Caenorhabditis dauer 유충의 대규모 중력 분석

요약

본 프로토콜은 Caenorhabditis dauer 유충으로 대규모 중력 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 플레이트 기반 분석과 비교하여 중력 거동을 더 잘 감지할 수 있습니다.

초록

중력 감각은 중요하고 상대적으로 덜 연구된 과정입니다. 중력을 감지하면 동물이 주변을 탐색하고 움직임을 용이하게 할 수 있습니다. 또한 포유류의 내이에서 발생하는 중력 감각은 청각과 밀접한 관련이 있으므로 이 과정을 이해하는 것은 청각 및 전정 연구에 영향을 미칩니다. 중력 분석은 초파리를 포함한 일부 모델 유기체에 대해 존재합니다. 단일 웜은 이전에 용액에 정착 할 때 방향 선호도에 대해 분석되었습니다. 그러나, Caenorhabditis 중력에 대한 신뢰할 수 있고 강력한 분석은 기술되지 않았다. 본 프로토콜은 한 번에 수백 개의 Caenorhabditis dauers를 시험하는데 사용될 수 있는 중력 분석을 수행하는 절차를 간략하게 설명한다. 이 대규모 장거리 분석은 상세한 데이터 수집을 허용하여 표준 플레이트 기반 분석에서 놓칠 수 있는 표현형을 밝힙니다. 수직 축을 따라 다우어 움직임을 수평 컨트롤과 비교하여 방향 바이어스가 중력에 의한 것임을 확인합니다. 그런 다음 중력 선호도를 균주 또는 실험 조건 간에 비교할 수 있습니다. 이 방법은 웜의 중력에 대한 분자, 세포 및 환경 요구 사항을 결정할 수 있습니다.

서문

지구의 중력을 감지하는 것은 많은 유기체의 방향, 움직임, 조정 및 균형에 매우 중요합니다. 그러나 중력 감각의 분자 메커니즘과 신경 회로는 다른 감각에 비해 잘 이해되지 않습니다. 동물에서 중력 감각은 행동에 영향을 미치는 다른 자극과 상호 작용하고 경쟁할 수 있습니다. 시각적 단서, 고유 감각 피드백 및 전정 정보를 통합하여 동물의 주변 환경에 대한 신체 인식 감각을 생성 할 수 있습니다 ^1,2. 반대로, 중력 선호도는 다른 자극 ^3,4,5의 존재 하에서 변경 될 수있다. 따라서 중력 행동은 중력 감각을 연구하고 신경계의 복잡한 감각 통합 및 의사 결정을 이해하는 데 이상적입니다.

C. elegans는 polyphenic 수명주기 때문에 중력을 연구하는 데 특히 유용한 모델 유기체입니다. 발달 중 더위, 과밀 또는 식량 부족을 포함한 스트레스 요인에 노출되면 C. elegans 유충은 스트레스에 강한 다우어로 발달합니다⁶. dauers로서, 벌레는 벌레가 꼬리에 "서서"머리를 흔드는 nictation과 같은 특징적인 행동을 수행하여 더 나은 서식지로 분산을 촉진 할 수 있습니다⁷. C. elegans와 C. japonica의 중력 분석은 dauer 유충이 부정적인 중력을 시사하며, 이러한 행동은 성인보다 dauers에서 더 쉽게 관찰됩니다 ^8,9. 다른 Caenorhabditis 균주에서 중력을 테스트하면 중력 행동의 자연적 변화가 나타날 수 있습니다.

중력 감각에 대한 메커니즘은 유글레나, 초파리, 시오나 및 중력 분석 3,10,11을 사용하는 다양한 다른 종에서 특성화되었습니다. 한편, Caenorhabditis에 대한 중력 연구는 처음에 혼합 된 결과를 제공했습니다. C. elegans 방향 선호도에 대한 연구에 따르면 벌레는 용액에서 머리를 아래로 향하게 하여 긍정적인 중력 선호도를 시사합니다¹². 한편, C. japonica dauers는 초기에 음의 중력⁸로 확인되었지만,이 행동은 최근에야 C. elegans⁹에서 설명되었습니다. 웜에서 대표적인 중력 분석을 개발하는 데 몇 가지 문제가 발생합니다. Caenorhabditis 균주는 한천 플레이트에서 유지됩니다. 이러한 이유로 행동 분석은 일반적으로 실험 설계^13,14,15의 일부로 한천 플레이트를 사용합니다. Caenorhabditis에서 가장 초기에 보고된 중력 분석은 수평 대조군^{플레이트(8})에 대해 90° 각도로 플레이트를 측면에 세워서 수행되었습니다. 그러나 중력 거동이 이러한 조건에서 항상 견고한 것은 아닙니다. 솔루션¹²에서 성인 웜의 방향 선호도를 분석할 수 있지만 이 방향 기본 설정은 상황에 따라 달라질 수 있으므로 웜이 수영하지 않고 크롤링하는 경우 다른 동작이 발생할 수 있습니다. 또한, C. elegans는 중력에 대한 반응을 방해하는 빛과 전자기장^(16,17)을 포함한 다른 자극에 민감하다⁹. 따라서 다른 환경 변수로부터 보호하는 업데이트된 중력 분석은 이 감각 과정의 메커니즘을 해부하는 데 중요합니다.

본 프로토콜에서, Caenorhabditis 중력을 관찰하기 위한 분석법이 기재되어 있다. 이 연구의 설정은 부분적으로 신경근 무결성^18,19를 연구하기 위해 개발 된 방법을 기반으로합니다. Dauer 유충은 표준 절차²⁰을 사용하여 배양 및 분리됩니다. 그런 다음 한천으로 채워진 두 개의 5mL 혈청 학적 피펫으로 만든 챔버에 주입됩니다. 이 챔버는 수직 또는 수평으로 배향 될 수 있으며 빛과 전자기장으로부터 보호하기 위해 12-24 시간 동안 어두운 패러데이 케이지 내에 배치 할 수 있습니다. 챔버에서 각 웜의 위치가 기록되고 C. elegans N2와 같은 기준 균주의 수직 택시와 비교됩니다.

프로토콜

본 연구에 사용된 균주는 C. 엘레간스 (N2) 및 C. 브릭스새( AF16)입니다( 재료 표 참조). dauers의 혼합 성별 집단이 각 분석에 사용되었습니다.

1. 챔버 준비

1. 흄 후드에서 작업하십시오. 분젠 버너, 면도날 1-2개, 펜치, 핀셋 및 플라스틱 절단 표면으로 작업 공간을 설정합니다( 재료 표 참조).
2. 각 챔버에 대해 두 개의 5mL 혈청학적 피펫을 수집합니다. 핀셋으로 하나의 피펫에서면 플러그를 제거하십시오. 펜치를 사용하여 뜨거워질 때까지 분젠 버너 위에 면도날을 잡습니다. 가열된 블레이드를 사용하여 두 번째 피펫의 테이퍼진 끝을 잘라 전체 피펫의 직경이 균일하도록 합니다(그림 1A).
3. 신속하게 작업하면서 두 개의 수정 된 피펫 끝을 화염에 가깝게 가져와 약간 녹입니다. 이 끝을 단단히 눌러 결합하여 두 피펫의 벽이 연속적이되도록하십시오. 조인 후 간격이 보이면 간격을 분리하고 이 단계를 반복합니다(그림 1A,B).

2. 한천으로 챔버 채우기

1. 표준 웜 절차²¹에 따라 4 % 한천으로 NGM을 준비하십시오. 한천이 아직 녹은 상태에서 혈청 피펫 터에 부착하고 천천히 용액을 끌어 올려 각 챔버를 채 웁니다. 피펫터에서 챔버를 제거하기 전에 팁을 파라핀 필름으로 밀봉하십시오. 챔버를 평평하게 (벤치 탑과 평행하게) 식히십시오.
   참고: 오토클레이빙 후 플라스크를 집착 랩( 재료 표 참조)으로 덮으면 용액¹⁸에 기포가 형성되는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
   1. 고르지 않은 냉각으로 인한 한천의 일관성 변화를 최소화하려면 한천을 그리는 동안 파이펫터( 재료 표 참조)를 벤치탑과 평행하게 잡으십시오. 챔버를 벤치 탑에 평평하게 놓고 움직이기 전에 한천이 굳도록하십시오.
      참고: 한천 비율과 배지 콘텐츠는 실험에 맞게 조정할 수 있습니다. 4 % 한천은 접시 붓기에 사용되는 약 2 % 농도보다 단단하며 벌레가 우리 손에있는 매체를 통해 파고 드는 것을 방지합니다. 그러나 다른 실험자들은 최대 9 % 한천^18,19에서 성인 벌레에 의한 굴착 행동을 관찰했습니다.
2. 냉각되면 분젠 버너 위에 3mm 육각 키(또는 동일한 크기의 다른 금속 도구, 재료 표 참조)를 가열합니다. 각 챔버의 벽에 정중선의 한쪽으로 약 5mm 정도 눌러 플라스틱에 작은 구멍을 만듭니다(그림 1C). 가열 된 블레이드를 사용하여 챔버의면과 테이퍼 진 끝을 제거하고이 끝을 파라핀 필름으로 밀봉하십시오.
   알림: 일단 준비되면 각 챔버는 1일 이내에 사용하거나 며칠 동안 4°C에서 보관해야 합니다. 한천이 마르지 않도록 노출된 구멍을 파라핀 필름으로 덮으십시오.

3. 다우어 유충 분리

1. 실험 10-15일 전에 각 균주를 OP50 박테리아가 있는 2-3개의 큰 NGM 플레이트에 덩어리로 만들고 파라핀 필름으로 감쌉니다. 10-15 일 후, 각 판은 한천, 벽 및 뚜껑에 수천 개의 dauer 유충으로 완전히 굶어 죽어야합니다.
   알림: 최대 혼잡을 위해 두꺼운 OP50 레시피를 사용하여 미리 플레이트를 만드십시오( 재료 표 참조). Dauer 형성은 또한 페로몬의 첨가 또는 더 높은 온도에서 성장함으로써 다른 방법을 통해 유도 될 수있다²².
2. M9 버퍼로 뚜껑과 플레이트를 헹구고 용액을 15mL 원심분리 튜브에 피펫팅하여 벌레를 수집합니다. 실온에서 30-60초 동안 1,600 x g 로 회전하고 피펫 또는 진공 흡인기로 대부분의 M9 버퍼를 흡입합니다.
3. 1% SDS로 처리한 후 이전에 공개된 보고서^{20에 이어 30}% 슈크로스 부유 구배로 처리하여 다우어를 분리합니다.
   1. 각 웜 펠릿에 7mL 1% SDS 용액을 추가합니다. 웜을 SDS에 30 분 동안 그대로 두십시오. 이 시간 동안 튜브를 계속 회전시켜 폭기를 허용합니다. M3으로 5-9x 헹구어 세제를 제거하십시오.
   2. 다음으로, 5mL M9를 첨가한 다음, 여과된 차가운 60% 자당 용액 5mL를 첨가한다. 철저히 혼합한 다음 실온에서 1,600 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 분리 구배를 만듭니다.
4. 새 15mL 원심분리 튜브에 2mL의 M9 완충액을 채웁니다. 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 부수어 보어를 넓히고 이 피펫을 사용하여 용액의 최상층(분리된 다우어 함유)을 자당 구배에서 새 튜브로 옮깁니다. 다우어를 M3으로 5-9x 헹굽니다.
   참고 :이 시점에서 수천 개의 격리 된 dauers가 용액에 있습니다. 즉시 사용하거나 밤새 5-7mL M9에서 회전하여 통기 상태를 유지할 수 있습니다.

4. 챔버에 다우어 추가

1. 실온에서 5분 동안 1,600 x g 로 원심분리하고 피펫 또는 진공 흡인기로 대부분의 M9 용액을 흡인합니다. 웜 밀도를 추정하려면 해부 현미경으로 3개의 개별 1μL 방울에 있는 웜의 수를 수동으로 계산합니다. 이러한 카운트의 평균을 사용하여 μL당 웜 수를 근사화합니다.
   참고: 일부 소량 피펫터는 15mL 원심분리 튜브의 바닥에 도달하지 못할 수 있습니다. 이 경우, 농축 된 웜 방울을 먼저 파라핀 필름 조각으로 옮길 수 있습니다.
2. 10, 20 또는 200 μL 피펫 팁의 끝을 잘라 보어를 넓힙니다. 마이크로 피펫을 의도 된 흡인 부피보다 약간 큰 부피로 설정하십시오. 약 1-2 μL의 농축 웜 용액(이상적으로는 100-300 웜 사이)을 흡입하고 소량의 공기가 팁에 들어가도록 합니다.
   참고: 한 챔버에 많은 수의 벌레(1,000+)가 있으면 과밀로 인해 이동 거리가 늘어날 수 있습니다⁹.
3. 마이크로피펫을 누르면서 피펫 팁을 한천에 부드럽게 밀어 넣습니다. 이것은 팁을 막지 않고 한천에 주사 부위를 만듭니다. 벌레를 한천에 풀어 놓습니다. 파라핀 필름을 사용하여 개구부를 밀봉하십시오.

5. 분석 실행 및 채점

알림: 중력은 행동에 영향을 줄 수 있는 다양한 조건에서 테스트할 수 있습니다⁹.

1. 가능한 한 많은 변수를 제거하려면 실온의 어두운 패러데이 케이지 ( 재료 표 참조) 안에 챔버를 배치하십시오.
2. 각 챔버에 라벨을 붙이고 패러데이 케이지 안에 수직으로 걸어 놓습니다 (라벨링 테이프를 사용하여이를 수행하십시오). 동일한 환경 조건 내에서 일부 챔버를 평평하게 놓아 수평 제어를 동시에 테스트합니다. 양성 대조군으로서 수직 배향 N2 웜에 대해 실험 균주를 테스트합니다. 추가 음성 대조군으로 N2 다우어를 포함하는 수평 지향 챔버를 사용하십시오.
   참고: 수평 및 수직 분석은 두 조건 간의 환경 변동성을 최소화하기 위해 실험실 내에서 동일한 설정에서 수행되어야 합니다. 대형 인큐베이터를 사용하여 두 패러데이 케이지를 모두 수용 할 수 있습니다.
3. Dauers는 몇 시간 후에 시작 부위에서 분산되기 시작하고 챔버의 양쪽 끝에 도달하는 데 몇 시간이 걸립니다. 이 시간 동안 챔버를 방해받지 않고 그대로 두고 주사 후 12-24시간 이내에 점수를 매깁니다.
   알림: 마비 약물 (예 : 아 지드 화 나트륨)을 사용하여 챔버 끝에 도달 한 벌레를 고정시키지 마십시오. 웜의 전체 분포가 선호도 지수 대신 측정되기 때문에(2선다형 분석에서와 같이) 아지드화나트륨은 불필요하며 결과를 변경할 수 있습니다.
4. 중력실을 제거하고 한 번에 하나씩 점수를 매깁니다. 해부 현미경으로 살아있는 다우어를 찾고 잉크로 위치를 표시합니다(그림 1C, D). 주사 부위의 양쪽에서 2.5cm 이내의 웜은 방향 선호도를 나타낼 가능성이 없으므로 점수를 매기지 마십시오.
   1. 또한 죽은 것처럼 보이거나 액체에 갇힌 웜을 득점하지 마십시오. >50 %의 죽은 벌레 또는 수영 벌레가있는 챔버는 폐기하십시오.
      알림: 챔버가 테스트 영역에서 제거되면 정확성을 위해 즉시 점수를 매겨야 합니다. Dauers는 한천 표면과 피펫 벽 사이에서만 볼 수 있어야 합니다. 잠복 행동이 관찰되면 향후 분석에서 한천 농도를 높이는 것을 고려하십시오.
5. 결과를 정량화하려면 마커를 사용하여 챔버의 각 절반을 주사 부위에서 2.5cm 떨어진 곳에서 시작하는 7 개의 3.5cm 섹션으로 나눕니다 (일부 피펫에서는 3.5cm = 1mL 부피). 수동 집계 카운터( 재료 표 참조)를 사용하여 각 섹션에서 관찰된 웜 수를 집계합니다.
   참고: 원점의 양쪽에는 -7(아래쪽)에서 +7(위쪽)까지 번호를 매길 수 있는 7개의 섹션이 있어야 합니다. 이 숫자는 챔버가 어떻게 구성되었는지에 따라 동일한 상대적 위치와 일치해야합니다. 한천은 2단계에서 -7 끝에서 +7 끝으로 그려집니다.

결과

종 간 중력 비교
위에서 설명한 절차에 따라 C. briggsae dauer 중력은 C. elegans 중력 및 수평 제어와 비교할 수 있습니다. C. briggsae dauers의 수직 분포 (적갈색)는 챔버의 상단쪽으로 치우쳐 있으며 많은 비율의 벌레가 +7에 도달합니다 (그림 2A). dauers가 챔버 중심 주위에 대략 종 모양의 곡선으로 분포하는 수평 제어 (아쿠아)와 대조적으로,이 경향...

토론

이전 방법과의 비교
화학주성과는 달리, Caenorhabditis 의 중력은 전통적인 한천 플레이트 실험 설계를 사용하여 안정적으로 관찰할 수 없습니다. 표준 페트리 접시는 직경이 150mm이므로 다우어가 중력 선호도를 입증하기 위해 어느 방향으로든 75mm만 사용할 수 있습니다. C. elegans의 방향 선호도는 용액¹²에서 분석할 수 있지만 이 방법은 웜을 한 번에 하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers