בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטות לביצוע בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול עם זחלי Caenorhabditis dauer. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי טוב יותר של התנהגות גרביטקסיס בהשוואה לבדיקה מבוססת צלחת.

Abstract

תחושת הכבידה היא תהליך חשוב ויחסית לא מובן מאליו. חישת כוח המשיכה מאפשרת לבעלי חיים לנווט בסביבתם ומקלה על התנועה. בנוסף, תחושת הכבידה, המתרחשת באוזן הפנימית של היונקים, קשורה קשר הדוק לשמיעה - ולכן, להבנת תהליך זה יש השלכות על מחקר שמיעתי ושיווי משקל. מבחני גרביטקסיס קיימים עבור כמה אורגניזמי מודל, כולל דרוזופילה. תולעים בודדות נבדקו בעבר על העדפת האוריינטציה שלהן כשהן שוקעות בתמיסה. עם זאת, בדיקה אמינה וחזקה עבור Caenorhabditis gravitaxis לא תואר. הפרוטוקול הנוכחי מתווה הליך לביצוע מבחני גרביטקסיס שניתן להשתמש בהם כדי לבחון מאות דאוארים של Caenorhabditis בכל פעם. בדיקה ארוכת טווח בקנה מידה גדול זו מאפשרת איסוף נתונים מפורט, וחושפת פנוטיפים שעלולים להתפספס בבדיקה סטנדרטית מבוססת צלחת. תנועת דאואר לאורך הציר האנכי מושווית לבקרות אופקיות כדי להבטיח שהטיית הכיוון נובעת מכוח הכבידה. לאחר מכן ניתן להשוות את העדפת הכבידה בין זנים או תנאי ניסוי. שיטה זו יכולה לקבוע דרישות מולקולריות, תאיות וסביבתיות עבור גרביטקסיס בתולעים.

Introduction

חישת כוח המשיכה של כדור הארץ חיונית להתמצאות, לתנועה, לקואורדינציה ולאיזון של אורגניזמים רבים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים והנוירו-מעגלים של תחושת הכבידה אינם מובנים היטב בהשוואה לחושים אחרים. אצל בעלי חיים, תחושת הכבידה מתקשרת עם גירויים אחרים ויכולה להיות מוגברת על ידי גירויים אחרים כדי להשפיע על ההתנהגות. ניתן לשלב רמזים חזותיים, משוב פרופריוצפטיבי ומידע שיווי משקל כדי ליצור תחושה של מודעות לגוף ביחס לסביבתו של בעל החיים ^1,2. לעומת זאת, ניתן לשנות את העדפת הכבידה בנוכחות גירויים אחרים ^3,4,5. לכן, התנהגות כבידתית היא אידיאלית לחקר תחושת הכבידה ולהבנת האינטגרציה החושית המורכבת של מערכת העצבים וקבלת ההחלטות.

C. elegans הוא אורגניזם מודל שימושי במיוחד לחקר גרביטקסיס בגלל מחזור החיים הפוליפני שלו. כאשר הם נחשפים לגורמי עקה במהלך ההתפתחות, כולל חום, צפיפות או מחסור במזון, זחלי C. elegans מתפתחים לדאוארים, שהם עמידים מאוד ללחץ⁶. בתור דאוארים, תולעים מבצעות התנהגויות אופייניות, כגון ניקוטציה, שבה תולעים "עומדות" על זנבן ומנופפות בראשן, שעשויות להקל על פיזור לבתי גידול טובים יותר⁷. מבחני גרביטקסיס של C. elegans ו- C. japonica מצביעים על כך שזחלי דאואר הם בעלי כבידה שלילית, וכי התנהגות זו נצפית בקלות רבה יותר אצל דאוארים מאשר אצל מבוגרים ^8,9. בדיקת גרביטקסיס בזנים אחרים של Caenorhabditis עשויה לגלות שונות טבעית בהתנהגות הכבידה.

מנגנונים לתחושת הכבידה אופיינו באוגלנה, דרוזופילה, סיונה ומינים שונים אחרים באמצעות מבחני גרביטקסיס 3,10,11^. בינתיים, מחקרי גרביטקסיס ב- Caenorhabditis סיפקו בתחילה תוצאות מעורבות. מחקר על העדפת האוריינטציה של C. elegans מצא כי תולעים מכוונות עם ראשן למטה בתמיסה, מה שמרמז על העדפה גרביטקטית חיובית¹². בינתיים, למרות ש-C. japonica dauers זוהו בשלב מוקדם כבעלי כבידה שלילית⁸, התנהגות זו תוארה רק לאחרונה ב-C. elegans⁹. מספר אתגרים מתעוררים בפיתוח בדיקת גרביטקסיס מייצגת בתולעים. זני Caenorhabditis נשמרים על צלחות אגר; מסיבה זו, מבחנים התנהגותיים משתמשים בדרך כלל בלוחות אגר כחלק מתכנון הניסוי^{שלהם 13,14,15}. בדיקת הכבידה המוקדמת ביותר שדווחה ב- Caenorhabditis בוצעה על ידי העמדת צלחת על צדה בזווית של 90° ללוח הבקרה האופקי⁸. עם זאת, התנהגות גרביטקסיס אינה תמיד חזקה בתנאים אלה. בעוד שניתן לבחון תולעים בוגרות להעדפה אוריינטלית בתמיסה¹², העדפה כיוונית זו עשויה להיות גם תלוית הקשר, מה שמוביל להתנהגויות שונות אם התולעים זוחלות במקום לשחות. בנוסף, C. elegans רגישים לגירויים אחרים, כולל אור ושדות אלקטרומגנטיים^16,17, אשר מפריעים לתגובותיהם לכוח הכבידה⁹. לכן, מבחן גרביטקסיס מעודכן המגן מפני משתנים סביבתיים אחרים חשוב לניתוח המנגנונים של תהליך חושי זה.

בפרוטוקול הנוכחי מתוארת בדיקה לתצפית על Caenorhabditis gravitaxis. המערך למחקר זה מבוסס בחלקו על שיטה שפותחה כדי לחקור שלמות נוירומוסקולרית^18,19. זחלי דאואר מתורבתים ומבודדים באמצעות נהלים סטנדרטיים²⁰. לאחר מכן הם מוזרקים לתאים העשויים משני פיפטות סרולוגיות של 5 מ"ל מלאות באגר. תאים אלה יכולים להיות מכוונים אנכית או אופקית וממוקמים בתוך כלוב פאראדיי חשוך למשך 12-24 שעות כדי להגן מפני אור ושדות אלקטרומגנטיים. מיקומה של כל תולעת בתאים נרשם ומושווה למוניות האנכיות של זן ייחוס כגון C. elegans N2.

Protocol

הזנים המשמשים במחקר הנוכחי הם C. elegans (N2) ו - C. briggsae (AF16) (ראו טבלת חומרים). אוכלוסייה מעורבת של דאוארים שימשה לכל בדיקה.

1. הכנת הלשכה

1. עבודה במכסה אדים. הגדר את סביבת העבודה עם מבער Bunsen, 1-2 סכיני גילוח, צבת, פינצטה ומשטח חיתוך מפלסטיק (ראה טבלת חומרים).
2. עבור כל תא, לאסוף שני פיפטות סרולוגיות 5 מ"ל. הסר את תקע הכותנה מפיפטה אחת עם פינצטה. החזיקו סכין גילוח מעל מבער הבונזן עד שהוא חם בעזרת צבת. השתמשו בלהב המחומם כדי לחתוך את הקצה המחודד של הפיפטה השנייה, כך שלפיפטה כולה יהיה קוטר אחיד (איור 1A).
3. בעבודה מהירה, מקרבים את שני קצוות הפיפטה המותאמים ללהבה, וממיסים אותם מעט. חברו את הקצוות הללו על ידי לחיצה חזקה זה לזה, כדי להבטיח שהקירות של שני הפיפטות יהיו רציפים. אם רווחים כלשהם נראים לעין לאחר ההצטרפות, פרקו אותם זה מזה וחזרו על שלב זה (איור 1A,B).

2. מילוי התאים באגר

1. הכינו NGM עם 4% אגר לפי נהלי התולעת הסטנדרטיים²¹. בזמן שהאגר עדיין מותך, מלאו כל תא על ידי חיבורו לפיפטור סרולוגי ושרטוט איטי של התמיסה. אטמו את הקצה עם סרט פרפין לפני הסרת התא מהפיפטור. הניחו את התא שטוח (במקביל לספסל) כדי להתקרר.
   הערה: כיסוי הבקבוקון בעטיפת דבק (ראו טבלת חומרים) לאחר אוטוקלאבינג מסייע במניעת היווצרות בועות בתמיסה¹⁸.
   1. כדי למזער את השינויים בעקביות האגר עקב קירור לא אחיד, החזיקו את הפיפטור (ראו טבלת חומרים) במקביל למשטח הספסל תוך כדי שרטוט האגר. הניחו את התאים שטוחים על הספסל ואפשרו לאגר להתקשות לפני המעבר.
      הערה: ניתן להתאים את אחוז האגר ותוכן המדיה לניסוי. 4% אגר נוקשה יותר מהריכוז של כ-2% המשמש למזיגת צלחות ומונע מתולעים להתחפר דרך המדיום שבידינו. עם זאת, נסיינים אחרים הבחינו בהתנהגות מחילה של תולעים בוגרות בשיעור של עד 9% אגר^18,19.
2. לאחר הקירור, מחממים מקש הקסדצימלי בקוטר 3 מ"מ (או כלי מתכת אחר באותו גודל, ראו טבלת חומרים) מעל מבער בונזן. לחצו אותו בחוזקה לתוך הדופן של כל תא כ-5 מ"מ לצד אחד של קו האמצע, וצרו פתח קטן בפלסטיק (איור 1C). השתמש בלהב מחומם כדי להסיר את הכותנה ואת הקצוות המחודדים של התא ולאטום קצוות אלה עם סרט פרפין.
   הערה: לאחר ההכנה, יש להשתמש בכל תא תוך יום אחד או לשמור אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. כסו את כל הפתחים החשופים בסרט פרפין כדי למנוע מהאגר להתייבש.

3. בידוד זחלי דאואר

1. 10-15 ימים לפני הניסוי, חתכו כל זן על 2-3 צלחות NGM גדולות עם חיידקי OP50 ועטפו בסרט פרפין. לאחר 10-15 ימים, כל צלחת חייבת להיות מורעבת לחלוטין עם אלפי זחלי דאואר שנמצאים על האגר, הקירות והמכסים.
   הערה: הכינו צלחות מראש באמצעות מתכון OP50 עבה לצפיפות מרבית (ראו טבלת חומרים). היווצרות דאואר יכולה להיות מושרית גם באמצעות שיטות אחרות, כולל תוספת של פרומונים או על ידי גידול בטמפרטורות גבוהות יותר²².
2. אסוף תולעים על ידי שטיפת המכסים והצלחות עם מאגר M9 והזרמת התמיסה לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל. סובבו בעוצמה של 1,600 x גרם במשך 30-60 שניות בטמפרטורת החדר ושאפו את רוב מאגר M9 באמצעות פיפטה או שואב אבק.
3. יש לבודד דאוארים על ידי טיפול עם 1% SDS ואחריו שיפוע ציפה של 30% סוכרוז בעקבות דו"ח²⁰ שפורסם קודם לכן.
   1. יש להוסיף תמיסת SDS של 7 מ"ל 1% לכל כדור תולעת. השאירו את התולעים ב- SDS למשך 30 דקות; סובב את הצינורות ברציפות במהלך זמן זה כדי לאפשר אוורור. יש לשטוף 3-5x עם M9 כדי להסיר את חומר הניקוי.
   2. לאחר מכן, הוסף 5 מ"ל M9 ואחריו 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה ומסוננת 60%. מערבבים היטב, ולאחר מכן צנטריפוגה בגודל 1,600 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור שיפוע הפרדה.
4. מלא צינורות צנטריפוגה חדשים של 15 מ"ל עם 2 מ"ל של חיץ M9. מרסקים את קצוות הפיפטות של פסטר מזכוכית כדי להרחיב את הבור ומשתמשים בפיפטות אלה כדי להעביר את השכבה העליונה של התמיסה (המכילה דאוארים מבודדים) משיפוע הסוכרוז לצינורות החדשים. שטפו את הדאוארים 3-5x עם M9.
   הערה: בשלב זה יהיו אלפי דאוארים מבודדים בתמיסה. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי או לשמור על אוורור על ידי סיבוב ב-M9 של 5-7 מ"ל למשך הלילה.

4. הוספת דאוארים לחדר

1. צנטריפוגות בגודל 1,600 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ושואפות את רוב תמיסת M9 עם פיפטה או שואב אבק. כדי להעריך את צפיפות התולעים, ספרו ידנית את מספר התולעים בשלוש טיפות נפרדות של 1 μL תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש בממוצע של ספירות אלה כדי להעריך את מספר התולעים לכל μL.
   הערה: ייתכן שחלק מהפיפטורים בנפח קטן לא יוכלו להגיע לתחתית צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל; במקרה זה, טיפה מרוכזת של תולעים ניתן להעביר הראשון חתיכת סרט פרפין.
2. חותכים את הקצה של קצה פיפטה של 10, 20 או 200 μL כדי להרחיב את הבור. הגדר את המיקרופיפטה לנפח מעט גדול יותר מנפח השאיפה המיועד. שאפו כ-1-2 מיקרון של תמיסת התולעים המרוכזת (באופן אידיאלי בין 100-300 תולעים) ואפשרו לכמות קטנה של אוויר להיכנס לקצה.
   הערה: מספר גדול של תולעים (1,000+) בתא אחד עשוי להגדיל את טווח המרחקים שעברו עקב צפיפות^9.
3. דחפו בעדינות את קצה הפיפטה לתוך האגר תוך כדי דיכוי המיקרופיפטה. פעולה זו תיצור אתר הזרקה באגר מבלי לסתום את הקצה. משחררים את התולעים לתוך האגר. השתמשו בסרט פרפין כדי לאטום את הפתח.

5. ריצה וניקוד הבדיקה

הערה: ניתן לבדוק גרביטקסיס בתנאים שונים שעשויים להשפיע על התנהגות⁹.

1. כדי למנוע כמה שיותר משתנים, מקמו את התאים בתוך כלוב פאראדיי חשוך (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר.
2. תייג כל תא ותלה אותו אנכית בתוך כלוב פאראדיי (בצע זאת באמצעות סרט תיוג). בדוק בקרות אופקיות במקביל על ידי הנחת חלק מהתאים שטוחים באותם תנאים סביבתיים. בדוק את הזנים הניסיוניים נגד תולעי N2 בכיוון אנכי כבקרה חיובית. השתמש בתאים אופקיים המכילים דאוארים N2 כבקרה שלילית נוספת.
   הערה: יש לבצע בדיקות אופקיות ואנכיות באותה הגדרה בתוך המעבדה כדי למזער את השונות הסביבתית בין שני התנאים. ניתן להשתמש באינקובטור גדול כדי לשכן את שני כלובי פאראדיי.
3. דאוארים מתחילים להתפזר מאתר ההתחלה לאחר מספר שעות ולוקח כמה שעות להגיע לשני קצות החדר. השאירו את התאים ללא הפרעה במהלך תקופה זו והבקיע תוך 12-24 שעות לאחר ההזרקה.
   הערה: אין להשתמש במשותק (כגון נתרן אזיד) כדי לשתק תולעים שהגיעו לקצות התאים. מכיוון שההתפלגות הכוללת של התולעים נמדדת במקום מדד העדפה (כמו בבדיקה של שתי אפשרויות), נתרן אזיד הוא מיותר ועלול לשנות את התוצאות.
4. הסר והבקיע תאי גרביטקסיס בזה אחר זה. חפשו דאוארים חיים מתחת למיקרוסקופ מנתח וסמנו את מיקומם בדיו (איור 1C,D). אין לדרג תולעים בטווח של 2.5 ס"מ לאף אחד מהצדדים של אתר ההזרקה, מכיוון שתולעים אלה אינן צפויות להפגין העדפה כיוונית.
   1. כמו כן, הימנעו מניקוד תולעים שנראות מתות או לכודות בנוזל. יש להשליך את כל התאים המכילים >50% תולעים מתות או תולעים שוחות.
      הערה: לאחר הסרת התא מאזור הבדיקה, יש לדרג אותו מיד לדיוק. דאוארים חייבים להיות גלויים רק בין פני השטח של האגר לבין קיר הפיפטה. אם נצפתה התנהגות מחילה, שקול להגדיל את ריכוז האגר במבחנים עתידיים.
5. כדי לכמת את התוצאות, השתמש בסמן כדי לחלק כל מחצית של התא לשבעה חלקים של 3.5 ס"מ החל ממרחק של 2.5 ס"מ ממקום ההזרקה (בחלק מהפיפטות, 3.5 ס"מ = 1 מ"ל נפח). השתמש במונה ידני (ראה טבלת חומרים) כדי לספור את מספר התולעים שנצפו בכל סעיף.
   הערה: צריכים להיות שבעה חלקים בכל צד של המקור, אשר ניתן למספר מ -7 (למטה) ל +7 (למעלה). מספרים אלה חייבים להתאים לאותם מיקומים יחסיים בהתבסס על האופן שבו נבנו התאים; אגר נמשך מהקצה -7 לקצה +7 בשלב 2.

תוצאות

השוואת גרביטקסיס בין מינים שונים
בעקבות ההליך המתואר לעיל, C. briggsae dauer gravitaxis ניתן להשוות עם C. elegans gravitaxis ובקרות אופקיות. ההתפלגות האנכית (maroon) של C . briggsae dauers מוטה לכיוון צמרות התאים, כאשר אחוז גדול של תולעים מגיע ל-+7 (איור 2A). בניגוד לבקרות אופקיות (אקוו...

Discussion

השוואה עם שיטות קודמות
שלא כמו כימוטקסיס, לא ניתן לצפות באופן מהימן בגרביטקסיס בקאנורהבדיטיס באמצעות תכנון ניסיוני מסורתי של צלחת אגר. קוטרה של צלחת פטרי סטנדרטית הוא 150 מ"מ, וכתוצאה מכך רק 75 מ"מ זמינים בשני הכיוונים עבור דאוארים כדי להדגים את העדפת הגרביטקסיס. למרות שניתן ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers