Monitorización espaciotemporal rápida y eficiente de la metilación normal y aberrante de la citosina en embriones intactos de pez cebra

Resumen

Este artículo describe un protocolo para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina normal y aberrante dentro de embriones intactos de pez cebra.

Resumen

La metilación de la citosina está altamente conservada en todas las especies de vertebrados y, como impulsor clave de la programación epigenética y el estado de la cromatina, desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario temprano. Las modificaciones enzimáticas impulsan la metilación activa y la desmetilación de la citosina en 5-metilcitosina (5-mC) y la posterior oxidación de 5-mC en 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina y 5-carboxilcitosina. La reprogramación epigenética es un período crítico durante el desarrollo en el útero , y la exposición materna a sustancias químicas tiene el potencial de reprogramar el epigenoma dentro de la descendencia. Esto puede causar resultados adversos como consecuencias fenotípicas inmediatas, efectos a largo plazo sobre la susceptibilidad a enfermedades en adultos y efectos transgeneracionales de marcas epigenéticas hereditarias. Aunque la secuenciación basada en bisulfito permite a los investigadores interrogar la metilación de la citosina a la resolución del par de bases, los enfoques basados en la secuenciación son prohibitivos y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la metilación de la citosina en las etapas de desarrollo, múltiples concentraciones por sustancia química y replicar embriones por tratamiento. Debido a la facilidad de las imágenes automatizadas in vivo , las manipulaciones genéticas, el rápido tiempo de desarrollo ex utero y la cría durante la embriogénesis, los embriones de pez cebra continúan siendo utilizados como un modelo fisiológicamente intacto para descubrir vías mediadas por xenobióticos que contribuyen a resultados adversos durante el desarrollo embrionario temprano. Por lo tanto, utilizando anticuerpos específicos de 5-mC disponibles comercialmente, describimos una estrategia rentable para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina dentro de embriones individuales e intactos de pez cebra aprovechando la inmunohistoquímica de montaje completo, imágenes automatizadas de alto contenido y procesamiento eficiente de datos utilizando lenguaje de programación antes del análisis estadístico. Según el conocimiento actual, este método es el primero en detectar y cuantificar con éxito los niveles de 5 mC in situ dentro de embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano. El método permite la detección de la metilación del ADN dentro de la masa celular y también tiene la capacidad de detectar la metilación de la citosina de los ARNm maternos localizados en la yema durante la transición materna a cigótica. En general, este método será útil para la identificación rápida de sustancias químicas que tienen el potencial de interrumpir la metilación de la citosina in situ durante la reprogramación epigenética.

Introducción

Las modificaciones enzimáticas impulsan la metilación activa y la desmetilación de la citosina en 5-metilcitosina (5-mC) y la posterior oxidación de 5-mC en 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina y 5-carboxilcitosina ^1,2. El fosfato de tris(1,3-dicloro-2-propil) (TDCIPP) es un retardante de llama ampliamente utilizado en los Estados Unidos que se ha demostrado previamente que altera la trayectoria de la metilación de la citosina después de la exposición embrionaria temprana desde 0,75 horas después de la fertilización (hpf) hasta la gastrulación temprana (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Dentro de los vertebrados, el 5-mC y sus derivados modificados son críticos para regular el desarrollo embrionario temprano⁹. La fertilización de un embrión desencadena la desmetilación del ADN parental, seguida de la degradación del ARNm materno, la activación del genoma cigótico y la remetilación del genoma cigótico⁹. Los procesos biológicamente relevantes que utilizan la metilación de la citosina incluyen la modificación de histonas, el reclutamiento de maquinaria transcripcional, la metilación del ARN, la reprogramación epigenética y la determinación de la estructura de la cromatina^10,11. La metilación de la citosina también se conserva entre las especies de vertebrados, lo que subraya la importancia de comprender e investigar cómo la metilación aberrante de la citosina puede afectar la trayectoria del desarrollo de un organismo¹¹. Además, el desarrollo in utero es sensible a la exposición materna y tiene el potencial de causar resultados adversos tales como consecuencias fenotípicas inmediatas, efectos a largo plazo sobre la susceptibilidad a enfermedades adultas y efectos transgeneracionales de marcas epigenéticas hereditarias^12,13,14.

Largos tramos de pares citosina-guanina, o islas CpG, han sido los focos primarios de los investigadores que tienen como objetivo caracterizar la dinámica de la metilación de la citosina a través del genoma^15,16,17. Las estrategias basadas en bisulfito, como la secuenciación de bisulfito del genoma completo, la secuenciación de bisulfito de representación reducida y la secuenciación de amplicón de bisulfito, representan el estándar de oro para interrogar la metilación de citosina a resolución de pares de bases. Sin embargo, los enfoques basados en la secuenciación tienen un costo prohibitivo y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la metilación de la citosina en las etapas de desarrollo, múltiples concentraciones por producto químico y replicar embriones por tratamiento. Además, los enfoques basados en la secuenciación no proporcionan información sobre la localización espacial, que es fundamental para comprender los tipos de células potencialmente afectadas y las áreas dentro de un embrión en desarrollo. De manera similar, los ensayos globales de metilación del ADN, como el análisis de restricción dependiente de la metilación, los inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) de 5-mC y la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de 5-metil-2'-desoxicitidina (5-mC) se basan en homogeneizados celulares o tisulares y, como tales, excluyen la capacidad de monitorear la localización y magnitud de la metilación de citosina en el espacio y el tiempo dentro de especímenes intactos^12,18.

Debido a la facilidad de las imágenes automatizadas in vivo , las manipulaciones genéticas, el rápido tiempo de desarrollo ex utero y la cría durante la embriogénesis, los embriones de pez cebra continúan siendo ampliamente utilizados como modelos fisiológicamente intactos para descubrir vías mediadas por xenobióticos que contribuyen a resultados adversos durante el desarrollo embrionario temprano. Por lo tanto, utilizando anticuerpos disponibles comercialmente específicos para 5-mC, el siguiente protocolo describe una estrategia rentable para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de la citosina dentro de embriones individuales e intactos de pez cebra aprovechando la inmunohistoquímica de montaje completo (IHC), imágenes automatizadas de alto contenido y procesamiento eficiente de datos utilizando lenguaje de programación antes del análisis estadístico.

Según el conocimiento actual, este método es el primero en monitorear 5-mC dentro de embriones intactos de pez cebra. El método permite la detección de la metilación del ADN dentro de la masa celular y también tiene la capacidad de detectar la metilación de la citosina de los ARNm maternos localizados en la yema durante la transición materna a cigótica. En general, este método será útil para la identificación rápida de sustancias químicas que tienen el potencial de interrumpir la metilación de la citosina in situ durante la reprogramación epigenética.

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Protocolo

Los criadores adultos fueron manejados y tratados de acuerdo con un protocolo de uso de animales aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (# 20180063) en la Universidad de California, Riverside.

1. Recolección de embriones de pez cebra y exposición química

1. Agregue trampas de reproducción en el tanque a los tanques que contengan peces cebra machos y hembras adultos sexualmente maduros y reproductivamente viables. Agregue al menos tres trampas por tanque de 6 L al menos 12 h antes de la recolección a ~ 9:00 AM, que es el tiempo aproximado de fertilización y desove de los huevos dentro de los tanques.
2. Prepare una solución de exposición fresca en la mañana de la recolección. La solución de exposición se prepara utilizando una pipeta de 5 ml y añadiendo 5,0 ml de agua del sistema libre de partículas a una placa de Petri de vidrio de 60 mm.
3. Luego, use una pipeta microcapilar de vidrio de 10 μL para transferir 10 μL de vehículo (dimetilsulfóxido o DMSO) o solución madre química al agua del sistema en el plato de vidrio.
4. Agite la placa de Petri de vidrio para asegurarse de que la solución madre se disipe. Agregue otros 5.0 ml de agua del sistema a la placa de Petri de vidrio. Agite la placa de Petri de vidrio para homogeneizar la solución de exposición.
5. Repita para cada grupo de tratamiento en réplicas de cuatro para obtener cuatro réplicas por tratamiento.
6. Después de que se hayan preparado las soluciones de exposición, tape los platos de vidrio con tapas de vidrio para minimizar la evaporación.
7. Mientras retira las trampas de reproducción de cada tanque, permita cuidadosamente que el agua dentro de cada trampa drene hacia el tanque antes de retirarla de los tanques. Asegúrese de que las trampas permanezcan con el lado derecho hacia arriba.
8. Transfiera las trampas de cría al fregadero del laboratorio y enjuáguelas con una botella de chorro llena de agua de ósmosis inversa (OI) en una red de peces previamente empapada en lejía al 10% y enjuagada con agua. Enjuague los embriones hasta que todos los desechos se eliminen y solo queden embriones limpios.
9. Transfiera los embriones de la red de pesca utilizando una botella de chorro llena de agua RO a una placa de Petri de plástico de 100 mm. Clasifique aleatoriamente 50 embriones vivos a las 0,75 h después de la fertilización (hpf) y elimine el exceso de agua RO.
10. Usando una microespátula, coloque los embriones clasificados en la solución de tratamiento. Todos los embriones deben estar dentro del vehículo o solución de tratamiento no antes de las 9:45 AM. Agite los platos de vidrio para asegurarse de que los embriones estén recubiertos uniformemente dentro de la solución de tratamiento.
11. Después de configurar cuatro platos replicados (N = 50 por réplica) para cada grupo de tratamiento, coloque la tapa de vidrio encima de los platos de exposición y transfiera todos los platos a una incubadora con temperatura controlada a 28 °C hasta 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf o 10 hpf.
12. Preparar paraformaldehído fresco al 4% (PFA) al menos 4 h antes de la terminación de la exposición y almacenar a 4 °C.
    1. Encienda la placa calefactora a 115 °C, haga 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (2 ml de 10x PBS + 18 ml de agua RO) en un tubo de centrífuga de 50 ml y pese 800 mg de paraformaldehído.
    2. Dentro de una campana extractora de humos químicos, transferir 1x solución de PBS a un erlenmeyer de 250 ml, añadir 800 mg de paraformaldehído y, a continuación, añadir 2 μL de NaOH de 10 N. Coloque un termómetro dentro del matraz, coloque el matraz en la placa caliente y observe la temperatura mientras remueve.
    3. Cuando la temperatura alcance los 62-65 °C, retire el PFA al 4% de la placa caliente y deje que se enfríe a temperatura ambiente (RT). Conservar el PFA al 4% a 4 °C.
13. Una vez finalizada la duración de la exposición, retire los embriones de la incubadora y transfiera todos los embriones vivos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aspirar la solución de exposición residual con una pipeta de 1 ml. No aspire ningún embrión.
14. Agregue 500 μL de PFA refrigerada al 4% a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y mezcle los embriones en PFA al 4% invirtiendo varias veces. Permita que los embriones se fijen en 4% de PFA durante la noche.
    NOTA: No se recomienda permitir que los embriones permanezcan en PFA durante más de 12 h.

2. Decorionación de embriones

1. Al día siguiente, aspire el PFA al 4%, resuspenda los embriones en 1x PBS y pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo durante 30 s. Si es necesario, detener el protocolo en este paso y almacenar los embriones en 1x PBS a 4 °C durante un máximo de 48 h.
2. Usando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera cuidadosamente los embriones fijos a un plato de vidrio lleno de agua RO y agite suavemente durante 30 s. Repita este paso una vez más.
3. Use agujas de jeringa con un aumento de 5.0x usando un microscopio estereoscópico estándar para descorionar manualmente todos los embriones. Haga esto usando la punta de la aguja para perforar el corion y despegarlo suavemente de la yema y la masa celular⁴.
4. Una vez que los embriones hayan sido descorionados, use una pipeta microcapilar de vidrio para transferir hasta 25 embriones intactos a una canasta de inmunoquímica (IHC) y coloque la cesta IHQ en una placa de 96 pocillos. Use una pipeta de 1 ml para aspirar el agua RO de cada pocillo.

3. Inmunohistoquímica con anticuerpos específicos 5-mC

1. Resuspender los embriones en 500 μL de tampón de bloqueo (1x PBST + 2% de suero de oveja + 2 mg/ml de albúmina de suero bovino) por pocillo, y envolver la placa con parafilm y papel de aluminio para protegerlos de la luz. Incubar a 4 °C durante 4 h en un agitador orbital (100 rpm).
2. Retire la envoltura de parafilm y el aluminio y use una pipeta de 1 ml para aspirar el tampón de bloqueo de cada pocillo. Reemplácelo con 500 μL de una dilución 1:100 de anticuerpo monoclonal de ratón anti-5-mC en el tampón de bloqueo. Incubar todos los embriones con anticuerpos primarios, excepto un subconjunto de embriones de control del vehículo que se incubarán con el tampón de bloqueo para tener en cuenta el ruido de fondo. Tenga cuidado de no interrumpir la integridad de los embriones, ni de aspirar embriones durante este paso.
3. Vuelva a envolver la placa en parafilm y papel de aluminio y deje que la placa se incube a 4 °C durante la noche en un agitador orbital (100 rpm).
4. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios de cada pocillo y reemplácela con 1x PBS + 0.1% Tween-20 (1x PBST). Lave cada pocillo tres veces con 1x PBST durante 15 minutos por lavado en un agitador orbital (100 rpm).
5. Reemplace 1x PBST con una dilución 1:500 del anticuerpo IgG anti-ratón de cabra en el tampón de bloqueo e incube todos los embriones con el anticuerpo secundario. Deje que la placa se incube a 4 °C durante la noche en un agitador orbital (100 rpm).
6. Al día siguiente, retire el anticuerpo secundario y lave la solución residual tres veces con 1x PBST durante 15 minutos por lavado en un agitador orbital (100 rpm).
   NOTA: El protocolo se puede detener aquí hasta 48 h si las cestas IHC se almacenan en pozos limpios llenos de 1x PBS.
7. Use una pipeta de 1 ml para aspirar 1x PBST de cada pocillo y coloque la canasta IHC en una placa de Petri de vidrio llena de agua RO. Bajo un microscopio estereoscópico estándar, clasifique aleatoriamente los embriones intactos en una placa de 96 pocillos, lo que resulta en un embrión por pocillo.
8. Con una pipeta de 1 ml, retire toda el agua RO de los pocillos individuales y reemplácela con 200 μL de 1x PBS. Centrifugar la placa durante 3 min a 1 x g.

4. Imágenes automatizadas de embriones dentro de placas de 96 pocillos

1. Imagen de los embriones con un objetivo 2x bajo luz transmitida y FITC utilizando un sistema de detección de alto contenido (Tabla de materiales).
   NOTA: Una imagen fluorescente de cada embrión fue capturada automáticamente usando el aumento mencionado anteriormente y un filtro FITC¹⁹.
   1. Seleccione Enfoque automático para asegurarse de que el enfoque de la cámara está en la parte inferior de la placa y desplazado por el grosor inferior.
   2. Seleccione una longitud de onda FITC con una duración de exposición de 100 ms y configure el enfoque automático en láser con un desplazamiento Z. Observe y confirme la adquisición adecuada de imágenes en varios pozos antes de comenzar la adquisición de placas.
      NOTA: El instrumento adquiere automáticamente imágenes de todos los pocillos seleccionados que contienen embriones. Una placa de 96 pocillos requirió aproximadamente 30 minutos para la adquisición de imágenes y el almacenamiento de datos. Durante el período de adquisición, la temperatura interna dentro del sistema de imágenes se mantuvo en RT.
2. Después de la adquisición de imágenes, realice análisis de datos utilizando el sistema de detección de alto contenido y un procedimiento de análisis de imágenes automatizado personalizado. Seleccione cada embrión en la placa de 96 pocillos para analizar el área total y la intensidad integrada de fluorescencia.
   NOTA: El análisis incluyó proporcionar imágenes que contenían superposiciones de puntos de datos del análisis.
3. A continuación, tabule los puntos de datos y expórtelos desde el sistema de detección de alto contenido yendo a Medir y seleccionando Open Data Log en una hoja de cálculo. Las partes de adquisición de placas y análisis de datos se representan en la Figura 1.

5. Análisis de datos

1. Cargue la hoja de cálculo exportada en un programa informático donde se utiliza el paquete deployer (dplyr) para ordenar, sumar datos para cada pozo y filtrar por número de pozo. El paquete writexl se utiliza para exportar los datos sumados a una hoja de cálculo. El código de programa 5mC se muestra en el archivo complementario 1.

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Resultados

El objetivo general de este protocolo es determinar si un tratamiento afecta la abundancia relativa de 5 mC mediante la evaluación del área total y la intensidad relativa de la fluorescencia dentro de embriones fijos y marcados de pez cebra. Después de completar el protocolo, se puede usar un microscopio estereoscópico de fluorescencia para determinar primero si la IHC de montaje completo fue exitosa. Cuando los embriones marcados se observan bajo un filtro FITC o GFP, un resultado positivo se indica mediante una se?...

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Discusión

Durante este protocolo, hay algunos pasos que son críticos. En primer lugar, al descorionar embriones, es importante apuntar la aguja lejos del tejido del embrión / saco vitelino / masa celular, ya que estas porciones del embrión en desarrollo son muy frágiles y fáciles de perforar. En segundo lugar, al transferir embriones marcados a pocillos individuales, use una pipeta de vidrio para transferir embriones, ya que se adherirán a una pipeta de plástico. En tercer lugar, cuando realice IHC de montaje completo, aseg...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML