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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo presentato descrive lo sviluppo e l'uso di una tecnica di colorazione filamentosa-actina a base di falloidina con microscopia a scansione laser confocale (CLSM) per visualizzare la struttura dello strato cellulare aderente nei canali di coltura dinamica microfluidica e nelle tradizionali camere di coltura statica a pozzo fisso. Questo approccio aiuta a valutare la confluenza dello strato cellulare, la formazione del monostrato e l'uniformità dello spessore dello strato.

Abstract

La sperimentazione microfluidica in vitro ha un grande potenziale per rivelare molte informazioni sui fenomeni microfisiologici che si verificano in condizioni come la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e il danno polmonare indotto da ventilatore (VILI). Tuttavia, gli studi su canali microfluidici con dimensioni fisiologicamente rilevanti per i bronchioli terminali del polmone umano affrontano attualmente diverse sfide, soprattutto a causa delle difficoltà nello stabilire condizioni di coltura cellulare appropriate, comprese le velocità di flusso dei media, all'interno di un determinato ambiente di coltura. Il protocollo presentato descrive un approccio basato su immagini per valutare la struttura di cellule epiteliali polmonari umane NCI-H441 coltivate in un canale microfluidico impermeabile all'ossigeno con dimensioni fisiologicamente rilevanti per i bronchioli terminali del polmone umano. Utilizzando la colorazione filamentosa-actina a base di falloidina, le strutture citoscheletriche delle cellule vengono rivelate dalla microscopia a scansione laser confocale, consentendo la visualizzazione di cellule individuali e stratificate. La quantificazione successiva determina se le condizioni di coltura cellulare impiegate producono monostrati uniformi adatti per ulteriori sperimentazioni. Il protocollo descrive i metodi di coltura cellulare e di valutazione degli strati nei canali microfluidici e nei tradizionali ambienti a pozzetti fissi. Ciò include la costruzione del canale, la coltura cellulare e le condizioni richieste, la fissazione, la permeabilizzazione e la colorazione, l'imaging microscopico confocale, l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

Introduzione

La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è una condizione acuta derivante dalla beffa e dalla propagazione di lesioni nel parenchima polmonare, con conseguente edema polmonare degli alveoli, scambio gassoso inadeguato e successiva ipossiemia1. Questo avvia un ciclo di rilascio di citochine pro-infiammatorie, reclutamento di neutrofili, rilascio di mediatori tossici e danno tissutale, che a sua volta comporta un'ulteriore risposta infiammatoria2. Inoltre, il tensioattivo polmonare, che stabilizza le vie aeree e previene i danni causati dal reclutamento / dereclutamento ripetitivo (R / D), può essere inattivato o ....

Protocollo

Per il presente studio è stata utilizzata la linea cellulare polmonare epiteliale umana NCI-H441 (vedere Tabella dei materiali).

1. Coltura cellulare nel canale microfluidico

  1. Fabbricare il canale microfluidico ed eseguire il pretrattamento seguendo i passaggi seguenti.
    1. Ottenere un array di flusso a canale singolo (vedere la tabella dei materiali) e separare la parte superiore dalla piastra di base in policarbonato.
    2. Ottenere un coperchio rettangolare #1.5 (spessore 0,17 mm) con dimensioni di 60 mm x 22 mm. Pulire le superfici del vetro di copertura in un bagno ad ....

Risultati

Il metodo presentato consente la visualizzazione di strati cellulari epiteliali coltivati in canali di coltura microfluidica e utilizza una dimostrazione in ambienti tradizionali di coltura cellulare a pozzetto fisso come convalida. Le immagini acquisite esisteranno su uno spettro di qualità, intensità del segnale e specificità del bersaglio cellulare. Le immagini di successo dimostreranno un elevato contrasto, consentendo l'analisi delle immagini e la quantificazione dei dati per la successiva valutazione statistica........

Discussione

Il protocollo presentato descrive la coltura, la fissazione della reticolazione, la colorazione, la permeabilizzazione e la visualizzazione microscopica confocale delle cellule epiteliali polmonari umane NCI-H441 nell'ambiente dinamico di un array di flusso microfluidico a canale singolo, nonché nell'ambiente statico di un tradizionale vetro di copertura a otto pozzetti. Con qualsiasi protocollo di coltura cellulare microfluidica, le condizioni di flusso dei terreni di coltura cellulare sono di fondamentale importanza, .......

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Alan Shepardson per aver progettato il modello di taglio per l'adesivo 3M e il foglio di mylar utilizzati nella costruzione di canali microfluidici e per aver testato la portata dei media di coltura cellulare e la programmazione della pompa a siringa. Il finanziamento è stato fornito da NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 e Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

....

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
A1R HD25 Confocal Microscope SystemNikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)InvitrogenR37110https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered3M468MPhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable SyringesAir-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar SheetBAISDYAS022https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning BathBranson Ultrasonics15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, HumanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesiumGibco14040133https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow ArrayApplied BioPhysics1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, WhiteEnterprise Technology Solutions50-211-1163https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume PipettesThermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge TubesFisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5)Fisher Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single UseFisher Scientific14-955-458https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 MediumGibco11875093https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ FijiImageJImageJ Fijihttps://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 ccNikonMXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless SteelThermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope SystemLaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft ExcelMicrosoft0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable SyringesThermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung CellsAmerican Type Culture Collection (ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe PumpNew Era Pump SystemsNE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements ARNikonNIS Elements ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered CoverglassThermo Scientific155411https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping FilmFisher ScientificS37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer BranchPendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4Gibco10010023https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-LysineGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap FoilReynolds458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
SaponinMillipore Sigma (Sigma Aldrich)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade MountantInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet PackageThermo Scientific13-100-752PMhttps://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 FtCole-ParmerEW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

Riferimenti

  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational In....

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