Быстрый и эффективный пространственно-временный мониторинг нормального и аберрантного метилирования цитозина в интактных эмбрионах рыбок данио

Резюме

В этой статье описывается протокол быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга нормального и аберрантного метилирования цитозина в интактных эмбрионах рыбок данио.

Аннотация

Метилирование цитозина высоко сохраняется у всех видов позвоночных и, как ключевой фактор эпигенетического программирования и состояния хроматина, играет решающую роль в раннем эмбриональном развитии. Ферментативные модификации приводят к активному метилированию и деметилированию цитозина в 5-метилцитозин (5-мС) и последующему окислению 5-мС в 5-гидроксиметилцитозин, 5-формилцитозин и 5-карбоксильцитозин. Эпигенетическое перепрограммирование является критическим периодом внутриутробного развития, и материнское воздействие химических веществ может перепрограммировать эпигеном в потомстве. Это может потенциально вызвать неблагоприятные исходы, такие как немедленные фенотипические последствия, долгосрочные последствия для восприимчивости к заболеваниям у взрослых и трансгенерационные эффекты наследственных эпигенетических меток. Хотя секвенирование на основе бисульфита позволяет исследователям опрашивать метилирование цитозина с разрешением пары оснований, подходы, основанные на секвенировании, являются непомерно дорогостоящими и, как таковые, исключают возможность мониторинга метилирования цитозина на разных стадиях развития, множественных концентраций на химическое вещество и репликации эмбрионов за обработку. Благодаря простоте автоматизированной визуализации in vivo , генетическим манипуляциям, быстрому времени развития ex utero и животноводству во время эмбриогенеза, эмбрионы рыбок данио продолжают использоваться в качестве физиологически неповрежденной модели для выявления ксенобиотически-опосредованных путей, которые способствуют неблагоприятным исходам во время раннего эмбрионального развития. Поэтому, используя коммерчески доступные 5-мС-специфические антитела, мы описываем экономически эффективную стратегию быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга метилирования цитозина в отдельных, интактных эмбрионах рыбок данио с использованием цельной иммуногистохимии, автоматизированной визуализации с высоким содержанием и эффективной обработки данных с использованием языка программирования до статистического анализа. Согласно современным знаниям, этот метод является первым, который успешно обнаруживает и количественно оценивает уровни 5-mC in situ в эмбрионах рыбок данио во время раннего развития. Метод позволяет обнаруживать метилирование ДНК в клеточной массе, а также обладает способностью обнаруживать метилирование цитозина локализованных желтком материнских мРНК во время перехода от матери к зиготе. В целом, этот метод будет полезен для быстрой идентификации химических веществ, которые могут нарушить метилирование цитозина in situ во время эпигенетического перепрограммирования.

Введение

Ферментативные модификации стимулируют активное метилирование и деметилирование цитозина в 5-метилцитозин (5-мС) и последующее окисление 5-мС в 5-гидроксиметилцитозин, 5-формилцитозин и 5-карбоксильцитозин ^1,2. Трис(1,3-дихлор-2-пропил) фосфат (TDCIPP) является широко используемым антипиреном в Соединенных Штатах, который, как было ранее продемонстрировано, изменяет траекторию метилирования цитозина после раннего эмбрионального воздействия от 0,75 часа после оплодотворения (HPF) до ранней гаструляции (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . У позвоночных 5-мС и его модифицированные производные имеют решающее значение для регулирования раннего эмбрионального развития⁹. Оплодотворение эмбриона вызывает деметилирование родительской ДНК, за которым следует деградация материнской мРНК, активация зиготического генома и реметилирование зиготического генома⁹. Биологически значимые процессы, использующие метилирование цитозина, включают модификацию гистонов, рекрутирование транскрипционного механизма, метилирование РНК, эпигенетическое перепрограммирование и определение структуры хроматина^10,11. Метилирование цитозина также сохраняется среди видов позвоночных, подчеркивая важность понимания и изучения того, как аберрантное метилирование цитозина может влиять на траекторию развития организма¹¹. Кроме того, внутриутробное развитие чувствительно к материнскому воздействию и может вызвать неблагоприятные исходы, такие как немедленные фенотипические последствия, долгосрочные последствия для восприимчивости к заболеваниям у взрослых и трансгенерационные эффекты унаследованных эпигенетических меток 12,13,14.

Длинные участки пар цитозин-гуанин, или острова CpG, были основными очагами исследователей, которые стремятся охарактеризовать динамику метилирования цитозина в геноме 15,16,17. Стратегии, основанные на бисульфите, такие как секвенирование бисульфита всего генома, секвенирование бисульфита с пониженным представлением и секвенирование бисульфитного ампликона, представляют собой золотой стандарт для опроса метилирования цитозина при разрешении пары оснований. Однако подходы, основанные на секвенировании, являются непомерно дорогостоящими и, как таковые, исключают возможность мониторинга метилирования цитозина на разных стадиях развития, множественных концентраций на химическое вещество и репликации эмбрионов за обработку. Кроме того, подходы, основанные на секвенировании, не предоставляют информацию о пространственной локализации, что имеет решающее значение для понимания потенциально затронутых типов клеток и областей в развивающемся эмбрионе. Аналогичным образом, глобальные анализы метилирования ДНК, такие как метилирующий зависимый рестрикционный анализ, иммунологические анализы 5-мС (ИФА) и 5-метил-2'-дезоксицитидин (5-мС) жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS), полагаются на гомогенаты клеток или тканей и, как таковые, исключают возможность мониторинга локализации и величины метилирования цитозина в пространстве и времени в неповрежденных образцах^12,18.

Благодаря простоте автоматизированной визуализации in vivo , генетическим манипуляциям, быстрому времени развития ex utero и животноводству во время эмбриогенеза, эмбрионы рыбок данио продолжают широко использоваться в качестве физиологически неповрежденных моделей для выявления ксенобиотически-опосредованных путей, которые способствуют неблагоприятным исходам во время раннего эмбрионального развития. Таким образом, используя коммерчески доступные антитела, специфичные для 5-mC, приведенный ниже протокол описывает экономически эффективную стратегию быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга метилирования цитозина в отдельных, интактных эмбрионах рыбок данио с использованием иммуногистохимии (IHC), автоматизированной визуализации с высоким содержанием и эффективной обработки данных с использованием языка программирования до статистического анализа.

Согласно современным знаниям, этот метод является первым для мониторинга 5-mC в интактных эмбрионах рыбок данио. Метод позволяет обнаруживать метилирование ДНК в клеточной массе, а также обладает способностью обнаруживать метилирование цитозина локализованных желтком материнских мРНК во время перехода от матери к зиготе. В целом, этот метод будет полезен для быстрой идентификации химических веществ, которые могут нарушить метилирование цитозина in situ во время эпигенетического перепрограммирования.

протокол

Взрослые заводчики обрабатывались и лечились в соответствии с утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) протоколом использования животных (No 20180063) в Калифорнийском университете в Риверсайде.

1. Сбор эмбрионов рыбок данио и химическое воздействие

1. Добавьте ловушки для размножения в аквариуме, содержащие половозрелых и репродуктивно жизнеспособных взрослых самцов и самок рыбок данио. Добавьте не менее трех ловушек на резервуар объемом 6 л не менее чем за 12 ч до сбора в ~9:00 утра, что является приблизительным временем оплодотворения и нереста яиц в резервуарах.
2. Приготовьте свежий экспозиционный раствор утром сбора. Экспозиционный раствор готовят с использованием пипетки 5 мл и добавляют 5,0 мл бездисперсной системной воды в стеклянную чашку Петри толщиной 60 мм.
3. Затем используйте стеклянную микрокапиллярную пипетку объемом 10 мкл для переноса 10 мкл транспортного средства (диметилсульфоксида или ДМСО) или химического раствора в системную воду в стеклянной посуде.
4. Закрутите стеклянную чашку Петри, чтобы убедиться, что запас раствора рассеивается. Добавьте еще 5,0 мл системной воды в стеклянную чашку Петри. Закрутите стеклянную чашку Петри, чтобы гомогенизировать экспозиционный раствор.
5. Повторите для каждой группы лечения в репликах из четырех, чтобы получить четыре реплики за лечение.
6. После того, как растворы для воздействия были приготовлены, закройте стеклянную посуду стеклянными крышками, чтобы свести к минимуму испарение.
7. Снимая ловушки для размножения из каждого резервуара, осторожно позвольте воде внутри каждой ловушки стекать в резервуар перед извлечением из резервуаров. Убедитесь, что ловушки остаются правой стороной вверх.
8. Переложите ловушки для размножения в лабораторную раковину и промойте их с помощью бутылки с брызгами, наполненной водой обратного осмоса (RO), в рыбную сеть, предварительно пропитанную 10% отбеливателем и смоченную водой. Промывайте эмбрионы до тех пор, пока не будет очищен весь мусор и не останутся только чистые эмбрионы.
9. Перенесите эмбрионы из рыбьей сети с помощью наполненной водой бутылки для брызг в пластиковую чашку Петри толщиной 100 мм. Случайным образом отсортируйте 50 живых эмбрионов через 0,75 ч после оплодотворения (HPF) и удалите избыток воды RO.
10. С помощью микропатула поместите отсортированные эмбрионы в лечебный раствор. Все эмбрионы должны находиться в транспортном средстве или лечебном растворе не ранее 9:45 утра. Закрутите стеклянную посуду, чтобы убедиться, что эмбрионы равномерно покрыты в растворе для лечения.
11. После установки четырех реплицированных тарелок (N = 50 на репликат) для каждой группы обработки поместите стеклянную крышку поверх посуды для экспозиции и перенесите всю посуду в инкубатор с контролируемой температурой, установленный при 28 °C до 2 л.с.ф., 4 л.с.ф., 6hpf, 8 л.с.ф. или 10 л.с.ф.
12. Готовят свежий 4% параформальдегид (ПФА) по меньшей мере за 4 ч до окончания экспозиции и хранят при 4 °C.
    1. Включите конфорку до 115 °C, сделайте 20 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) (2 мл 10x PBS + 18 мл воды RO) в 50 мл центрифужной трубки и взвесьте 800 мг параформальдегида.
    2. В химической вытяжке перенесите 1 раствор PBS в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, добавьте 800 мг параформальдегида, а затем добавьте 2 мкл 10 N NaOH. Поместите термометр внутрь колбы, поместите колбу на конфорку и следите за температурой во время перемешивания.
    3. Когда температура достигнет 62-65 °Cremove 4% PFA с конфорки и дайте ей остыть до комнатной температуры (RT). Хранить 4% PFA при 4 °C.
13. Как только продолжительность воздействия закончится, извлеките эмбрионы из инкубатора и перенесите все живые эмбрионы в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Раствор остаточного воздействия аспирата с использованием пипетки 1 мл. Не аспирируйте эмбрионы.
14. Добавьте 500 мкл охлажденного 4% PFA в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и смешайте эмбрионы в 4% PFA путем инвертирования несколько раз. Дайте эмбрионам зафиксироваться в 4% PFA в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется позволять эмбрионам оставаться в PFA дольше 12 ч.

2. Дехорионация эмбрионов

1. На следующий день аспирируйте 4% PFA, повторно суспендируйте эмбрионы в 1x PBS и осторожно пипеткой вверх и вниз в течение 30 с. При необходимости остановите протокол на этом этапе и храните эмбрионы в 1x PBS при 4 °C в течение 48 ч.
2. Используя пластиковую переносную пипетку, аккуратно перенесите неподвижные эмбрионы в наполненную водой стеклянную посуду и осторожно закрутите в течение 30 с. Повторите этот шаг еще раз.
3. Используйте шприцевые иглы под 5,0-кратным увеличением с помощью стандартного стереомикроскопа, чтобы вручную дехорионировать все эмбрионы. Сделайте это, используя кончик иглы, чтобы проколоть хорион и аккуратно очистить его от желтка и клеточной массы⁴.
4. После того, как эмбрионы были дехорионированы, используйте стеклянную микрокапиллярную пипетку для переноса до 25 неповрежденных эмбрионов в одну корзину иммунохимии (IHC) и поместите корзину IHC в пластину с 96 лунками. Используйте пипетку объемом 1 мл для аспирации воды RO из каждой скважины.

3. Иммуногистохимия с использованием 5-мС-специфических антител

1. Повторно суспендировать эмбрионы в 500 мкл блокирующего буфера (1x PBST + 2% овечьей сыворотки + 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) на лунку и обернуть пластину парапленкой и алюминиевой фольгой для защиты их от света. Инкубировать при 4 °C в течение 4 ч на орбитальном шейкере (100 об/мин).
2. Снимите пленку и алюминий и используйте пипетку объемом 1 мл для аспирации блокирующего буфера из каждой лунки. Замените его 500 мкл разведения 1:100 моноклонального мышиного антитела против 5-мС в блокирующем буфере. Инкубировать все эмбрионы с первичными антителами, за исключением подмножества контрольных эмбрионов, которые будут инкубированы с блокирующим буфером для учета фонового шума. Будьте осторожны, чтобы не нарушить целостность эмбрионов или аспирировать эмбрионы во время этого шага.
3. Переверните пластину в парапленку и алюминиевую фольгу и дайте пластине инкубироваться при 4 °C в течение ночи на орбитальном шейкере (100 об/мин).
4. На следующий день удаляют раствор первичного антитела из каждой лунки и заменяют его 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Промывайте каждую лунку три раза с 1x PBST в течение 15 минут на промывку на орбитальном шейкере (100 об/мин).
5. Замените 1x PBST разведением 1:500 козьего антимышьего антитела IgG в блокирующем буфере и инкубируйте все эмбрионы с вторичным антителом. Дайте пластине инкубировать при 4 °C в течение ночи на орбитальном шейкере (100 об/мин).
6. На следующий день удалите вторичное антитело и промыть остаточный раствор три раза 1x PBST в течение 15 мин на промывку на орбитальном шейкере (100 об/мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен здесь на срок до 48 ч, если корзины IHC хранятся в чистых колодцах, заполненных 1x PBS.
7. Используйте пипетку 1 мл, чтобы аспирировать 1x PBST из каждого колодца и поместить корзину IHC в стеклянную чашку Петри, наполненную водой RO. Под стандартным стереомикроскопом случайным образом сортируйте неповрежденные эмбрионы в 96-луночную пластину, в результате чего получается один эмбрион на лунку.
8. Используя пипетку 1 мл, удалите всю воду RO из отдельных скважин и замените ее 200 мкл 1x PBS. Центрифугировать пластину в течение 3 мин при 1 х г.

4. Автоматизированная визуализация эмбрионов в 96-луночных пластинах

1. Визуализируйте эмбрионы с 2-кратным объективом при пропускаемом свете и FITC с помощью системы скрининга с высоким содержанием (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентное изображение каждого эмбриона было получено автоматически с использованием вышеупомянутого увеличения и фильтра FITC¹⁹.
   1. Выберите Автофокус , чтобы убедиться, что фокус камеры находится в нижней части пластины и смещен толщиной дна.
   2. Выберите длину волны FITC с длительностью экспозиции 100 мс и установите автофокус на лазер с Z-смещением. Наблюдение и подтверждение правильного получения изображений в нескольких скважинах до начала сбора плит.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор автоматически получает изображения из всех выбранных скважин, содержащих эмбрионы. Пластине с 96 скважинами требовалось около 30 минут для сбора изображений и хранения данных. В течение всего периода сбора внутренняя температура в системе визуализации поддерживалась на уровне RT.
2. После получения изображения выполните анализ данных с использованием системы скрининга с высоким содержанием и пользовательской автоматизированной процедуры анализа изображений. Выберите каждый эмбрион на 96-луночной пластине для анализа общей площади и интегральной интенсивности флуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ включал предоставление изображений, которые содержали наложения точек данных из анализа.
3. Затем сведите точки данных в таблицу и экспортируйте их из системы скрининга с высоким содержанием, перейдя в раздел «Измерение» и выбрав «Открыть журнал данных » в электронную таблицу. Части сбора пластин и анализа данных показаны на рисунке 1.

5. Анализ данных

1. Загрузите экспортированную электронную таблицу в компьютерную программу, где пакет deployer (dplyr) используется для сортировки, суммирования данных для каждой скважины и фильтрации по номеру скважины. Затем пакет writexl используется для экспорта суммированных данных в электронную таблицу. Программный код 5mC показан в дополнительном файле 1.

Результаты

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы определить, влияет ли лечение на относительное изобилие 5-мС путем оценки общей площади и относительной интенсивности флуоресценции в фиксированных и меченных эмбрионах рыбок данио. После завершения протокола можно использовать флуорес?...

Обсуждение

Во время этого протокола есть несколько шагов, которые являются критическими. Во-первых, при дехорионации эмбрионов важно направить иглу в сторону от ткани эмбриона/желточного мешка/клеточной массы, так как эти участки развивающегося эмбриона очень хрупкие и легко прокалываются. Во-вт...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML