Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra.

Resumo

A metilação da citosina é altamente conservada em todas as espécies de vertebrados e, como um dos principais impulsionadores da programação epigenética e do estado de cromatina, desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário inicial. As modificações enzimáticas impulsionam a metilação ativa e a desmetilação da citosina em 5-metilcitosina (5-mC) e subsequente oxidação de 5-mC em 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina. A reprogramação epigenética é um período crítico durante o desenvolvimento no útero , e a exposição materna a produtos químicos tem o potencial de reprogramar o epigenoma dentro da prole. Isso pode potencialmente causar resultados adversos, como consequências fenotípicas imediatas, efeitos a longo prazo na suscetibilidade à doença em adultos e efeitos transgeracionais de marcas epigenéticas hereditárias. Embora o sequenciamento baseado em bissulfito permita que os pesquisadores questionem a metilação da citosina na resolução do par de bases, as abordagens baseadas em sequenciamento são proibitivas em termos de custo e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a metilação da citosina nos estágios de desenvolvimento, múltiplas concentrações por produto químico e replicar embriões por tratamento. Devido à facilidade de imagens automatizadas in vivo , manipulações genéticas, rápido tempo de desenvolvimento ex utero e criação durante a embriogênese, os embriões de peixe-zebra continuam a ser usados como um modelo fisiologicamente intacto para descobrir vias mediadas por xenobióticos que contribuem para resultados adversos durante o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, usando anticorpos específicos de 5 mC comercialmente disponíveis, descrevemos uma estratégia econômica para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação da citosina em embriões individuais e intactos de peixe-zebra, aproveitando a imuno-histoquímica completa, imagens automatizadas de alto conteúdo e processamento de dados eficiente usando linguagem de programação antes da análise estatística. Para o conhecimento atual, este método é o primeiro a detectar e quantificar com sucesso os níveis de 5 mC in situ dentro de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial. O método permite a detecção da metilação do DNA dentro da massa celular e também tem a capacidade de detectar a metilação da citosina de mRNAs maternos localizados na gema durante a transição materna-zigótica. No geral, este método será útil para a rápida identificação de produtos químicos que têm o potencial de interromper a metilação da citosina in situ durante a reprogramação epigenética.

Introdução

As modificações enzimáticas conduzem à metilação ativa e à desmetilação da citosina em 5-metilcitosina (5-mC) e subsequente oxidação de 5-mC em 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina ^1,2. O fosfato de tris(1,3-dicloro-2-propil) (TDCIPP) é um retardador de chama amplamente utilizado nos Estados Unidos que já demonstrou alterar a trajetória de metilação da citosina após exposição embrionária precoce de 0,75 horas pós-fertilização (hpf) até gastrulação precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Dentro dos vertebrados, o 5-mC e seus derivados modificados são críticos para regular o desenvolvimento embrionário precoce⁹. A fertilização de um embrião desencadeia a desmetilação do DNA parental, seguida pela degradação do mRNA materno, ativação do genoma zigótico e remetilação do genoma zigótico⁹. Processos biologicamente relevantes que utilizam metilação de citosina incluem modificação de histonas, recrutamento de maquinário transcricional, metilação de RNA, reprogramação epigenética e determinação da estrutura da cromatina^10,11. A metilação da citosina também é conservada entre as espécies de vertebrados, ressaltando a importância de compreender e investigar como a metilação aberrante da citosina pode afetar a trajetória do desenvolvimento de um organismo¹¹. Além disso, o desenvolvimento in utero é sensível à exposição materna e tem o potencial de causar desfechos adversos, como consequências fenotípicas imediatas, efeitos a longo prazo na suscetibilidade à doença do adulto e efeitos transgeracionais de marcas epigenéticas hereditárias^12,13,14.

Longos trechos de pares citosina-guanina, ou ilhas CpG, têm sido os focos primários de pesquisadores que visam caracterizar a dinâmica da metilação da citosina em todo o genoma^15,16,17. Estratégias baseadas em bissulfito, como sequenciamento de bissulfito de genoma inteiro, sequenciamento de bissulfito de representação reduzida e sequenciamento de amplificador de bissulfito representam o padrão-ouro para interrogar a metilação da citosina na resolução do par de bases. No entanto, as abordagens baseadas em sequenciamento são proibitivas em termos de custo e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a metilação da citosina em estágios de desenvolvimento, múltiplas concentrações por produto químico e replicar embriões por tratamento. Além disso, as abordagens baseadas em sequenciamento não fornecem informações sobre localização espacial, o que é crítico para a compreensão de tipos de células e áreas potencialmente afetadas dentro de um embrião em desenvolvimento. Da mesma forma, ensaios globais de metilação do DNA, como análise de restrição dependente de metilação, imunoensaios enzimáticos (ELISAs) de 5-mC e cromatografia líquida-massa (LC-MS) de 5-metil-2'-desoxicitidina (5-mC) dependem de homogeneizados celulares ou teciduais e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a localização e a magnitude da metilação da citosina no espaço e no tempo dentro de espécimes intactos^12,18.

Devido à facilidade de imagens automatizadas in vivo , manipulações genéticas, rápido tempo de desenvolvimento ex utero e criação durante a embriogênese, os embriões de peixe-zebra continuam a ser amplamente utilizados como modelos fisiologicamente intactos para descobrir vias mediadas por xenobióticos que contribuem para resultados adversos durante o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, usando anticorpos comercialmente disponíveis específicos para 5 mC, o protocolo abaixo descreve uma estratégia econômica para monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação da citosina em embriões individuais e intactos de peixe-zebra, aproveitando a imuno-histoquímica (IHC) de montagem completa, imagens automatizadas de alto conteúdo e processamento de dados eficiente usando linguagem de programação antes da análise estatística.

Para o conhecimento atual, este método é o primeiro a monitorar 5-mC dentro de embriões intactos de peixe-zebra. O método permite a detecção da metilação do DNA dentro da massa celular e também tem a capacidade de detectar a metilação da citosina de mRNAs maternos localizados na gema durante a transição materna-zigótica. No geral, este método será útil para a rápida identificação de produtos químicos que têm o potencial de interromper a metilação da citosina in situ durante a reprogramação epigenética.

Protocolo

Os criadores adultos foram manuseados e tratados de acordo com um protocolo de uso animal aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (#20180063) na Universidade da Califórnia, Riverside.

1. Recolha de embriões de peixe-zebra e exposição química

1. Adicione armadilhas de reprodução no tanque a tanques contendo peixes-zebra machos e fêmeas adultos sexualmente maduros e reprodutivamente viáveis. Adicionar pelo menos três armadilhas por tanque de 6 L pelo menos 12 h antes da coleta às ~9:00 da manhã, que é o tempo aproximado de fertilização e desova dos ovos dentro dos tanques.
2. Prepare uma solução de exposição fresca na manhã da coleta. A solução de exposição é preparada utilizando uma pipeta de 5 ml e adicionando 5,0 ml de água do sistema isenta de partículas a uma placa de Petri de vidro de 60 mm.
3. Em seguida, use uma pipeta microcapilar de vidro de 10 μL para transferir 10 μL de veículo (sulfóxido de dimetilo ou DMSO) ou solução de estoque químico para o sistema de água no prato de vidro.
4. Gire a placa de Petri de vidro para garantir que a solução de estoque se dissipe. Adicione mais 5,0 mL de água do sistema à placa de Petri de vidro. Gire a placa de Petri de vidro para homogeneizar a solução de exposição.
5. Repetir para cada grupo de tratamento em repetições de quatro para produzir quatro repetições por tratamento.
6. Após a preparação das soluções de exposição, tampe os pratos de vidro com tampas de vidro para minimizar a evaporação.
7. Ao remover as armadilhas de reprodução de cada tanque, permita cuidadosamente que a água dentro de cada armadilha escorra para o tanque antes de remover dos tanques. Certifique-se de que as armadilhas permaneçam do lado direito para cima.
8. Transfira as armadilhas de reprodução para a pia do laboratório e enxágue-as usando uma garrafa de esguicho cheia de água de osmose reversa (RO) em uma rede de peixe previamente embebida em 10% de água sanitária e enxaguada com água. Lave os embriões até que todos os detritos sejam limpos e apenas embriões limpos permaneçam.
9. Transfira os embriões da rede de peixe usando uma garrafa de esguicho cheia de água RO para uma placa de Petri de plástico de 100 mm. Classificar aleatoriamente 50 embriões vivos às 0,75 h pós-fertilização (hpf) e remover o excesso de água RO.
10. Usando uma microespátula, coloque embriões classificados na solução de tratamento. Todos os embriões devem estar dentro do veículo ou da solução de tratamento não antes das 9:45 da manhã. Gire os pratos de vidro para garantir que os embriões sejam uniformemente revestidos dentro da solução de tratamento.
11. Depois de quatro placas replicadas (N = 50 por replicação) terem sido configuradas para cada grupo de tratamento, coloque a tampa de vidro em cima das placas de exposição e transfira todas as placas para uma incubadora com temperatura controlada a 28 °C até 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf ou 10 hpf.
12. Preparar o paraformaldeído fresco a 4% (PFA) pelo menos 4 h antes do termo da exposição e conservar a 4 °C.
    1. Ligue a placa de aquecimento a 115 °C, faça 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x (2 mL de 10x PBS + 18 mL de água RO) em um tubo de centrífuga de 50 mL e pese 800 mg de paraformaldeído.
    2. Dentro de um exaustor químico, transfira 1x solução de PBS para um balão de Erlenmeyer de 250 mL, adicione 800 mg de paraformaldeído e, em seguida, adicione 2 μL de 10 N NaOH. Colocar um termómetro no interior do balão, colocar o balão na chapa quente e observar a temperatura enquanto agita.
    3. Quando a temperatura atingir 62-65 °Cremova o PFA a 4% da placa quente e deixe-o arrefecer até à temperatura ambiente (RT). Conservar o PFA a 4% a 4 °C.
13. Uma vez que a duração da exposição tenha terminado, remova os embriões da incubadora e transfira todos os embriões vivos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Aspirar a solução de exposição residual utilizando uma pipeta de 1 ml. Não aspirar embriões.
14. Adicione 500 μL de PFA a 4% refrigerado a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e misture os embriões em 4% de PFA invertendo várias vezes. Permita que os embriões se fixem em 4% de PFA durante a noite.
    NOTA: Não é recomendado permitir que os embriões permaneçam em PFA por mais de 12 h.

2. Dechorionação de embriões

1. No dia seguinte, aspirar o PFA a 4%, ressuspender os embriões em 1x PBS e pipetar suavemente para cima e para baixo por 30 s. Se necessário, pare o protocolo nesta etapa e armazene os embriões em 1x PBS a 4 °C por até 48 h.
2. Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira cuidadosamente embriões fixos para um prato de vidro cheio de água RO e gire suavemente por 30 s. Repita esta etapa mais uma vez.
3. Use agulhas de seringa com ampliação de 5,0x usando um estereomicroscópio padrão para decorionar manualmente todos os embriões. Faça isso usando a ponta da agulha para perfurar o córion e descascá-lo suavemente para longe da gema e da massa celular⁴.
4. Uma vez que os embriões tenham sido decorionados, use uma pipeta microcapilar de vidro para transferir até 25 embriões intactos para uma cesta de imunoquímica (IHC) e coloque a cesta IHC em uma placa de 96 poços. Use uma pipeta de 1 mL para aspirar a água RO de cada poço.

3. Imuno-histoquímica usando anticorpo específico de 5 mC

1. Ressuspender os embriões em 500 μL de tampão bloqueador (1x PBST + 2% de soro de ovino + 2 mg/mL de albumina sérica bovina) por poço e envolver a placa com parafilme e folha de alumínio para protegê-los da luz. Incubar a 4 °C durante 4 h num agitador orbital (100 rpm).
2. Remova o envoltório de parafilme e o alumínio e use uma pipeta de 1 mL para aspirar o tampão de bloqueio de cada poço. Substitua-o por 500 μL de uma diluição de 1:100 do anticorpo anti-5-mC monoclonal do rato no tampão de bloqueio. Incubar todos os embriões com anticorpos primários, exceto um subconjunto de embriões de controle de veículos que serão incubados com o tampão de bloqueio para explicar o ruído de fundo. Tenha cuidado para não perturbar a integridade dos embriões, nem para aspirar embriões durante esta etapa.
3. Reembrulhe a placa em parafilme e folha de alumínio e deixe a placa incubar a 4 °C durante a noite num agitador orbital (100 rpm).
4. No dia seguinte, remova a solução de anticorpos primários de cada poço e substitua-a por 1x PBS + Tween-20 a 0,1% (1x PBST). Lave cada poço três vezes com 1x PBST por 15 min por lavagem em um agitador orbital (100 rpm).
5. Substitua 1x PBST por uma diluição de 1:500 do anticorpo IgG anti-rato de cabra em tampão de bloqueio e incube todos os embriões com o anticorpo secundário. Deixar a placa incubar a 4 °C durante a noite num agitador orbital (100 rpm).
6. No dia seguinte, remova o anticorpo secundário e lave a solução residual três vezes com 1x PBST por 15 min por lavagem em um agitador orbital (100 rpm).
   NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui por até 48 h se as cestas IHC forem armazenadas em poços limpos preenchidos com 1x PBS.
7. Use uma pipeta de 1 mL para aspirar 1x PBST de cada poço e coloque a cesta IHC em uma placa de Petri de vidro cheia de água RO. Sob um estereomicroscópio padrão, classifique aleatoriamente embriões intactos em uma placa de 96 poços, resultando em um embrião por poço.
8. Usando uma pipeta de 1 mL, remova toda a água RO de poços individuais e substitua-a por 200 μL de 1x PBS. Centrifugar a placa durante 3 min a 1 x g.

4. Imagem automatizada de embriões dentro de placas de 96 poços

1. Fotografe os embriões com uma objetiva de 2x sob luz transmitida e FITC usando um sistema de triagem de alto conteúdo (Tabela de Materiais).
   NOTA: Uma imagem fluorescente de cada embrião foi capturada automaticamente usando a ampliação acima mencionada e um filtro FITC¹⁹.
   1. Selecione Foco automático para garantir que o foco da câmera esteja na parte inferior da placa e deslocado pela espessura inferior.
   2. Selecione um comprimento de onda FITC com uma duração de exposição de 100 ms e defina o foco automático para laser com um deslocamento Z. Observe e confirme a aquisição adequada de imagens em vários poços antes de iniciar a aquisição da placa.
      NOTA: O instrumento adquire automaticamente imagens de todos os poços selecionados que contenham embriões. Uma placa de 96 poços exigiu aproximadamente 30 minutos para aquisição de imagens e armazenamento de dados. Durante o período de aquisição, a temperatura interna dentro do sistema de imagem foi mantida no TR.
2. Após a aquisição da imagem, realize a análise de dados usando o sistema de triagem de alto conteúdo e um procedimento personalizado de análise automatizada de imagens. Selecione cada embrião na placa de 96 poços a ser analisado quanto à área total e intensidade integrada de fluorescência.
   NOTA: A análise incluiu o fornecimento de imagens que continham sobreposições de pontos de dados da análise.
3. Em seguida, tabular os pontos de dados e exportá-los do sistema de triagem de alto conteúdo indo em Medir e selecionando Abrir Log de Dados para uma planilha. As porções de aquisição de placas e análise de dados estão representadas na Figura 1.

5. Análise dos dados

1. Carregue a planilha exportada em um programa de computador em que o pacote deployer (dplyr) é usado para classificar, somar dados para cada poço e filtrar por número de poço. O pacote writexl é então usado para exportar os dados somados para uma planilha. O código do programa 5mC é mostrado no arquivo suplementar 1.

Resultados

O objetivo geral deste protocolo é determinar se um tratamento afeta a abundância relativa de 5 mC, avaliando a área total e a intensidade relativa da fluorescência dentro de embriões de peixe-zebra fixos e marcados. Depois de completar o protocolo, um estereomicroscópio de fluorescência pode ser usado para primeiro determinar se a IHC de montagem completa foi bem-sucedida. Quando embriões marcados são observados sob um filtro FITC ou GFP, um resultado positivo é indicado por um sinal positivo de FITC dentro do...

Discussão

Durante este protocolo, existem algumas etapas que são críticas. Primeiro, ao descorionar embriões, é importante apontar a agulha para longe do tecido do embrião / saco vitelino / massa celular, pois essas porções do embrião em desenvolvimento são muito frágeis e fáceis de perfurar. Em segundo lugar, ao transferir embriões marcados para poços individuais, use uma pipeta de vidro para transferir embriões, pois eles aderirão a uma pipeta de plástico. Em terceiro lugar, ao executar IHC de montagem completa, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML