Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

Resumen

El protocolo presentado describe el desarrollo y uso de una técnica de tinción de actina filamentosa basada en faloidina con microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para visualizar la estructura de la capa celular adherente en canales de cultivo dinámico microfluídico y cámaras tradicionales de cultivo estático de pozo fijo. Este enfoque ayuda a evaluar la confluencia de la capa celular, la formación de monocapa y la uniformidad del espesor de la capa.

Resumen

La experimentación microfluídica in vitro tiene un gran potencial para revelar muchos conocimientos sobre los fenómenos microfisiológicos que ocurren en afecciones como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y la lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI). Sin embargo, los estudios en canales microfluídicos con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales del pulmón humano se enfrentan actualmente a varios desafíos, especialmente debido a las dificultades para establecer condiciones apropiadas de cultivo celular, incluidas las tasas de flujo de medios, dentro de un entorno de cultivo dado. El protocolo presentado describe un enfoque basado en imágenes para evaluar la estructura de las células epiteliales pulmonares humanas NCI-H441 cultivadas en un canal microfluídico impermeable al oxígeno con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales del pulmón humano. Usando tinción de actina filamentosa basada en faloidina, las estructuras citoesqueléticas de las células se revelan mediante microscopía de barrido láser confocal, lo que permite la visualización de células individuales y en capas. La cuantificación posterior determina si las condiciones de cultivo celular empleadas están produciendo monocapas uniformes adecuadas para una mayor experimentación. El protocolo describe el cultivo celular y los métodos de evaluación de capas en canales microfluídicos y entornos tradicionales de pozos fijos. Esto incluye la construcción de canales, el cultivo celular y las condiciones requeridas, la fijación, la permeabilización y la tinción, las imágenes microscópicas confocales, el procesamiento de imágenes y el análisis de datos.

Introducción

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una afección aguda que surge del insulto y la propagación de la lesión en el parénquima pulmonar, que resulta en edema pulmonar de los alvéolos, intercambio gaseoso inadecuado e hipoxemia posterior¹. Esto inicia un ciclo de liberación de citoquinas proinflamatorias, reclutamiento de neutrófilos, liberación de mediadores tóxicos y daño tisular, que a su vez incurre en una respuesta inflamatoria adicional². Además, el surfactante pulmonar, que estabiliza las vías respiratorias y previene el daño causado por el reclutamiento/desreclutamiento repetitivo (R/D), puede ser inactivado o disfuncional por los procesos químicos que ocurren durante el SDRA, lo que resulta en más estrés y lesiones en el parénquima circundante³. Si se sufre un daño suficiente, puede ser necesaria la ventilación mecánica para asegurar una oxigenación sistémica adecuada⁴. Sin embargo, la ventilación mecánica impone sus propios desafíos y traumas, incluyendo la posibilidad de lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI), caracterizada como lesión del parénquima pulmonar causada por las tensiones mecánicas impuestas durante el sobreinflado (volutrauma) y/o la R/D de la interfaz aire-líquido en la vía aérea ocluida por líquido (atelectrauma)⁵. El gradiente de presión experimentado por las células epiteliales expuestas a una interfaz aire-líquido (como en un bronquiolo ocluido con líquido) en el modelo de atelectrauma puede resultar en una respuesta obstructiva originada por permeabilidad (POOR), lo que lleva a un ciclo virtuoso de lesión POOR-get-POORer ^6,7,8.

La experimentación in vitro puede proporcionar información a microescala sobre estos fenómenos, pero los estudios actuales en entornos de canales microfluídicos con dimensiones fisiológicamente relevantes enfrentan varios desafíos⁹. Por un lado, la optimización de las condiciones de cultivo celular plantea una barrera significativa para la entrada para la investigación de cultivos celulares en entornos microfluídicos, ya que existe una intersección estrecha dentro de la cual los parámetros de flujo del medio, la duración del cultivo y otras condiciones de cultivo permiten la formación óptima de la capa celular. Esto incluye las limitaciones de difusión impuestas por la naturaleza impermeable al oxígeno del recinto del canal de cultivo microfluídico. Esto requiere una cuidadosa consideración de los parámetros de flujo del medio, ya que los bajos caudales pueden privar a las células de oxígeno, especialmente a las más alejadas de la entrada; Por otro lado, los altos caudales pueden empujar a las células fuera del canal de cultivo o dar lugar a un desarrollo inadecuado o desigual de la capa. Las limitaciones de difusión pueden abordarse mediante el uso de materiales permeables al oxígeno como el polidimetilsiloxano (PDMS) en un aparato de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI); sin embargo, muchos canales de cultivo microfluídicos convencionales, como los del sistema de detección de impedancia de sustrato de celda eléctrica (ECIS), son inherentemente impermeables al oxígeno, dada la naturaleza del recinto fabricado¹⁰. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una técnica para analizar las capas celulares cultivadas en un recinto impermeable al oxígeno.

Al comparar la viabilidad de las condiciones de cultivo, las observaciones de características específicas de la capa, como la presencia de una monocapa, la topología de la superficie, la confluencia y la uniformidad del espesor de la capa, son necesarias para determinar si la capa celular producida por un conjunto particular de condiciones de cultivo cumple con las especificaciones deseadas y son realmente relevantes para el diseño experimental. Se puede realizar una evaluación limitada mediante métodos como ECIS, que utiliza mediciones del potencial eléctrico (voltaje) creado por la resistencia a la corriente alterna de alta frecuencia (CA) (impedancia) impuesta por membranas eléctricamente aislantes de células cultivadas en electrodos de oro dentro de la matriz de flujo. Al modular la frecuencia de CA aplicada a las células, las propiedades celulares específicas dependientes de la frecuencia de las células y las capas celulares, como la fuerza de adherencia superficial, la formación de la unión estrecha y la proliferación o confluencia celular, pueden ser dirigidas y examinadas¹¹. Sin embargo, estas formas indirectas de mediciones son algo difíciles de interpretar al inicio de un experimento, y pueden no cuantificar todos los aspectos relevantes de la capa celular. La simple observación de la capa celular bajo un microscopio de contraste de fase puede revelar la naturaleza de ciertas cualidades como la confluencia; sin embargo, muchas características relevantes, como la presencia de una monocapa y la uniformidad del espesor de la capa, requieren una evaluación tridimensional (3D) que no es posible con imágenes microscópicas fluorescentes, de campo claro, contraste de fase o fluorescentes¹².

El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica de tinción de actina filamentosa para permitir la verificación basada en imágenes de una monocapa y la evaluación de la uniformidad de la capa celular utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM). La actina filamentosa (F-actina) se consideró un objetivo apropiado para el conjugado fluoróforo, debido en parte a la forma en que la actina F sigue estrechamente la membrana celular, permitiendo una aproximación visual de todo el volumen celular¹³. Otro beneficio importante de dirigirse a la actina F es la manera en que la tinción de la actina F dilucida visualmente las interrupciones o alteraciones citoesqueléticas impuestas por las tensiones y tensiones experimentadas por las células. La fijación de reticulación con formaldehído libre de metanol fue utilizada para preservar la morfología de las células y la capa celular, ya que los fijadores deshidratantes como el metanol tienden a aplanar las células, distorsionando groseramente la capa celular y alterando sus propiedades^14,15.

Para determinar la capacidad de la técnica de evaluación de capas para mitigar estos desafíos, las células se cultivaron en cámaras de cultivo tradicionales de ocho pocillos, así como en canales microfluídicos para evaluar las diferencias, si las hubiera, en las capas celulares que se produjeron. Para los pozos de cultivo fijos, se utilizaron unidades de vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos. Para el cultivo microfluídico, las matrices de flujo (longitud del canal 50 mm, ancho 5 mm, profundidad 0,6 mm) fueron optimizadas para cultivar células epiteliales pulmonares humanas inmortalizadas (NCI-H441) en un ambiente con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales presentes en la zona respiratoria del pulmón humano¹⁶. Si bien este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta el entorno de cultivo de las matrices de flujo ECIS, puede aplicarse a cualquier entorno de cultivo dinámico impermeable al oxígeno para el cual es necesaria la evaluación de las características de la capa celular cultivada o las condiciones de cultivo.

Protocolo

Para el presente estudio se utilizó la línea de células pulmonares epiteliales humanas NCI-H441 (ver Tabla de Materiales).

1. Cultivo celular en el canal microfluídico

1. Fabrica el canal microfluídico y realiza el pretratamiento siguiendo los pasos a continuación.
   1. Obtenga una matriz de flujo de un solo canal (consulte la Tabla de materiales) y separe la parte superior de la placa base de policarbonato.
   2. Obtenga una cubierta de vidrio rectangular #1.5 (espesor 0.17 mm) con dimensiones de 60 mm x 22 mm. Limpie las superficies del vidrio de cobertura en un baño ultrasónico y trate un lado con una solución de 0,1 mg / ml de poli-D-lisina a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de secar a 60 °C durante 30 minutos.
   3. Coloque un adhesivo de doble cara de 0,13 mm de espesor (consulte la Tabla de materiales), cortado con láser para acomodar las dimensiones de la parte superior de la matriz de flujo y el canal de flujo (50 mm de longitud, 5 mm de ancho), en la parte superior de la matriz de flujo, teniendo cuidado de alinear con precisión los recortes del canal¹⁷.
   4. Fije un espaciador mylar de 0,1 mm de espesor (consulte la Tabla de materiales), cortado con láser para acomodar las dimensiones de la parte superior de la matriz de flujo y el canal de flujo, a la tira adhesiva, teniendo cuidado de alinear con precisión los recortes del canal.
   5. Repita los pasos 1.1.3 y 1.1.4 hasta que se alcance la altura de canal deseada (por ejemplo, para una altura de canal de 0,6 mm, utilice dos espaciadores y tres tiras adhesivas).
   6. Fije una cubierta de vidrio rectangular a la tira adhesiva más inferior con el lado tratado con poli-D-lisina orientado hacia el adhesivo. Una vez completado el montaje, como se indica en la Figura 1, aplique una presión firme e igual en la parte superior e inferior de la construcción y mantenga durante 1 minuto.
      NOTA: La construcción del recinto del canal, que incluye vidrio de cobertura, adhesivos, espaciadores y parte superior de la matriz de flujo, ya está completa.
   7. Enjuague el canal con agua desionizada con una jeringa, verificando simultáneamente si hay fugas.
   8. Esterilice la carcasa del canal en un esterilizador ultravioleta (UV) durante 30 min¹⁸.
   9. Utilizando la técnica estéril, tratar el canal con 2,0 μg/ml de fibronectina humana (ver Tabla de materiales) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubar durante al menos 30 min a 37 °C¹⁹.
2. Realizar cultivo celular en el canal microfluídico siguiendo los pasos a continuación.
   1. En una campana de flujo laminar estéril, use una micropipeta para transferir una suspensión uniforme de células NCI-H441 en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) (ver Tabla de materiales) para sembrar dos canales microfluídicos, cada uno con células a una densidad superficial de 150,000 células / cm².
      1. Para canales de 50 mm x 5 mm x 0,6 mm, use 0,25 ml de una suspensión de 2,5 x 10⁶ celdas/ml para llenar cada canal, así como una parte de los puertos. Verifique que las células se hayan distribuido uniformemente dentro de los canales utilizando un microscopio de campo claro.
   2. Cultivar los dos canales durante 24 h y 48 h respectivamente a 37 °C con 5% de_CO2 utilizando una bomba de jeringa programable (ver Tabla de materiales), extrayendo los medios gastados del canal y los medios frescos en el canal desde un depósito de medios estéril conectado a la entrada del canal compuesto por una jeringa de 20 ml cortada cubierta con película de parafina.
      1. Después de un período de espera de 10 minutos después de la siembra celular, introducir y bombear medios frescos desde el depósito a través del canal a una velocidad de flujo variable que comienza en 0.2 μL / min y aumenta hasta 10 μL / min durante 4 h, manteniendo a esa velocidad a partir de entonces²⁰.
         NOTA: Este caudal variable proporciona condiciones de cultivo que permiten a las células (1) asentarse gravitacionalmente en la superficie de cultivo, (2) adherirse a la superficie de cultivo y (3) formar una monocapa confluente.
3. Realizar la fijación celular dentro de los canales microfluídicos utilizando solución de formaldehído.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y debe manipularse en una campana extractora química apropiada²¹.
   1. En una campana extractora química, prepare soluciones de formaldehído usando formaldehído al 4% en PBS (sin metanol) (consulte la Tabla de materiales) para crear dos porciones de 4 ml, diluyendo la primera a una concentración de formaldehído al 1% y la segunda a formaldehído al 2% usando solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; con Ca 2+ y Mg²⁺) como diluyente. Transfiera las soluciones de formaldehído a jeringas separadas de 5 ml y etiquételas en consecuencia. Extraiga 20 ml de DPBS en una jeringa separada de 20 ml.
   2. Retire los canales microfluídicos del aparato de cultivo y colóquelos en la campana extractora de humos químicos.
   3. Montar el aparato de fijación y tinción.
      1. Conecte un segmento de 10 cm de tubo de transferencia al puerto lateral de una llave de paso de tres vías a través de un adaptador de púa de manguera de bloqueo Luer macho (consulte Tabla de materiales), luego conecte la llave de paso al puerto de entrada de la matriz de flujo.
      2. A continuación, conecte otro segmento de 10 cm de tubo de transferencia al puerto de salida de la matriz de flujo utilizando el mismo tipo de adaptador de púa de manguera.
      3. Finalmente, asegure los extremos libres de ambos tubos de transferencia en un contenedor de desechos químicos y de riesgo biológico, como un tubo de centrífuga cónica vacío de 50 ml etiquetado.
   4. Gire la llave de paso para bloquear el puerto de entrada de la matriz de flujo y enjuague la línea de descarga con DPBS. Luego, gire la llave de paso para bloquear la línea de desechos y lave lentamente las celdas con 2 ml de DPBS. Repita el paso de lavado usando la nueva solución cada vez. Se introduce una nueva solución (o concentración de solución) en el canal.
   5. Empuje lentamente 2 ml de solución fijadora al 1% a través del canal y luego deje reposar durante 5 min²².
   6. Empuje lentamente 2 ml de solución fijadora al 2% a través del canal y luego deje reposar durante 15 minutos.
   7. Lave las células introduciendo lentamente 2 ml de DPBS fresco en el canal en tres instancias separadas (5 min cada una).
   8. Complete los pasos 1.3.3-1.3.7 para ambos canales microfluídicos en paralelo.
4. Tiñe, permeabiliza y agrega medios de montaje a las celdas en el canal microfluídico.
   1. Prepare una solución de saponina al 0,1% agregando 1 mg de saponina (consulte la Tabla de materiales) por ml de DPBS para producir 4 ml de solución y un vórtice suave para mezclar²³. Extraiga 8 ml de DPBS en una jeringa de 20 ml.
   2. Agregue un reactivo de faloidina que tiñe F-actina y un reactivo Hoechst que tiñe el núcleo (consulte la Tabla de materiales) a la solución de saponina al 0,1%, a dos gotas (0,1 ml) de cada reactivo por ml de solución de saponina. Mantenga la solución de tinción/permeabilización preparada lejos de la luz cubriendo con papel de aluminio²⁴.
   3. Enjuague la línea con una pequeña cantidad de solución de tinción/permeabilización (como se describe en el paso 1.3.4), luego introduzca 2 ml de la solución en el canal microfluídico y cubra el canal con papel de aluminio antes de dejarlo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
   4. Enjuague la solución de tinción/permeabilización dos veces con 2 ml de DPBS durante 5 minutos por descarga.
   5. Para una mejor calidad de imagen, agregue un medio de montaje adecuado (con un índice de refracción que coincida estrechamente con el aceite del objetivo del microscopio y el vidrio de la cubierta, consulte la Tabla de materiales) en el canal.
      1. Con una micropipeta, introduzca una cantidad mínima de un montante antidecolorante de fijación suave en cada puerto del canal microfluídico, asegurándose de que la superficie inferior esté completamente cubierta y que no queden burbujas atrapadas dentro del área de imagen deseada²⁵. Selle los extremos del canal y verifique la integridad de la capa celular observando bajo un microscopio de campo claro.
   6. Complete los pasos 1.4.3-1.4.5 para ambos canales microfluídicos en paralelo.
      NOTA: Celdas de imagen tan pronto como sea posible después de la tinción para obtener la máxima calidad de imagen. Si se produce fotoblanqueo o se desea un almacenamiento a largo plazo, se pueden utilizar otros medios de montaje con propiedades antidecoloración o de preservación de muestras. Tenga en cuenta que los medios de montaje de curado duro distorsionarán la estructura 3D de las celdas y, por extensión, la capa celular; Por esta razón, es preferible el soporte de montaje de ajuste suave²⁶.
5. Imágenes de células en el canal microfluídico siguiendo los pasos a continuación.
   1. Ajuste la configuración del microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales), incluidos los parámetros de potencia, ganancia, desplazamiento y escaneo del láser, como la velocidad de escaneo, el área de escaneo, el formato de escaneo, la resolución y el diámetro 27 del orificio²⁷.
   2. Pruebe la ubicación de las imágenes tomando escaneos de referencia, así como pilas Z hasta que se hayan cumplido los parámetros y condiciones de imagen deseados. Parámetros de marcación en objetivos de aumento secuencialmente más altos hasta que se haya alcanzado el objetivo de inmersión en aceite 40x y optimizado²⁸.
   3. Usando la placa base de la matriz de flujo como referencia, construya pilas Z en cinco ubicaciones, en la ubicación potencial del primer electrodo en el lado de entrada, a medio camino entre el centro y la ubicación anterior, el centro, a medio camino entre el centro y la ubicación del último electrodo (en el lado de salida), y en el último electrodo, como se indica en la Figura 2.
6. Realizar procesamiento de imágenes y análisis de datos.
   1. Exporte secciones transversales XZ e YZ utilizando el paquete de software de microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales).
   2. Utilizando un software de procesamiento de imágenes (consulte Tabla de materiales) con capacidades de detección de bordes (valor de umbral 15.0), mida el área total de la imagen en píxeles utilizando la herramienta Varita mágica fuera de la imagen, luego el área excluyendo el área de sección transversal total de la capa de celda en píxeles utilizando la herramienta Varita mágica en la parte de la imagen exterior a la capa de celda²⁹.
   3. Utilizando software de procesamiento de datos (consulte la Tabla de materiales), reste el valor del píxel del área exterior del valor del píxel del área total para encontrar el valor del píxel del área de la sección transversal.
   4. Convierta los valores de píxeles de área de sección transversal a valores de μm² multiplicando los valores de píxeles por el cuadrado del valor de μm/píxel, como se indica en el software del microscopio para la imagen en particular (0,31 μm/píxel para pilas Z tomadas en resolución 1024p sin zoom en una lente de inmersión en aceite de 40x).
   5. Calcular medias y desviaciones estándar de los datos y graficar los resultados.

Figura 1: Esquema de vista explotada de la construcción del canal microfluídico. El elemento superior es la parte superior de la matriz de flujo, los elementos grises delgados son tiras adhesivas, los elementos azules delgados son espaciadores mylar y el elemento inferior es el vidrio de cubierta rectangular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cinco ubicaciones de imágenes a lo largo de la región productora de capas consistentes del canal de cultivo microfluídico. Las ubicaciones de las imágenes son las siguientes: lado de entrada, cerca de donde estaría el primer electrodo en la matriz de flujo intacta; a medio camino entre la ubicación del lado de entrada y el centro del canal; centro del canal; A medio camino entre el centro y la ubicación del lado de salida, y el lado de salida, cerca de donde estaría el último electrodo en la matriz de flujo intacta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cultivo celular en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos

1. Realice el tratamiento previo de la cubierta de vidrio de ocho pocillos.
   1. Obtenga un vidrio de cubierta estéril de ocho pocillos fabricado con un vidrio de cubierta # 1.5 y un tratamiento superficial que aumenta la adherencia celular (Figura 3, consulte la Tabla de materiales).
   2. Utilizando una técnica estéril, tratar la superficie de los pocillos de cultivo con 2,0 μg/ml de fibronectina humana en PBS e incubar durante al menos 30 min a 37 °C¹⁹.
2. Realice el cultivo celular en el vidrio de cubierta con cámara siguiendo los pasos a continuación.
   1. En una campana de flujo laminar estéril, transfiera porciones de 0.5 ml de soluciones de células NCI-H441 suspendidas uniformemente en medio RPMI 1640 con 10% de FBS a densidades volumétricas de 81,000, 162,000 y 324,000 células / ml para sembrar los pocillos de cultivo a densidades superficiales de 45,000, 90,000 y 180,000 células / cm², respectivamente. Verifique que las células se hayan distribuido uniformemente dentro de los pocillos usando un microscopio de campo claro.
   2. Cultivar células durante 24 h, 48 h y 96 h a 37 °C con 5% de_CO2, sustituyendo diariamente los medios.
3. Realice la fijación de formaldehído en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y debe manipularse en una campana extractora química apropiada²¹.
   1. En una campana extractora química, prepare soluciones de formaldehído haciendo dos porciones de formaldehído al 4% en PBS (sin metanol), diluyendo la primera a una concentración de formaldehído al 1% y la otra a formaldehído al 2% utilizando solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; con Ca 2+ y Mg²⁺) como diluyente.
   2. Retire el vidrio de cubierta con cámara de cultivo de ocho pocillos de la incubadora y colóquelo en la campana extractora de humos químicos.
   3. Lave suavemente las células con 0,5 ml de DPBS usando una micropipeta introduciendo lentamente líquido a lo largo de la parte superior de la esquina de cada pocillo.
   4. Retire el líquido existente en cada pocillo extrayéndolo lentamente de la esquina de los pocillos con una micropipeta. Utilizando el método de introducción líquida (paso 2.3.3), introducir 0,5 ml de solución fijadora al 1% en cada pocillo y dejar reposar durante 5 min²².
   5. Eliminar el líquido existente en cada pocillo utilizando el método de extracción de líquidos mencionado en el paso 2.3.4. Utilizando el método de introducción de líquidos mencionado en el paso 2.3.3, introducir 0,5 ml de solución fijadora al 2% en cada pocillo y dejar reposar durante 15 minutos.
   6. Utilizando los métodos de introducción y extracción de líquidos (pasos 2.3.3 y 2.3.4), lave las celdas introduciendo y eliminando 0,5 ml de DPBS fresco en cada pocillo en tres instancias separadas durante 5 minutos cada una.
4. Realice la tinción, permeabilización y adición de medios de montaje en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos.
   1. Prepare una solución de saponina al 0,1% agregando 1 mg de saponina por ml de DPBS y mezcle suavemente²³.
   2. A la solución de saponina al 0,1%, agregue dos gotas (0,1 ml) de cada una de un reactivo faloidina con tinción de actina F y un reactivo Hoechst para teñir el núcleo por ml de solución de saponina. Mantenga la solución preparada alejada de la luz cubriendo con papel de aluminio²⁴.
   3. Introduzca 0,2 ml de solución de tinción/permeabilización en cada pocillo y cubra el vidrio de cubierta con papel de aluminio antes de dejarlo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
   4. Enjuague la solución de tinción/permeabilización dos veces con 0,5 ml de DPBS.
   5. Para una mejor calidad de imagen, agregue un medio de montaje adecuado (con un índice de refracción que coincida estrechamente con el aceite objetivo del microscopio y el vidrio de la cubierta) en los pozos.
      1. Usando una micropipeta, introduzca una cantidad mínima de un montante antidecolorante de fijación suave en cada pocillo, asegurándose de que la superficie inferior esté completamente cubierta y que no queden burbujas atrapadas dentro del área de imagen deseada²⁵. Verifique la integridad de la capa celular observando bajo un microscopio de campo claro.
         NOTA: Celdas de imagen tan pronto como sea posible después de la tinción para obtener la máxima calidad de imagen. Si se produce fotoblanqueo o se desea un almacenamiento a largo plazo, se pueden utilizar otros medios de montaje con propiedades antidecoloración o de preservación de muestras. Tenga en cuenta que los medios de montaje de curado duro distorsionarán la estructura 3D de las celdas y, por extensión, la capa de celda, por lo que es preferible un medio de montaje de fraguado suave²⁶.
5. Realice imágenes en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos.
   1. Ajuste la configuración del microscopio confocal, incluidos los parámetros de potencia, ganancia, desplazamiento y escaneo del láser, como la velocidad de escaneo, el área de escaneo, el formato de escaneo, la resolución y el diámetro²⁷ del orificio del láser.
   2. Pruebe la ubicación de las imágenes tomando escaneos de referencia, así como pilas Z hasta que se hayan cumplido los parámetros y condiciones de imagen deseados. Parámetros de marcación en objetivos de aumento secuencialmente más altos hasta que se haya alcanzado el objetivo de inmersión en aceite 40x y optimizado²⁸.
   3. Construye pilas Z de tres ubicaciones aleatorias en cada coincidencia entre densidad de siembra y duración de cultivo.
6. Realizar procesamiento de imágenes y análisis de datos.
   1. Exporte secciones transversales XZ e YZ utilizando el paquete de software de microscopio confocal.
   2. Utilizando un software de procesamiento de imágenes con capacidades de detección de bordes (valor de umbral 15.0), mida el área total de la imagen en píxeles utilizando la herramienta Varita mágica fuera de la imagen, luego el área excluyendo el área de sección transversal total de la capa de celda en píxeles utilizando la herramienta Varita mágica en la parte de la imagen exterior a la capa de celda²⁹.
   3. Con un software de procesamiento de datos, reste el valor del píxel del área exterior del valor del píxel del área total para encontrar el valor del píxel del área transversal.
   4. Convierta los valores de píxeles del área de la sección transversal a valores de μm² multiplicando los valores de píxeles por el cuadrado del valor de μm/píxel como se indica en el software del microscopio para la imagen en particular (0,31 μm/píxel para pilas Z tomadas en resolución 1024p sin zoom en una lente de inmersión en aceite de 40x).
   5. Calcular medias y desviaciones estándar y graficar resultados.

Figura 3: Diagrama del vidrio de cubierta de ocho pocillos utilizado para el experimento de cultivo, tinción e imagen de pozo fijo que compara los efectos de la densidad inicial de siembra celular y la duración del cultivo en la formación de capas celulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

El método presentado permite la visualización de capas celulares epiteliales cultivadas en canales de cultivo microfluídico y utiliza una demostración en entornos tradicionales de cultivo celular de pozo fijo como validación. Las imágenes adquiridas existirán en un espectro de calidad, intensidad de señal y especificidad de objetivo celular. Las imágenes exitosas demostrarán un alto contraste, lo que permitirá el análisis de imágenes y la cuantificación de datos para su posterior evaluación estadística. L...

Discusión

El protocolo presentado describe el cultivo, la fijación de reticulación, la tinción, la permeabilización y la visualización microscópica confocal de células epiteliales pulmonares humanas NCI-H441 en el entorno dinámico de una matriz de flujo microfluídico de un solo canal, así como en el entorno estático de un vidrio de cubierta tradicional de ocho pocillos. Con cualquier protocolo de cultivo celular microfluídico, las condiciones de flujo de los medios de cultivo celular son de suma importancia, ya que el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System	Nikon	A1R HD25	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)	Invitrogen	R37110	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered	3M	468MP	https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes	Air-Tite RL5	14-817-53	https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet	BAISDY	AS022	https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	15-336-100	https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human	Fisher Scientific	CB-40008	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040133	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array	Applied BioPhysics	1F8x10E PC	https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White	Enterprise Technology Solutions	50-211-1163	https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140079	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes	Thermo Scientific	4642090	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	06-443-21	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5)	Fisher Scientific	12-544-GP	https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-458	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free)	Invitrogen	FB002	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji	ImageJ	ImageJ Fiji	https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc	Nikon	MXA22168	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel	Thermo Scientific	3950	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System	Laxco	LMC3BF1	https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK	Masterflex	ZY-45505-31	https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel	Microsoft	0016	https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes	Thermo Scientific	03-377-24	https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-174	https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600	https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR	Nikon	NIS Elements AR	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Invitrogen	R37605	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155411	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film	Fisher Scientific	S37441	https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch	PendoTech	ZY-19406-49	https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4	Gibco	10010023	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine	Gibco	A3890401	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil	Reynolds	458742928317	https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin	Millipore Sigma (Sigma Aldrich)	47036	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant	Invitrogen	S36917-5X2ML	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package	Thermo Scientific	13-100-752PM	https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft	Cole-Parmer	EW-95702-01	https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01