Preparazione e valutazione strutturale di monostrati di cellule epiteliali in un dispositivo di coltura microfluidica di dimensioni fisiologiche

Riepilogo

Il protocollo presentato descrive lo sviluppo e l'uso di una tecnica di colorazione filamentosa-actina a base di falloidina con microscopia a scansione laser confocale (CLSM) per visualizzare la struttura dello strato cellulare aderente nei canali di coltura dinamica microfluidica e nelle tradizionali camere di coltura statica a pozzo fisso. Questo approccio aiuta a valutare la confluenza dello strato cellulare, la formazione del monostrato e l'uniformità dello spessore dello strato.

Abstract

La sperimentazione microfluidica in vitro ha un grande potenziale per rivelare molte informazioni sui fenomeni microfisiologici che si verificano in condizioni come la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e il danno polmonare indotto da ventilatore (VILI). Tuttavia, gli studi su canali microfluidici con dimensioni fisiologicamente rilevanti per i bronchioli terminali del polmone umano affrontano attualmente diverse sfide, soprattutto a causa delle difficoltà nello stabilire condizioni di coltura cellulare appropriate, comprese le velocità di flusso dei media, all'interno di un determinato ambiente di coltura. Il protocollo presentato descrive un approccio basato su immagini per valutare la struttura di cellule epiteliali polmonari umane NCI-H441 coltivate in un canale microfluidico impermeabile all'ossigeno con dimensioni fisiologicamente rilevanti per i bronchioli terminali del polmone umano. Utilizzando la colorazione filamentosa-actina a base di falloidina, le strutture citoscheletriche delle cellule vengono rivelate dalla microscopia a scansione laser confocale, consentendo la visualizzazione di cellule individuali e stratificate. La quantificazione successiva determina se le condizioni di coltura cellulare impiegate producono monostrati uniformi adatti per ulteriori sperimentazioni. Il protocollo descrive i metodi di coltura cellulare e di valutazione degli strati nei canali microfluidici e nei tradizionali ambienti a pozzetti fissi. Ciò include la costruzione del canale, la coltura cellulare e le condizioni richieste, la fissazione, la permeabilizzazione e la colorazione, l'imaging microscopico confocale, l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

Introduzione

La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è una condizione acuta derivante dalla beffa e dalla propagazione di lesioni nel parenchima polmonare, con conseguente edema polmonare degli alveoli, scambio gassoso inadeguato e successiva ipossiemia¹. Questo avvia un ciclo di rilascio di citochine pro-infiammatorie, reclutamento di neutrofili, rilascio di mediatori tossici e danno tissutale, che a sua volta comporta un'ulteriore risposta infiammatoria². Inoltre, il tensioattivo polmonare, che stabilizza le vie aeree e previene i danni causati dal reclutamento / dereclutamento ripetitivo (R / D), può essere inattivato o ....

Protocollo

Per il presente studio è stata utilizzata la linea cellulare polmonare epiteliale umana NCI-H441 (vedere Tabella dei materiali).

1. Coltura cellulare nel canale microfluidico

1. Fabbricare il canale microfluidico ed eseguire il pretrattamento seguendo i passaggi seguenti.
   1. Ottenere un array di flusso a canale singolo (vedere la tabella dei materiali) e separare la parte superiore dalla piastra di base in policarbonato.
   2. Ottenere un coperchio rettangolare #1.5 (spessore 0,17 mm) con dimensioni di 60 mm x 22 mm. Pulire le superfici del vetro di copertura in un bagno ad ....

Risultati

Il metodo presentato consente la visualizzazione di strati cellulari epiteliali coltivati in canali di coltura microfluidica e utilizza una dimostrazione in ambienti tradizionali di coltura cellulare a pozzetto fisso come convalida. Le immagini acquisite esisteranno su uno spettro di qualità, intensità del segnale e specificità del bersaglio cellulare. Le immagini di successo dimostreranno un elevato contrasto, consentendo l'analisi delle immagini e la quantificazione dei dati per la successiva valutazione statistica........

Discussione

Il protocollo presentato descrive la coltura, la fissazione della reticolazione, la colorazione, la permeabilizzazione e la visualizzazione microscopica confocale delle cellule epiteliali polmonari umane NCI-H441 nell'ambiente dinamico di un array di flusso microfluidico a canale singolo, nonché nell'ambiente statico di un tradizionale vetro di copertura a otto pozzetti. Con qualsiasi protocollo di coltura cellulare microfluidica, le condizioni di flusso dei terreni di coltura cellulare sono di fondamentale importanza, .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System	Nikon	A1R HD25	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin)	Invitrogen	R37110	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered	3M	468MP	https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes	Air-Tite RL5	14-817-53	https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet	BAISDY	AS022	https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	15-336-100	https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human	Fisher Scientific	CB-40008	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040133	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array	Applied BioPhysics	1F8x10E PC	https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White	Enterprise Technology Solutions	50-211-1163	https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140079	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes	Thermo Scientific	4642090	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	06-443-21	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5)	Fisher Scientific	12-544-GP	https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-458	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free)	Invitrogen	FB002	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji	ImageJ	ImageJ Fiji	https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc	Nikon	MXA22168	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel	Thermo Scientific	3950	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System	Laxco	LMC3BF1	https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK	Masterflex	ZY-45505-31	https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel	Microsoft	0016	https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes	Thermo Scientific	03-377-24	https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-174	https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600	https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR	Nikon	NIS Elements AR	https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Invitrogen	R37605	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155411	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film	Fisher Scientific	S37441	https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch	PendoTech	ZY-19406-49	https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4	Gibco	10010023	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine	Gibco	A3890401	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil	Reynolds	458742928317	https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin	Millipore Sigma (Sigma Aldrich)	47036	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant	Invitrogen	S36917-5X2ML	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package	Thermo Scientific	13-100-752PM	https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft	Cole-Parmer	EW-95702-01	https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01