüzdürme gradyanı izleyin.
   1. Her bir sonsuz pelete 7 mL% 1 SDS çözeltisi ekleyin. Solucanları 30 dakika SDS'de bırakın; havalandırmaya izin vermek için tüpleri bu süre zarfında sürekli olarak döndürün. Deterjanı çıkarmak için M9 ile 3-5x durulayın.
   2. Daha sonra, 5 mL M9 ve ardından 5 mL soğuk,filtrelenmiş% 60 sakkaroz çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve ardından bir ayırma gradyanı oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.600 x g'de santrifüj yapın.
4. Yeni 15 mL santrifüj tüplerini 2 mL M9 tamponla doldurun. Deliği genişletmek için cam Pasteur pipetlerin uçlarını ezin ve bu pipetleri, çözeltinin üst tabakasını (izole dauers içeren) sakkaroz gradyanından yeni tüplere aktarmak için kullanın. Dauerleri M9 ile 3-5x durulayın.
   NOT: Bu noktada çözümde binlerce izole dauer olacaktır. Hemen kullanılabilir veya gece boyunca 5-7 mL M9'da döndürülerek havalandırılmış halde tutulabilirler.

4. Odaya dauer eklenmesi

1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüj dauerleri ve M9 çözeltisinin çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin. Solucan yoğunluğunu tahmin etmek için, diseksiyon mikroskobu altında üç ayrı 1 μL damlacıktaki solucan sayısını manuel olarak sayın. μL başına solucan sayısını yaklaşık olarak hesaplamak için bu sayımların ortalamasını kullanın.
   NOT: Bazı küçük hacimli pipetleyiciler 15 mL'lik bir santrifüj tüpünün dibine ulaşamayabilir; Bu durumda, konsantre bir solucan damlacığı önce bir parça parafin filmine aktarılabilir.
2. Deliği genişletmek için 10, 20 veya 200 μL pipet ucunun ucunu kesin. Mikropipeti, amaçlanan aspirasyon hacminden biraz daha büyük bir hacme ayarlayın. Konsantre solucan çözeltisinin yaklaşık 1-2 μL'sini (ideal olarak 100-300 solucan arasında) aspire edin ve uca az miktarda havanın girmesine izin verin.
   NOT: Bir odadaki çok sayıda solucan (1.000+), aşırı kalabalık nedeniyle kat edilen mesafe aralığını artırabilir⁹.
3. Mikropipeti bastırırken pipet ucunu yavaşça agarın içine itin. Bu, ucu tıkamadan agarda bir enjeksiyon bölgesi oluşturacaktır. Solucanları agarın içine bırakın. Açıklığı kapatmak için parafin film kullanın.

5. Tahlilin çalıştırılması ve puanlanması

NOT: Gravitaksis, davranış^9'u etkileyebilecek çeşitli koşullar altında test edilebilir.

1. Mümkün olduğunca çok değişkeni ortadan kaldırmak için, odaları oda sıcaklığında karanlık bir Faraday kafesine yerleştirin (bkz.
2. Her odayı etiketleyin ve Faraday kafesine dikey olarak asın (bunu etiketleme bandı kullanarak gerçekleştirin). Bazı odaları aynı çevre koşulları içinde düz bir şekilde yerleştirerek yatay kontrolleri eşzamanlı olarak test edin. Deneysel suşları dikey olarak yönlendirilmiş N2 solucanlarına karşı pozitif bir kontrol olarak test edin. Ek bir negatif kontrol olarak N2 dauer içeren yatay yönelimli odalar kullanın.
   NOT: İki koşul arasındaki çevresel değişkenliği en aza indirmek için yatay ve dikey testler laboratuvar içinde aynı ortamda yapılmalıdır. Her iki Faraday kafesini de barındırmak için büyük bir inkübatör kullanılabilir.
3. Dauers birkaç saat sonra başlangıç bölgesinden dağılmaya başlar ve odanın her iki ucuna da ulaşması birkaç saat sürer. Bu süre zarfında odaları rahatsız etmeden bırakın ve enjeksiyondan sonraki 12-24 saat içinde puan alın.
   NOT: Odaların uçlarına ulaşan solucanları hareketsiz hale getirmek için paralitik (sodyum azid gibi) kullanmayın. Solucanların genel dağılımı bir tercih indeksi yerine ölçüldüğü için (iki seçenekli bir tahlilde olduğu gibi), sodyum azid gereksizdir ve sonuçları değiştirebilir.
4. Gravitaksis odalarını birer birer çıkarın ve puanlayın. Diseksiyon mikroskobu altında canlı dauerleri arayın ve yerlerini mürekkeple işaretleyin (Şekil 1C, D). Solucanları enjeksiyon bölgesinin her iki tarafına 2,5 cm içinde puanlamayın, çünkü bu solucanların yön tercihi göstermesi muhtemel değildir.
   1. Ayrıca, ölü görünen veya sıvıda sıkışmış solucanları puanlamaktan kaçının. % >50 ölü veya yüzme solucanı içeren odaları atın.
      NOT: Oda test alanından çıkarıldıktan sonra, doğruluk için derhal puanlanması gerekir. Dauers sadece agarın yüzeyi ile pipetin duvarı arasında görünür olmalıdır. Yuvalama davranışı gözlenirse, gelecekteki tahlillerde agar konsantrasyonunu arttırmayı düşünün.
5. Sonuçları ölçmek için, odanın her yarısını enjeksiyon bölgesinden 2,5 cm uzakta başlayan yedi adet 3,5 cm'lik bölüme bölmek için bir işaretleyici kullanın (bazı pipetlerde, 3,5 cm = 1 mL hacim). Her bölümde gözlemlenen solucan sayısını hesaplamak için manuel bir uyarı sinyali sayacı kullanın (bkz.
   NOT: Menşe hattının her iki tarafında -7 (alt) ile +7 (üst) arasında numaralandırılabilen yedi bölüm bulunmalıdır. Bu sayılar, odaların nasıl inşa edildiğine bağlı olarak aynı göreceli konumlara karşılık gelmelidir; agar, adım 2'de -7 ucundan +7 ucuna çekilir.

Sonuçlar

Türler arasında gravitaksisin karşılaştırılması
Yukarıda özetlenen prosedürü takiben, C. briggsae dauer gravitaksis, C. elegans gravitaksisi ve yatay kontrolleri ile karşılaştırılabilir. C. briggsae dauers'ın dikey dağılımı (kestane), odaların tepelerine doğru eğilir ve solucanların büyük bir yüzdesi +7'ye ulaşır (Şekil 2A). Dauerlerin odaların merkezi etrafında kabaca çan şeklinde bir eğri halinde dağıldı...

Tartışmalar

Önceki yöntemlerle karşılaştırma
Kemotaksislerin aksine, Caenorhabditis'teki gravitaksis, geleneksel bir agar plakası deney tasarımı kullanılarak güvenilir bir şekilde gözlemlenemez. Standart bir Petri kabının çapı 150 mm'dir, bu da dauers'ın gravitaksis tercihini göstermesi için her iki yönde de sadece 75 mm ile sonuçlanır. C. elegans'ın oryantasyonel tercihi çözüm^12'de test edilebilse de, solucanların birer birer analiz edilmesi g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers