Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Sunulan protokol, mikroakışkan dinamik kültür kanallarında ve geleneksel sabit kuyu statik kültür odalarında yapışkan hücre tabakası yapısını görselleştirmek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile falloidin bazlı filamentöz-aktin boyama tekniğinin geliştirilmesini ve kullanımını açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre katmanı akıcılığını, tek katmanlı oluşumu ve katman kalınlığı homojenliğini değerlendirmeye yardımcı olur.
İn vitro mikroakışkan deneyler, akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) ve ventilatöre bağlı akciğer hasarı (VILI) gibi durumlarda meydana gelen mikrofizyolojik fenomenler hakkında birçok içgörü ortaya çıkarmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, insan akciğerinin terminal bronşiyolleriyle fizyolojik olarak ilgili boyutlara sahip mikroakışkan kanallardaki çalışmalar, özellikle belirli bir kültür ortamında medya akış hızları da dahil olmak üzere uygun hücre kültürü koşullarının oluşturulmasındaki zorluklar nedeniyle şu anda çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Sunulan protokol, oksijen geçirimsiz bir mikroakışkan kanalda kültürlenmiş NCI-H441 insan akciğer epitel hücrelerinin yapısını, fizyolojik olarak insan akciğerinin terminal bronşiyolleriyle ilgili boyutlarla değerlendirmek için görüntü tabanlı bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Phalloidin bazlı filamentli-aktin boyama kullanılarak, hücrelerin sitoiskelet yapıları konfokal lazer tarama mikroskobu ile ortaya çıkarılır ve bireysel ve katmanlı hücrelerin görselleştirilmesine izin verilir. Daha sonraki niceleme, kullanılan hücre kültürü koşullarının daha fazla deney için uygun tek tip tek katmanlar üretip üretmediğini belirler. Protokol, mikroakışkan kanallarda ve geleneksel sabit kuyu ortamlarında hücre kültürü ve katman değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Buna kanal yapımı, hücre kültürü ve gerekli koşullar, fiksasyon, geçirgenlik ve boyama, konfokal mikroskobik görüntüleme, görüntü işleme ve veri analizi dahildir.
Akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), akciğer parankiminde yaralanmanın bozulması ve yayılmasından kaynaklanan, alveollerin pulmoner ödemi, yetersiz gaz değişimi ve ardından hipoksemi ile sonuçlanan akut bir durumdur1. Bu, pro-inflamatuar sitokin salınımı, nötrofil alımı, toksik mediatör salınımı ve doku hasarı döngüsünü başlatır ve bu da daha fazla enflamatuar yanıta neden olur2. Ek olarak, hava yollarını stabilize eden ve tekrarlayan işe alım / işe alımın (Ar-Ge) neden olduğu hasarı önleyen pulmoner sürfaktan ARDS sırasında meydana gelen kimyasal işlemler tarafından inaktive edilebilir veya başka bir şekilde işlevsiz hale getirilebilir, bu da çevredeki parankimde daha fazla stres ve yaralanmaya neden olabilir3. Yeterli hasar devam ederse, yeterli sistemik oksijenasyonu sağlamak için mekanik ventilasyon gerekebilir4. Bununla birlikte, mekanik ventilasyon, aşırı şişirme (volutravma) ve/veya sıvı tıkalı hava yolundaki hava-sıvı arayüzünün Ar/Ge'si (atelektravma) sırasında uygulanan mekanik streslerin neden olduğu akciğer parankiminin yaralanması olarak karakterize edilen ventilatöre bağlı akciğer hasarı (VILI) olasılığı da dahil olmak üzere kendi zorluklarını ve travmalarını ortaya koymaktadır5. Atelektravma modelinde hava-sıvı arayüzüne (sıvı tıkalı bronşiyolde olduğu gibi) maruz kalan epitel hücrelerinin yaşadığı basınç gradyanı, geçirgenlik kaynaklı bir obstrüktif yanıta (POOR) neden olabilir ve bu da POOR-get-POORer erdemli yaralanma döngüsüne yol açabilir 6,7,8.
İn vitro deneyler bu fenomenler hakkında mikro ölçekli içgörüler sağlayabilir, ancak fizyolojik olarak ilgili boyutlara sahip mikroakışkan kanal ortamlarındaki mevcut çalışmalar çeşitli zorluklarla karşı karşıyakalmaktadır 9. Birincisi, hücre kültürü koşullarının optimize edilmesi, mikroakışkan ortamlarda hücre kültürü araştırmasına girişte önemli bir engel oluşturur, çünkü ortam akış parametrelerinin, kültür süresinin ve diğer kültür koşullarının optimal hücre katmanı oluşumuna izin verdiği dar bir kesişim vardır. Bu, mikroakışkan kültür kanalı muhafazasının oksijen geçirimsiz doğası tarafından uygulanan difüzyon sınırlamalarını içerir. Bu, ortam akış parametrelerinin dikkatli bir şekilde dikkate alınmasını gerektirir, çünkü düşük akış hızları hücreleri, özellikle girişten en uzak olanları oksijenden mahrum bırakabilir; Öte yandan, yüksek akış hızları hücreleri kültür kanalının dışına itebilir veya yanlış veya düzensiz katman gelişimine neden olabilir. Difüzyon sınırlamaları, bir hava-sıvı arayüzü (ALI) kültür cihazında polidimetilsiloksan (PDMS) gibi oksijen geçirgen malzemeler kullanılarak ele alınabilir; Bununla birlikte, elektrik hücresi-substrat empedans algılama (ECIS) sistemi gibi birçok geleneksel mikroakışkan kültür kanalı, üretilen muhafazanın doğası göz önüne alındığında, doğal olarak oksijen geçirimsizdir10. Bu protokol, oksijen geçirimsiz bir muhafazada kültürlenmiş hücre katmanlarını analiz etmek için bir teknik sağlamayı amaçlamaktadır.
Kültür koşullarının uygulanabilirliğini karşılaştırırken, tek katmanlı bir katmanın varlığı, yüzey topolojisi, akıcılık ve katman kalınlığı homojenliği gibi belirli katman özelliklerinin gözlemleri, belirli bir kültür koşulları kümesi tarafından üretilen hücre katmanının istenen spesifikasyonları karşılayıp karşılamadığını ve gerçekten deneysel tasarımla ilgili olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Sınırlı bir değerlendirme, akış dizisi içindeki altın elektrotlar üzerinde kültürlenmiş hücrelerin elektriksel olarak yalıtkan membranları tarafından uygulanan yüksek frekanslı alternatif akıma (AC) (empedans) direnç tarafından oluşturulan elektrik potansiyeli (voltaj) ölçümlerini kullanan ECIS gibi yöntemlerle gerçekleştirilebilir. Hücrelere uygulanan AC frekansını modüle ederek, hücrelerin ve hücre katmanlarının yüzey yapışma kuvveti, sıkı bağlantı noktası oluşumu ve hücre proliferasyonu veya akıcılığı gibi spesifik frekansa bağlı hücresel özellikleri hedeflenebilir ve incelenebilir11. Bununla birlikte, bu dolaylı ölçüm biçimlerinin bir deneyin başlangıcında yorumlanması biraz zordur ve hücre katmanının tüm ilgili yönlerini ölçemeyebilir. Hücre tabakasını bir faz-kontrast mikroskobu altında basitçe gözlemlemek, akıcılık gibi belirli niteliklerin doğasını ortaya çıkarabilir; Bununla birlikte, tek katmanlı ve katman kalınlığı homojenliğinin varlığı gibi birçok ilgili özellik, parlak alan, faz kontrastı veya floresan mikroskobik görüntüleme12 ile mümkün olmayan üç boyutlu (3B) bir değerlendirme gerektirir.
Bu çalışmanın amacı, tek katmanlı bir tabakanın görüntüleme tabanlı doğrulanmasına ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak hücre tabakası homojenliğinin değerlendirilmesine olanak tanıyan bir filamentli-aktin boyama tekniği geliştirmektir. Filamentöz-aktin (F-aktin), kısmen F-aktin'in hücre zarını sıkıca takip etmesi ve tüm hücre hacminingörsel bir şekilde yaklaşmasına izin vermesi nedeniyle florofor konjugatı için uygun bir hedef olarak kabul edildi. F-aktin'i hedeflemenin bir diğer önemli yararı, F-aktin'in boyanmasının, hücrelerin yaşadığı stres ve suşların dayattığı sitoiskelet bozulmalarını veya değişikliklerini görsel olarak aydınlatmasıdır. Metanol içermeyen formaldehit ile çapraz bağlama fiksasyonu, hücrelerin ve hücre tabakasının morfolojisini korumak için kullanılmıştır, çünkü metanol gibi dehidratasyon fiksatifleri hücreleri düzleştirme, hücre tabakasını büyük ölçüde bozma ve özelliklerini değiştirme eğilimindedir14,15.
Katman değerlendirme tekniğinin bu zorlukları hafifletme yeteneğini belirlemek için, hücreler, eğer varsa, üretilen hücre katmanlarındaki farklılıkları değerlendirmek için geleneksel sekiz kuyucuklu kültür odalarında ve mikroakışkan kanallarda kültüre alınmıştır. Sabit kültür kuyuları için sekiz kuyucuklu odacıklı kapak camı üniteleri kullanılmıştır. Mikroakışkan kültür için, akış dizileri (kanal uzunluğu 50 mm, genişlik 5 mm, derinlik 0.6 mm), insan akciğerinin solunum bölgesinde bulunan terminal bronşiyollerle fizyolojik olarak ilgili boyutlara sahip bir ortamda kültürlenmiş insan akciğer epiteli (NCI-H441) hücrelerini kültürlemek için optimize edilmiştir16. Bu protokol, ECIS akış dizilerinin kültür ortamı göz önünde bulundurularak geliştirilmiş olsa da, kültürlenmiş hücre tabakası özelliklerinin veya kültür koşullarının değerlendirilmesinin gerekli olduğu herhangi bir oksijen geçirimsiz dinamik-kültür ortamı için geçerli olabilir.
Bu çalışmada NCI-H441 insan epitelyal akciğer hücre hattı kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Mikroakışkan kanaldaki hücre kültürü
Resim 1: Mikroakışkan kanal konstrüksiyonunun patlamış görünüm şeması. Üst eleman akış dizisinin üst kısmıdır, ince gri elemanlar yapışkan şeritlerdir, ince mavi elemanlar mylar ara parçalardır ve alt eleman dikdörtgen kapak camıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroakışkan kültür kanalının sürekli katman üreten bölgesi boyunca beş görüntüleme yeri. Görüntüleme konumları aşağıdaki gibidir: giriş tarafı, ilk elektrotun bozulmamış akış dizisinde olacağı yere yakın; giriş tarafı konumu ile kanalın merkezi arasında yarı yolda; kanalın merkezi; merkez ile çıkış tarafı konumu arasında ve çıkış tarafı arasında, son elektrotun bozulmamış akış dizisinde olacağı yere yakın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
2. Sekiz kuyucuklu kapak camında hücre kültürü
Şekil 3: İlk hücre tohumlama yoğunluğunun ve kültür süresinin hücre katmanlarının oluşumu üzerindeki etkilerini karşılaştıran sabit kuyucuklu kültür, boyama ve görüntüleme deneyi için kullanılan sekiz kuyucuklu odacıklı kapak camının diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Sunulan yöntem, mikroakışkan kültür kanallarında kültürlenen epitel hücre katmanlarının görselleştirilmesine izin verir ve doğrulama olarak geleneksel sabit kuyucuklu hücre kültürü ortamlarında bir gösterim kullanır. Elde edilen görüntüler bir kalite, sinyal yoğunluğu ve hücresel hedef özgüllüğü spektrumunda bulunacaktır. Başarılı görüntüler yüksek kontrast gösterecek ve sonraki istatistiksel değerlendirme için görüntü analizine ve verilerin nicelleştirilmesine izin verecekt...
Sunulan protokol, NCI-H441 insan akciğer epitel hücrelerinin kültürünü, çapraz bağlama fiksasyonunu, boyanmasını, geçirgenliğini ve konfokal mikroskobik görselleştirmesini, tek kanallı bir mikroakışkan akış dizisinin dinamik ortamında ve ayrıca geleneksel sekiz kuyulu odacıklı bir kapak camının statik ortamında açıklamaktadır. Herhangi bir mikroakışkan hücre kültürü protokolünde, hücre kültürü ortamının akış koşulları çok önemlidir, çünkü yüksek oranlı akış hücreler...
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Yazarlar, Alan Shepardson'a mikroakışkan kanal yapımında kullanılan 3M yapıştırıcı ve mylar levha için kesme desenini tasarladığı ve hücre kültürü ortam akış hızını ve şırınga pompası programlamasını test ettiği için teşekkür eder. Finansman NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 ve Newcomb-Tulane College Dean's Grant tarafından sağlandı.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
A1R HD25 Confocal Microscope System | Nikon | A1R HD25 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications |
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) | Invitrogen | R37110 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 |
Adhesive Transfer Tape Double Linered | 3M | 468MP | https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/ |
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes | Air-Tite RL5 | 14-817-53 | https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml |
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet | BAISDY | AS022 | https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC |
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | 15-336-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100 |
Corning Fibronectin, Human | Fisher Scientific | CB-40008 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true |
DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 |
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array | Applied BioPhysics | 1F8x10E PC | https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E |
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White | Enterprise Technology Solutions | 50-211-1163 | https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 |
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes | Thermo Scientific | 4642090 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090 |
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 06-443-21 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269 |
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) | Fisher Scientific | 12-544-GP | https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-458 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 |
Gibco RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093 |
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) | Invitrogen | FB002 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002 |
ImageJ Fiji | ImageJ | ImageJ Fiji | https://imagej.net/downloads |
Immersion Oil F 30 cc | Nikon | MXA22168 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications |
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel | Thermo Scientific | 3950 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950 |
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System | Laxco | LMC3BF1 | https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1 |
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK | Masterflex | ZY-45505-31 | https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB |
Microsoft Excel | Microsoft | 0016 | https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547 |
National Target All-Plastic Disposable Syringes | Thermo Scientific | 03-377-24 | https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8 |
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-174 | https://www.atcc.org/products/htb-174 |
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | https://www.syringepump.com/NE-16001800.php |
NIS Elements AR | Nikon | NIS Elements AR | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605 |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155411 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 |
Parafilm M Wrapping Film | Fisher Scientific | S37441 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441 |
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch | PendoTech | ZY-19406-49 | https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649 |
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
Poly-D-Lysine | Gibco | A3890401 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401 |
Reynolds Aluminum Wrap Foil | Reynolds | 458742928317 | https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M |
Saponin | Millipore Sigma (Sigma Aldrich) | 47036 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036 |
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant | Invitrogen | S36917-5X2ML | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML |
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package | Thermo Scientific | 13-100-752PM | https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood |
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft | Cole-Parmer | EW-95702-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır