無傷ゼブラフィッシュ胚における正常および異常なシトシンメチル化の迅速かつ効率的な時空間モニタリング

要約

この論文では、無傷のゼブラフィッシュ胚内の正常および異常なシトシンメチル化の迅速かつ効率的な時空間モニタリングのためのプロトコルについて説明します。

要約

シトシンメチル化は脊椎動物種全体で高度に保存されており、エピジェネティックプログラミングとクロマチン状態の主要な推進力として、初期胚発生において重要な役割を果たしています。酵素修飾は、シトシンの5-メチルシトシン(5-mC)への活性メチル化および脱メチル化を促進し、続いて5-mCの5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、および5-カルボキシルシトシンへの酸化を促進します。エピジェネティックなリプログラミングは 子宮内 発育中の重要な時期であり、母親の化学物質への曝露は子孫内のエピゲノムを再プログラムする可能性があります。これは、即時の表現型の結果、成人病の感受性に対する長期的な影響、および遺伝性のエピジェネティックマークの世代を超えた影響などの有害な結果を引き起こす可能性があります。バイサルファイトベースのシーケンシングにより、研究者は塩基対分解能でシトシンメチル化を調べることができますが、シーケンシングベースのアプローチはコストがかかりすぎるため、発生段階全体でシトシンメチル化をモニタリングする機能、化学物質ごとに複数の濃度、および処理ごとに胚を複製する能力が妨げられます。自動化された in vivo イメージング、遺伝子操作、子宮 外 発生時間の迅速化、および胚形成中の飼育の容易さにより、ゼブラフィッシュ胚は、初期胚発生中の有害な結果に寄与する生体異物媒介経路を明らかにするための生理学的に無傷のモデルとして引き続き使用されています。そこで、市販の5mC特異的抗体を用いて、ホールマウント免疫組織化学、自動ハイコンテントイメージング、および統計解析前のプログラミング言語を用いた効率的なデータ処理を活用して、個々の無傷のゼブラフィッシュ胚におけるシトシンメチル化を迅速かつ効率的に時空間的にモニタリングするための費用対効果の高い戦略について説明します。現在の知る限り、この方法は、発生初期にゼブラフィッシュ胚内の in situ で5-mCレベルを検出して定量化した最初の方法です。この方法は、細胞塊内のDNAメチル化の検出を可能にし、母体から接合体への移行中に卵黄に局在する母体mRNAのシトシンメチル化を検出する能力も有する。全体として、この方法は、エピジェネティックなリプログラミング中にシトシンメチル化を in situ で破壊する可能性のある化学物質の迅速な同定に役立ちます。

概要

酵素修飾は、シトシンの5-メチルシトシン(5-mC)への活性メチル化および脱メチル化、およびそれに続く5-mCの5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、および5-カルボキシルシトシンへの酸化を促進します^1,2。リン酸トリス(1,3-ジクロロ-2-プロピル)(TDCIPP)は、米国で広く使用されている難燃剤であり、受精後0.75時間(hpf)から早期原腸形成(6hpf)までの初期胚曝露後のシトシンメチル化の軌跡を変化させることが以前に実証されています3,4,5,6,7,8。.脊椎動物の中では、5-mCとその修飾誘導体は初期胚発生を調節するために重要です⁹。胚の受精は、親DNAの脱メチル化を引き起こし、続いて母体のmRNA分解、接合子ゲノムの活性化、および接合子ゲノムの再メチル化を引き起こします⁹。シトシンメチル化を利用する生物学的に関連するプロセスには、ヒストン修飾、転写機構の動員、RNAメチル化、エピジェネティックなリプログラミング、およびクロマチン構造の決定が含まれます^10,11。シトシンメチル化は脊椎動物種の間でも保存されており、異常なシトシンメチル化が生物の発生の軌跡にどのように影響するかを理解し、調査することの重要性を強調しています¹¹。さらに、子宮内での発達は母親の曝露に敏感であり、即時の表現型の結果、成人病の感受性に対する長期的な影響、および遺伝性のエピジェネティックマークの世代を超えた影響などの有害な結果を引き起こす可能性があります^12,13,14。

長いシトシン-グアニンペア、またはCpGアイランドは、ゲノム全体のシトシンメチル化のダイナミクスを特徴付けることを目的とした研究者の主要な病巣でした^15,16,17。全ゲノムバイサルファイトシーケンシング、還元表現バイサルファイトシーケンシング、バイサルファイトアンプリコンシーケンシングなどのバイサルファイトベースの戦略は、塩基対分解能でシトシンメチル化を調べるためのゴールドスタンダードです。ただし、シーケンシングベースのアプローチはコストがかかりすぎるため、発生段階全体でシトシンメチル化を監視し、化学物質ごとに複数の濃度を監視し、処理ごとに胚を複製する機能がありません。さらに、シーケンシングベースのアプローチでは、影響を受ける可能性のある細胞タイプや発生中の胚内の領域を理解するために重要な空間局在に関する情報は提供されません。同様に、メチル化依存性制限分析、5-mC酵素結合イムノアッセイ(ELISA)、5-メチル-2'-デオキシシチジン(5-mC)液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)などのグローバルDNAメチル化アッセイは、細胞または組織のホモジネートに依存しているため、無傷の標本内の空間および時間にわたるシトシンメチル化の局在と大きさをモニターする能力が妨げられています^12,18。

自動化された in vivo イメージング、遺伝子操作、子宮 外 発生時間の迅速化、および胚発生中の飼育の容易さにより、ゼブラフィッシュ胚は、初期胚発生中の有害な結果に寄与する生体異物媒介経路を明らかにするための生理学的に無傷のモデルとして引き続き広く使用されています。したがって、以下のプロトコルでは、5-mCに特異的な市販の抗体を使用して、ホールマウント免疫組織化学(IHC)、自動化されたハイコンテントイメージング、および統計分析前のプログラミング言語を使用した効率的なデータ処理を活用して、個々の無傷のゼブラフィッシュ胚内のシトシンメチル化を迅速かつ効率的に時空間的にモニタリングするための費用効果の高い戦略について説明します。

現在の知る限り、この方法は、無傷のゼブラフィッシュ胚内の5-mCを監視する最初の方法です。この方法は、細胞塊内のDNAメチル化の検出を可能にし、母体から接合体への移行中に卵黄に局在する母体mRNAのシトシンメチル化を検出する能力も有する。全体として、この方法は、エピジェネティックなリプログラミング中にシトシンメチル化を in situ で破壊する可能性のある化学物質の迅速な同定に役立ちます。

プロトコル

成体ブリーダーは、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物管理使用委員会(IACUC)が承認した動物使用プロトコル(#20180063)に従って取り扱われ、扱われました。

1.ゼブラフィッシュの胚の収集と化学物質への暴露

1. 性的に成熟し、生殖的に生存可能な成体のオスとメスのゼブラフィッシュを含むタンク内の繁殖トラップを追加します。収集の少なくとも12時間前に、6 Lタンクごとに少なくとも3つのトラップを追加します ~9:00 タンク内の卵の受精と産卵のおおよその時間です。
2. 収集の朝に新鮮な露出溶液を準備してください。露光溶液は、5 mLピペットを使用し、5.0 mLの微粒子を含まないシステム水を60 mmガラスペトリ皿に加えます。
3. 次に、10 μLのガラスマイクロキャピラリーピペットを使用して、10 μLのビヒクル(ジメチルスルホキシド、またはDMSO)または化学ストック溶液をガラス皿内のシステム水に移します。
4. ガラスのペトリ皿を回転させて、原液が確実に消散します。ガラスペトリ皿にさらに5.0mLのシステム水を加えます。ガラスのペトリ皿を回転させて、露光溶液を均質化します。
5. 各治療群について4回の反復で繰り返し、処理ごとに4回の反復が得られる。
6. 暴露溶液を調製した後、蒸発を最小限に抑えるためにガラス皿にガラス蓋をします。
7. 各タンクから繁殖トラップを取り外すときは、タンクから取り外す前に、各トラップ内の水をタンクに注意深く排出させます。トラップが右側を上にしたままであることを確認してください。
8. 繁殖トラップをラボシンクに移し、逆浸透(RO)水で満たされた噴出ボトルを使用して、10%漂白剤に浸して水ですすいだ魚網に入れます。すべての破片が取り除かれ、きれいな胚だけが残るまで胚をすすいでください。
9. RO水で満たされた噴出ボトルを使用して、魚網から100mmのプラスチック製ペトリ皿に胚を移します。受精後0.75時間(hpf)で50個の生胚をランダムに選別し、余分なRO水を取り除きます。
10. マイクロスパチュラを使用して、選別した胚を処理液に入れます。すべての胚は、午前9時45分までにビヒクルまたは治療液内にある必要があります。ガラス皿を回転させて、胚が処理液内に均一にコーティングされていることを確認します。
11. 各治療群に4つの反復ディッシュ(反復あたりN = 50)をセットアップした後、露光ディッシュの上にガラス蓋を置き、すべてのディッシュを28°Cに設定された温度制御インキュベーターに2 hpf、4 hpf、6 hpf、8 hpf、または10 hpfまで移します。
12. 暴露終了の少なくとも4時間前に新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)を準備し、4°Cで保存します。
    1. ホットプレートを115°Cにオンにし、50 mLの遠沈管に20 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)20 mL(10 mLのPBS + 18 mLのRO水)を作り、800 mgのパラホルムアルデヒドを重量で取り除きます。
    2. 化学ヒュームフード内で、1x PBS溶液を250 mLの三角フラスコに移し、800 mgのパラホルムアルデヒドを加えてから、2 μLの10 N NaOHを加えます。フラスコ内に温度計を置き、フラスコをホットプレートに置き、攪拌しながら温度を確認します。
    3. 温度が62〜65°Cに達したら、ホットプレートから4%PFAを取り外し、室温(RT)まで冷却します。4%PFAを4°Cで保存します。
13. 曝露時間が終了したら、インキュベーターから胚を取り出し、すべての生きている胚を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。1 mLピペットを使用して残留暴露溶液を吸引します。胚を吸引しないでください。
14. 500 μLの冷やした4%PFAを1.5 mLの微量遠心チューブに加え、胚を4%PFAに数回反転させて混合します。胚を4%PFAで一晩固定します。
    注:胚を12時間以上PFAにとどまらせることはお勧めしません。

2.胚の脱絨毛

1. 翌日、4%PFAを吸引し、胚を1x PBSに再懸濁し、30秒間ゆっくりと上下にピペットで移します。必要に応じて、このステップでプロトコルを停止し、胚を1x PBSで4°Cで最大48時間保存します。
2. プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、固定した胚をRO水で満たされたガラス皿に注意深く移し、30秒間穏やかに旋回させます。この手順をもう一度繰り返します。
3. 標準的な実体顕微鏡を使用して5.0倍の倍率で注射針を使用し、すべての胚を手動で脱絨毛化します。これを行うには、針先を使用して絨毛膜に穴を開け、卵黄と細胞塊からそっと剥がします⁴。
4. 胚が脱絨毛化されたら、ガラスマイクロキャピラリーピペットを使用して、最大25個の無傷の胚を1つの免疫化学(IHC)バスケットに移し、IHCバスケットを96ウェルプレートに入れます。1 mLピペットを使用して、各ウェルからRO水を吸引します。

3. 5-mC特異的抗体を用いた免疫組織化学

1. ウェルあたり500 μLのブロッキングバッファー(1x PBST + 2%ヒツジ血清+ 2 mg/mLウシ血清アルブミン)に胚を再懸濁し、プレートをパラフィルムとアルミホイルで包み、光から保護します。オービタルシェーカー(100 rpm)で4°Cで4時間インキュベートします。
2. パラフィルムラップとアルミニウムを取り除き、1 mLピペットを使用して各ウェルからブロッキングバッファーを吸引します。ブロッキングバッファー中のモノクローナルマウス抗5-mC抗体の1:100希釈液500 μLと交換します。バックグラウンドノイズを考慮してブロッキングバッファーとともにインキュベートされるビヒクルコントロール胚のサブセットを除く、すべての胚を一次抗体でインキュベートします。このステップ中に胚の完全性を乱したり、胚を吸引したりしないように注意してください。
3. プレートをパラフィルムとアルミホイルで再包みし、プレートをオービタルシェーカー(100 rpm)で4°Cで一晩インキュベートします。
4. 翌日、各ウェルから一次抗体溶液を取り出し、1x PBS + 0.1% Tween-20(1x PBST)と交換します。各ウェルを1x PBSTで1回、オービタルシェーカー(100 rpm)で1回洗浄する。
5. 1x PBSTをブロッキングバッファー中のヤギ抗マウスIgG抗体の1:500希釈液に置き換え、すべての胚を二次抗体でインキュベートします。プレートをオービタルシェーカー(100 rpm)で4°Cで一晩インキュベートします。
6. 翌日、二次抗体を除去し、残りの溶液をオービタルシェーカー(100 rpm)で1回1回PBSTで1回洗浄します。
   注:IHCバスケットが1x PBSで満たされたクリーンウェルに保管されている場合、プロトコルはここで最大48時間停止できます。
7. 1 mLピペットを使用して各ウェルから1x PBSTを吸引し、IHCバスケットをRO水で満たされたガラス製ペトリ皿に入れます。標準的な実体顕微鏡下で、無傷の胚を96ウェルプレートにランダムに分類し、ウェルごとに1つの胚を生成します。
8. 1 mLピペットを使用して、個々のウェルからすべてのRO水を取り除き、200 μLの1x PBSと交換します。プレートを1 x gで3分間遠心分離します。

4. 96ウェルプレート内の胚の自動イメージング

1. 透過光下で2倍の対物レンズで胚を画像化し、ハイコンテントスクリーニングシステムを使用してFITCを使用します(資料表)。
   注:各胚の蛍光画像は、上記の倍率とFITC^{フィルター19}を使用して自動的にキャプチャされました。
   1. [オートフォーカス]を選択して、カメラの焦点がプレートの下部にあり、下部の厚さによってオフセットされていることを確認します。
   2. 露光時間が 100 ms の FITC波長を選択し、 オートフォーカス を Zオフセットのレーザーに設定します。プレートの取得を開始する前に、いくつかのウェルで適切な画像取得を観察して確認してください。
      注:この装置は、胚を含むすべての選択されたウェルから画像を自動的に取得します。96ウェルプレートは、画像取得とデータ保存に約30分かかりました。取得期間中、イメージングシステム内の内部温度はRTに維持されました。
2. 画像取得後、ハイコンテントスクリーニングシステムとカスタム自動画像解析手順を使用してデータ解析を実行します。蛍光の総面積および積分強度について分析する96ウェルプレート上の各胚を選択する。
   注:分析には、分析からのデータポイントのオーバーレイを含む画像の提供が含まれていました。
3. 次に、データポイントを集計し、ハイコンテントスクリーニングシステムからエクスポートするには、[ 測定 ]の下に移動し、[ データログを スプレッドシートに開く]を選択します。プレート取得とデータ分析の部分を 図1に示します。

5.データ分析

1. エクスポートしたスプレッドシートをコンピュータープログラムにアップロードし、デプロイヤー(dplyr)パッケージを使用して、各ウェルのデータの並べ替え、合計、およびウェル番号によるフィルタリングを行います。次に、writexl パッケージを使用して、合計データをスプレッドシートにエクスポートします。5mCプログラムコードは補足 ファイル1に示されています。

結果

このプロトコルの全体的な目的は、固定および標識されたゼブラフィッシュ胚内の蛍光の総面積と相対強度を評価することにより、処理が5-mCの相対的な存在量に影響を与えるかどうかを判断することです。プロトコルが完了したら、蛍光実体顕微鏡を使用して、最初にホールマウントIHCが成功したかどうかを判断できます。標識された胚をFITCまたはGFPフィルターの下で観察する場合、陽性?...

ディスカッション

このプロトコルでは、いくつかの重要な手順があります。まず、胚を脱絨毛する場合、発生中の胚のこれらの部分は非常に壊れやすく、穿刺しやすいため、針を胚/卵黄嚢/細胞塊の組織から遠ざけることが重要です。次に、標識された胚を個々のウェルに移すときは、プラスチックピペットに付着するため、ガラスピペットを使用して胚を移植します。第三に、ホールマウントIHCを実行する?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML