Ensaio gravitaxis em larga escala de Larvas de Caenorhabditis Dauer

Resumo

O presente protocolo descreve métodos para a realização de um ensaio gravitaxis em larga escala com larvas dauer Caenorhabditis . Este protocolo permite uma melhor detecção do comportamento gravitaxis em comparação com um ensaio baseado em placas.

Resumo

A sensação da gravidade é um processo importante e relativamente subestudado. A percepção da gravidade permite que os animais naveguem em seus arredores e facilite o movimento. Além disso, a sensação gravitacional, que ocorre no ouvido interno dos mamíferos, está intimamente relacionada à audição - assim, entender esse processo tem implicações para pesquisas auditivas e vestibulares. Ensaios gravitaxis existem para alguns organismos modelo, incluindo drosophila. Worms únicos já foram avaliados por sua preferência de orientação à medida que se instalam em solução. No entanto, um ensaio confiável e robusto para caenorhabditis gravitaxis não foi descrito. O presente protocolo descreve um procedimento para a realização de ensaios gravitaxis que podem ser usados para testar centenas de dauers caenorhabditis de cada vez. Este ensaio de longa distância e em larga escala permite a coleta detalhada de dados, revelando fenótipos que podem ser perdidos em um ensaio padrão baseado em placas. O movimento de Dauer ao longo do eixo vertical é comparado com controles horizontais para garantir que o viés direcional seja devido à gravidade. A preferência gravitactic pode então ser comparada entre cepas ou condições experimentais. Este método pode determinar requisitos moleculares, celulares e ambientais para gravitaxis em vermes.

Introdução

Sentir a atração gravitacional da Terra é crucial para a orientação, movimento, coordenação e equilíbrio de muitos organismos. No entanto, os mecanismos moleculares e o neurocircuito da sensação gravitacional são mal compreendidos em comparação com outros sentidos. Em animais, a sensação de gravidade interage e pode ser superada por outros estímulos para influenciar o comportamento. Pistas visuais, feedback proprioceptivo e informações vestibulares podem ser integrados para gerar uma sensação de consciência corporal em relação ao entorno de um animal ^1,2. Por outro lado, a preferência gravitactica pode ser alterada na presença de outros estímulos ^3,4,5. Portanto, o comportamento gravitactic é ideal para estudar a sensação da gravidade e entender a complexa integração sensorial e a tomada de decisões do sistema nervoso.

C. elegans é um organismo modelo especialmente útil para estudar gravitaxis devido ao seu ciclo de vida polifenóico. Quando expostas a estressores durante o desenvolvimento, incluindo calor, superlotação ou falta de alimentos, as larvas C. elegans se desenvolvem em dauers, que são altamente resistentes ao estresse⁶. Como dauers, os vermes realizam comportamentos característicos, como a nictação, em que os vermes "ficam" em suas caudas e acenam com a cabeça, o que pode facilitar a dispersão para melhores habitats⁷. Ensaios gravitaxis de C. elegans e C. japonica sugerem que larvas dauer negativamente gravitax, e que este comportamento é mais facilmente observado em dauers do que em adultos ^8,9. Testar gravitaxis em outras cepas de Caenorhabditis pode revelar variação natural no comportamento gravitacático.

Mecanismos para a sensação gravitacional têm sido caracterizados em Euglena, Drosophila, Ciona, e várias outras espécies usando ensaios gravitaxis ^3,10,11. Enquanto isso, estudos de gravitaxis em Caenorhabditis inicialmente forneceram resultados mistos. Um estudo da preferência orientacional de C. elegans descobriu que os vermes orientam com a cabeça para baixo em solução, sugerindo preferência gravitactica positiva¹². Enquanto isso, embora os dauers C. japonica tenham sido identificados no início como sendo negativamente gravitactic⁸, este comportamento só foi recentemente descrito em C. elegans⁹. Vários desafios surgem no desenvolvimento de um ensaio representativo de gravitaxis em vermes. As cepas de caenorhabditis são mantidas em placas de ágar; por essa razão, ensaios comportamentais normalmente usam placas de ágar como parte de seu projeto experimental 13,14,15. O ensaio gravitaxis mais antigo relatado em Caenorhabditis foi realizado de pé uma placa ao seu lado em um ângulo de 90° para a placa de controle horizontal⁸. No entanto, o comportamento gravitaxis nem sempre é robusto nessas condições. Embora os vermes adultos possam ser avaliados para preferência orientacional na solução¹², essa preferência direcional também pode ser dependente do contexto, levando a diferentes comportamentos se os vermes estiverem engatinhando em vez de nadar. Além disso, C. elegans é sensível a outros estímulos, incluindo campos leves e eletromagnéticos^16,17, que interferem com suas respostas à gravidade⁹. Portanto, um ensaio gravitaxis atualizado que protege contra outras variáveis ambientais é importante para dissecar os mecanismos desse processo sensorial.

No presente protocolo, é descrito um ensaio para observar caenorhabditis gravitaxis. A configuração deste estudo baseia-se, em parte, em um método desenvolvido para estudar a integridade neuromuscular^18,19. As larvas dauer são cultivadas e isoladas usando procedimentos padrão²⁰. Eles são então injetados em câmaras feitas de duas pipetas sorológicas de 5 mL cheias de ágar. Estas câmaras podem ser orientadas vertical ou horizontalmente e colocadas dentro de uma gaiola escura de Faraday por 12-24 h para proteger contra campos claros e eletromagnéticos. A localização de cada verme nas câmaras é registrada e comparada com os táxis verticais de uma cepa de referência como C. elegans N2.

Protocolo

As cepas utilizadas no presente estudo são C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (ver Tabela de Materiais). Uma população de dauers de sexo misto foi usada para cada ensaio.

1. Preparação da câmara

1. Trabalhe em um capuz de fumaça. Configure o espaço de trabalho com um queimador Bunsen, 1-2 lâminas de barbear, alicates, pinças e uma superfície de corte de plástico (ver Tabela de Materiais).
2. Para cada câmara, reúna duas pipetas sorológicas de 5 mL. Remova o plugue de algodão de uma pipeta com pinça. Segure uma lâmina de barbear sobre o queimador Bunsen até ficar quente usando alicate. Use a lâmina aquecida para cortar a extremidade afilada da segunda pipeta para que toda a pipeta tenha um diâmetro uniforme (Figura 1A).
3. Trabalhando rapidamente, aproxime as duas extremidades modificadas da tubulação perto da chama, derretendo-as ligeiramente. Junte essas extremidades pressionando-as firmemente, garantindo que as paredes de ambas as pipetas sejam contínuas. Se alguma lacuna for visível após a adesão, separe-as e repita esta etapa (Figura 1A,B).

2. Enchendo as câmaras com ágar

1. Prepare o NGM com 4% de ágar de acordo com os procedimentos padrão de vermes²¹. Enquanto o ágar ainda estiver derretido, encha cada câmara anexando-a a um pipettor sorológico e elaborando lentamente a solução. Sele a ponta com filme de parafina antes de remover a câmara do pipettor. Coloque a câmara plana (paralela à bancada) para esfriar.
   NOTA: Cobrir o frasco com envoltório (ver Tabela de Materiais) após a autoclavagem ajuda a evitar que bolhas se formem na solução¹⁸.
   1. Para minimizar quaisquer variações na consistência do ágar devido ao resfriamento irregular, segure o pipettor (ver Tabela de Materiais) paralelo à bancada enquanto elabora o ágar. Coloque as câmaras planas no banco e deixe o ágar endurecer antes de se mover.
      NOTA: A porcentagem de ágar e o conteúdo de mídia podem ser adaptados ao experimento. 4% de ágar é mais rígido do que a concentração de cerca de 2% usada para derramamento de placas e impede que os vermes enterrem através do meio em nossas mãos. No entanto, outros experimentadores observaram o comportamento de escavação por vermes adultos em até 9% de^{ágar 18,19}.
2. Uma vez resfriado, aqueça uma chave hex (ou outra ferramenta metálica do mesmo tamanho, veja Tabela de Materiais) sobre um queimador bunsen. Pressione-o firmemente na parede de cada câmara cerca de 5 mm para um lado da linha média, criando uma pequena abertura no plástico (Figura 1C). Use uma lâmina aquecida para remover o algodão e extremidades afiladas da câmara e selar estas extremidades com filme de parafina.
   NOTA: Uma vez preparada, cada câmara deve ser usada dentro de 1 dia ou mantida a 4 °C por vários dias. Cubra todas as aberturas expostas com filme de parafina para evitar que o ágar seque.

3. Isolating dauer larvas

1. 10-15 dias antes do experimento, embrulhe cada cepa em 2-3 placas grandes de NGM com bactérias OP50 e enrole com filme de parafina. Após 10-15 dias, cada prato deve estar totalmente faminto com milhares de larvas dauer presentes no ágar, paredes e tampas.
   NOTA: Faça placas com antecedência usando uma receita OP50 grossa para lotação máxima (ver Tabela de Materiais). A formação de dauer também pode ser induzida através de outros métodos, incluindo a adição de feromônios ou crescendo a temperaturas mais altas²².
2. Colete vermes enxaguando as tampas e placas com tampão M9 e canalizando a solução em tubos de centrífugas de 15 mL. Gire a 1.600 x g para 30-60 s em temperatura ambiente e aspire a maior parte do tampão M9 com uma pipeta ou aspirador de vácuo.
3. Isolador dauers por tratamento com 1% de SDS seguido de um gradiente de flutuação de sacarose de 30% após o relatório publicado anteriormente²⁰.
   1. Adicione 7 mL 1% de solução SDS a cada pelota de worm. Deixe os vermes na SDS por 30 minutos; gire os tubos continuamente durante este tempo para permitir a aeração. Enxágüe 3-5x com M9 para remover o detergente.
   2. Em seguida, adicione 5 mL M9 seguido por 5 mL de solução fria e filtrada de 60% de sacarose. Misture bem e, em seguida, centrífuga a 1.600 x g por 5 min a temperatura ambiente para criar um gradiente de separação.
4. Encha novos tubos de centrífugas de 15 mL com 2 mL de tampão M9. Esmague as extremidades das pipetas pasteur de vidro para ampliar o furo e use essas pipetas para transferir a camada superior da solução (contendo dauers isolados) do gradiente de sacarose para os novos tubos. Enxágüe os dauers 3-5x com M9.
   NOTA: Haverá milhares de dauers isolados em solução neste momento. Eles podem ser usados imediatamente ou mantidos arejados girando em 5-7 mL M9 durante a noite.

4. Adicionando dauers à câmara

1. Dauers centrífugas a 1.600 x g por 5 min à temperatura ambiente e aspiram a maior parte da solução M9 com um aspirador de pipeta ou vácuo. Para estimar a densidade dos vermes, conte manualmente o número de vermes em três gotículas separadas de 1 μL sob um microscópio dissecado. Use a média dessas contagens para aproximar o número de vermes por μL.
   NOTA: Alguns pipettores de pequeno volume podem ser incapazes de atingir o fundo de um tubo de centrífuga de 15 mL; neste caso, uma gota concentrada de vermes pode ser transferida primeiro para um pedaço de filme de parafina.
2. Corte a ponta de pipeta de 10, 20 ou 200 μL para ampliar o furo. Ajuste a micropipette em um volume ligeiramente maior do que o volume de aspiração pretendido. Aspire aproximadamente 1-2 μL da solução concentrada de vermes (idealmente entre 100-300 worms) e permita que uma pequena quantidade de ar entre na ponta.
   NOTA: Um grande número de vermes (mais de 1.000) em uma câmara pode aumentar a faixa de distâncias percorrida devido à superlotação⁹.
3. Empurre suavemente a ponta da pipeta para dentro do ágar enquanto deprimi a micropipette. Isso criará um site de injeção no ágar sem entupir a ponta. Solte os vermes no ágar. Use filme de parafina para selar a abertura.

5. Correr e marcar o ensaio

NOTA: A gravitaxis pode ser testada em várias condições que podem afetar o comportamento⁹.

1. Para eliminar o maior número possível de variáveis, coloque as câmaras dentro de uma gaiola escura de Faraday (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente.
2. Rotule cada câmara e pendure-a verticalmente dentro da gaiola de Faraday (execute isso usando fita de rotulagem). Teste controles horizontais simultaneamente colocando algumas câmaras planas dentro das mesmas condições ambientais. Teste as cepas experimentais contra vermes N2 verticalmente orientados como um controle positivo. Use câmaras orientadas horizontalmente contendo dauers N2 como um controle negativo adicional.
   NOTA: Os ensaios horizontais e verticais devem ser realizados no mesmo ambiente dentro do laboratório para minimizar a variabilidade ambiental entre as duas condições. Uma grande incubadora pode ser usada para abrigar ambas as gaiolas de Faraday.
3. Dauers começam a se dispersar do local de partida após algumas horas e levam várias horas para chegar a ambos os lados da câmara. Deixe as câmaras intactas durante este tempo e marque dentro de 12-24 h após a injeção.
   NOTA: Não use um paralítico (como o azida de sódio) para imobilizar vermes que chegaram às extremidades das câmaras. Como a distribuição geral de vermes está sendo medida em vez de um índice de preferência (como em um ensaio de duas escolhas), o azida de sódio é desnecessário e pode alterar os resultados.
4. Remova e marque câmaras gravitaxis uma de cada vez. Procure por dauers vivos sob um microscópio dissecando e marque suas localizações em tinta (Figura 1C,D). Não marque vermes dentro de 2,5 cm para ambos os lados do local da injeção, pois esses vermes não estão demonstrando uma preferência direcional.
   1. Além disso, evite marcar vermes que pareçam mortos ou estão presos no líquido. Descarte quaisquer câmaras contendo >50% de vermes mortos ou nadando.
      NOTA: Uma vez que a câmara tenha sido removida da área de teste, ela precisa ser pontuada prontamente para precisão. Dauers só devem ser visíveis entre a superfície do ágar e a parede da pipeta. Se o comportamento de escavação for observado, considere aumentar a concentração de ágar em ensaios futuros.
5. Para quantificar os resultados, use um marcador para dividir cada metade da câmara em sete seções de 3,5 cm a partir de 2,5 cm do local da injeção (em algumas pipetas, 3,5 cm = 1 mL de volume). Use um contador de contagem manual (ver Tabela de Materiais) para contabilizar o número de worms observados em cada seção.
   NOTA: Deve haver sete seções em cada lado da origem, que podem ser numeradas de -7 (inferior) a +7 (superior). Esses números devem corresponder aos mesmos locais relativos com base na forma como as câmaras foram construídas; ágar é desenhado do -7 final para o +7 final na etapa 2.

Resultados

Comparando gravitaxis entre espécies
Seguindo o procedimento descrito acima, C. briggsae dauer gravitaxis pode ser comparado com C. elegans gravitaxis e controles horizontais. A distribuição vertical (marrom) de dauers C. briggsae é inclinada em direção ao topo das câmaras, com uma grande porcentagem de vermes atingindo +7 (Figura 2A). Contrastada com controles horizontais (aqua), em que os dauers são distribuídos em uma curva em forma ...

Discussão

Comparação com métodos anteriores
Ao contrário da quimiotaxis, a gravitaxis em Caenorhabditis não pode ser observada de forma confiável usando um design experimental tradicional de placa de ágar. Uma placa de Petri padrão tem 150 mm de diâmetro, resultando em apenas 75 mm disponíveis em qualquer direção para dauers demonstrarem preferência gravitaxis. Embora a preferência orientacional de C. elegans possa ser avaliada na solução¹², este método...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers