ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה שלמים.

Abstract

מתילציה של ציטוזין נשמרת מאוד בין מיני בעלי חוליות, וכגורם מפתח לתכנות אפיגנטי ולמצב הכרומטין, יש תפקיד קריטי בהתפתחות העוברית המוקדמת. שינויים אנזימטיים מניעים מתילציה פעילה ודה-מתילציה של ציטוזין ל-5-מתיל-ציטוזין (5-mC) ולאחר מכן חמצון של 5-mC ל-5-הידרוקסי-מתיל-ציטוזין, 5-פורמילציטוזין ו-5-קרבוקסילציטוזין. תכנות מחדש אפיגנטי הוא תקופה קריטית במהלך התפתחות הרחם , ולחשיפה אימהית לכימיקלים יש פוטנציאל לתכנת מחדש את האפיגנום בתוך הצאצאים. זה עלול לגרום לתוצאות שליליות כגון השלכות פנוטיפיות מיידיות, השפעות ארוכות טווח על רגישות למחלות מבוגרים והשפעות טרנס-דוריות של סימנים אפיגנטיים תורשתיים. למרות שריצוף מבוסס ביסולפיט מאפשר לחוקרים לחקור מתילציה של ציטוזין ברזולוציית זוג בסיסים, גישות מבוססות ריצוף הן בעלות גבוהה, וככאלה, מונעות את היכולת לנטר מתילציה של ציטוזין בשלבי התפתחות, ריכוזים מרובים לכל כימיקל, ולשכפל עוברים לכל טיפול. בשל הקלות של הדמיית in vivo אוטומטית, מניפולציות גנטיות, זמן התפתחות מהיר של רחם לשעבר , וגידול במהלך העוברים, עוברי דגי זברה ממשיכים לשמש כמודל שלם מבחינה פיזיולוגית לחשיפת מסלולים בתיווך קסנוביוטי התורמים לתוצאות שליליות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. לכן, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים ל-5 mC הזמינים מסחרית, אנו מתארים אסטרטגיה חסכונית לניטור מהיר ויעיל של מתילציה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה בודדים ושלמים על ידי מינוף אימונוהיסטוכימיה שלמה, הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה ועיבוד נתונים יעיל באמצעות שפת תכנות לפני ניתוח סטטיסטי. למיטב ידיעתו, שיטה זו היא הראשונה לזהות ולכמת בהצלחה רמות של 5-mC באתרם בתוך עוברי דגי זברה במהלך ההתפתחות המוקדמת. השיטה מאפשרת זיהוי של מתילציה של דנ"א בתוך מסת התא ויש לה גם את היכולת לזהות מתילציה של ציטוזין של mRNA אימהי מקומי חלמון במהלך המעבר האימהי לזיגוטי. באופן כללי, שיטה זו תהיה שימושית לזיהוי מהיר של כימיקלים שיש להם פוטנציאל לשבש מתילציה של ציטוזין באתרה במהלך תכנות מחדש אפיגנטי.

Introduction

שינויים אנזימטיים מניעים מתילציה פעילה ודה-מתילציה של ציטוזין ל-5-מתיל-ציטוזין (5-mC) ולאחר מכן חמצון של 5-mC ל-5-הידרוקסי-מתיל-ציטוזין, 5-פורמילציטוזין ו-5-קרבוקסילציטוזין ^1,2. טריס(1,3-דיכלורו-2-פרופיל) פוספט (TDCIPP) הוא מעכב בעירה בשימוש נרחב בארצות הברית שהוכח בעבר כמשנה את המסלול של מתילציה ציטוזין בעקבות חשיפה עוברית מוקדמת מ-0.75 שעות לאחר ההפריה (HPF) ועד גסטרולציה מוקדמת (6 כ"ס)3,4,5,6,7,8 . בתוך בעלי חוליות, 5-mC ונגזרותיו המתוקנות הם קריטיים לוויסות ההתפתחות העוברית המוקדמת⁹. הפריה של עובר גורמת לדה-מתילציה של הדנ"א ההורי, ואחריה פירוק mRNA אימהי, הפעלת הגנום הזיגוטי ומתילציה מחדש של הגנום הזיגוטי⁹. תהליכים רלוונטיים ביולוגית המשתמשים במתילציה של ציטוזין כוללים שינוי היסטון, גיוס מכונות שעתוק, מתילציה של RNA, תכנות מחדש אפיגנטי וקביעת מבנה הכרומטין^10,11. מתילציה של ציטוזין נשמרת גם בקרב מיני בעלי חוליות, מה שמדגיש את החשיבות של הבנה וחקירה של האופן שבו מתילציה של ציטוזין סוטה עשויה להשפיע על מסלול ההתפתחות של אורגניזם¹¹. יתר על כן, התפתחות הרחם רגישה לחשיפה אימהית ויש לה פוטנציאל לגרום לתוצאות שליליות כגון השלכות פנוטיפיות מיידיות, השפעות ארוכות טווח על רגישות למחלות מבוגרים, והשפעות טרנס-דוריות של סימנים אפיגנטיים תורשתיים^12,13,14.

קטעים ארוכים של זוגות ציטוזין-גואנין, או איי CpG, היו המוקדים העיקריים של חוקרים שמטרתם לאפיין את הדינמיקה של מתילציה של ציטוזין על פני הגנום^15,16,17. אסטרטגיות מבוססות ביסולפיט כגון ריצוף ביסולפיט בגנום שלם, ריצוף ביסולפיט בייצוג מופחת וריצוף אמפליקון ביסולפיט מייצגות את תקן הזהב לחקר מתילציה של ציטוזין ברזולוציית זוג בסיסים. עם זאת, גישות מבוססות ריצוף הן בעלות גבוהה, וככאלה, מונעות את היכולת לנטר מתילציה של ציטוזין בשלבי התפתחות, ריכוזים מרובים לכל כימיקל, ולשכפל עוברים לכל טיפול. בנוסף, גישות מבוססות ריצוף אינן מספקות מידע על לוקליזציה מרחבית, שהיא קריטית להבנת סוגי תאים ואזורים שעלולים להיות מושפעים בתוך עובר מתפתח. באופן דומה, מבחני מתילציה גלובליים של דנ"א, כגון ניתוח הגבלות תלויות מתילציה, בדיקות חיסוניות הקשורות לאנזים 5-mC (ELISAs), וספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית 5-מתיל-2'-דאוקסיציטידין (5-mC) (LC-MS) מסת על הומוגנאטים של תאים או רקמות, וככאלה, מונעים את היכולת לנטר את הלוקליזציה והגודל של מתילציה של ציטוזין על פני מרחב וזמן בתוך דגימות שלמות^12,18.

בשל הקלות של הדמיית in vivo אוטומטית, מניפולציות גנטיות, זמן התפתחות מהיר של הרחם לשעבר , וגידול במהלך העוברים, עוברי דגי זברה ממשיכים להיות בשימוש נרחב כמודלים שלמים מבחינה פיזיולוגית כדי לחשוף מסלולים בתיווך קסנוביוטי התורמים לתוצאות שליליות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. לכן, תוך שימוש בנוגדנים זמינים מסחרית ספציפיים ל-5-mC, הפרוטוקול שלהלן מתאר אסטרטגיה חסכונית לניטור מהיר ויעיל של מתילציה של ציטוזין בתוך עוברים בודדים ושלמים של דגי זברה על ידי מינוף אימונוהיסטוכימיה שלמה (IHC), הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה ועיבוד נתונים יעיל באמצעות שפת תכנות לפני ניתוח סטטיסטי.

למיטב ידיעתו, שיטה זו היא הראשונה לניטור 5-mC בתוך עוברים שלמים של דגי זברה. השיטה מאפשרת זיהוי של מתילציה של דנ"א בתוך מסת התא ויש לה גם את היכולת לזהות מתילציה של ציטוזין של mRNA אימהי מקומי חלמון במהלך המעבר האימהי לזיגוטי. באופן כללי, שיטה זו תהיה שימושית לזיהוי מהיר של כימיקלים שיש להם פוטנציאל לשבש מתילציה של ציטוזין באתרה במהלך תכנות מחדש אפיגנטי.

Protocol

מגדלים בוגרים טופלו וטופלו בהתאם ל 20180063 פרוטוקול שימוש בבעלי חיים (IACUC) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד.

1. איסוף עוברים של דגי זברה וחשיפה כימית

1. הוסף מלכודות רבייה בתוך המיכל למיכלים המכילים דגי זברה בוגרים בוגרים בוגרים מבחינה מינית וברי קיימא מבחינה רבייתית. הוסף לפחות שלוש מלכודות לכל מיכל 6 ליטר לפחות 12 שעות לפני האיסוף בשעה ~ 9:00 בבוקר, שהוא הזמן המשוער של הפריה והשרצה של ביצים בתוך מיכלים.
2. הכינו פתרון חשיפה טרי בבוקר האיסוף. תמיסת החשיפה מוכנה באמצעות פיפטה של 5 מ"ל והוספת 5.0 מ"ל של מים ללא חלקיקים לצלחת פטרי זכוכית 60 מ"מ.
3. לאחר מכן, השתמש בפיפטה מיקרו-קפילרית מזכוכית 10 μL כדי להעביר 10 μL של כלי רכב (דימתיל סולפוקסיד, או DMSO) או תמיסת מלאי כימית למערכת מים בצלחת הזכוכית.
4. סובבו את צלחת הפטרי מזכוכית כדי להבטיח שתמיסת המלאי תתפוגג. הוסיפו עוד 5.0 מ"ל של מי מערכת לצלחת פטרי הזכוכית. סובבו את צלחת הפטרי מזכוכית כדי ליצור הומוגניות של תמיסת החשיפה.
5. חזור על הפעולה עבור כל קבוצת טיפול בשכפולים של ארבעה כדי להניב ארבעה שכפולים לכל טיפול.
6. לאחר הכנת פתרונות החשיפה, מכסים את כלי הזכוכית במכסי זכוכית כדי למזער את האידוי.
7. תוך כדי הסרת מלכודות הרבייה מכל מיכל, יש לאפשר בזהירות למים שבתוך כל מלכודת להתנקז החוצה לתוך המיכל לפני ההסרה מהמכלים. ודא שהמלכודות נשארות בצד ימין למעלה.
8. מעבירים את מלכודות הרבייה לכיור המעבדה ושוטפים אותן באמצעות בקבוק שפריץ מלא במי אוסמוזה הפוכה (RO) לרשת דגים שהושרתה בעבר ב-10% אקונומיקה ונשטפה במים. שטפו את העוברים עד שכל הפסולת תתפנה ויישארו רק עוברים נקיים.
9. העבירו את העוברים מרשת הדגים באמצעות בקבוק שפריץ מלא במים של RO לתוך צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 100 מ"מ. מיין באופן אקראי 50 עוברים חיים בשעה 0.75 שעות לאחר ההפריה (hpf) והסר עודפי מים RO.
10. באמצעות מיקרוספטולה, הכניסו עוברים ממוינים לתמיסת הטיפול. כל העוברים חייבים להיות ברכב או בתמיסת טיפול לא לפני השעה 9:45. סובבו את כלי הזכוכית כדי להבטיח שהעוברים מצופים באופן שווה בתוך תמיסת הטיפול.
11. לאחר שהוגדרו ארבע צלחות משוכפלות (N = 50 לכל שכפול) עבור כל קבוצת טיפול, הניחו את מכסה הזכוכית על גבי כלי החשיפה והעבירו את כל הכלים לחממה מבוקרת טמפרטורה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד 2 כ"ס, 4 כ"ס, 6 כ"ס, 8 כ"ס או 10 כ"ס.
12. יש להכין פרפורמלדהיד טרי של 4% (PFA) לפחות 4 שעות לפני סיום החשיפה ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    1. הפעילו את הפלטה החמה ל-115 מעלות צלזיוס, הכינו 20 מ"ל של מי מלח 1x עם אגירת פוספט (PBS) (2 מ"ל של 10x PBS + 18 מ"ל של מי RO) בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ושקלו 800 מ"ג של פרפורמלדהיד.
    2. בתוך קולט אדים כימי, העבר תמיסת PBS אחת לבקבוק Erlenmeyer בגודל 250 מ"ל, הוסף 800 מ"ג של פרפורמלדהיד, ולאחר מכן הוסף 2 μL של 10 N NaOH. הניחו מדחום בתוך הבקבוקון, הניחו את הבקבוקון על הצלחת החמה, וצפו בטמפרטורה תוך כדי ערבוב.
    3. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-62-65 מעלות צלזיוס, הסירו את ה-PFA של 4% מהצלחת החמה ותנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר (RT). יש לאחסן את ה-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס.
13. לאחר שמשך החשיפה הסתיים, הוציאו את העוברים מהאינקובטור והעבירו את כל העוברים החיים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שאיפה לפתרון חשיפה שיורית באמצעות פיפטה 1 מ"ל. אין לשאוף עוברים כלשהם.
14. הוסף 500 μL של 4% PFA מקורר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל וערבב את העוברים ב-4% PFA על ידי היפוך מספר פעמים. אפשרו לעוברים להתקבע ב-4% PFA למשך הלילה.
    הערה: לא מומלץ לאפשר לעוברים לשהות ב-PFA יותר מ-12 שעות.

2. דכוריונציה של עוברים

1. למחרת, שאפו את ה-PFA של 4%, החזירו את העוברים ב-PBS אחד, ופיפטפו בעדינות למעלה ולמטה במשך 30 שניות. במידת הצורך, הפסיקו את הפרוטוקול בשלב זה ואחסנו את העוברים ב-PBS אחד ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות.
2. באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק, העבירו בזהירות עוברים קבועים לצלחת זכוכית מלאה במים RO וסובבו בעדינות במשך 30 שניות. חזור על שלב זה פעם נוספת.
3. השתמש במחטי מזרק תחת הגדלה של פי 5.0 באמצעות סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי כדי לטהר ידנית את כל העוברים. עשו זאת על ידי שימוש בקצה המחט כדי לנקב את הכוריון ולקלף אותו בעדינות מהחלמון וממסת התא⁴.
4. לאחר פירוק העוברים, השתמש בפיפטה מיקרו-קפילרית מזכוכית כדי להעביר עד 25 עוברים שלמים לסל אימונוכימיה אחד (IHC) והנח את סל ה- IHC בצלחת של 96 בארות. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשאוף את מי RO מכל באר.

3. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן ספציפי ל-5 mC

1. יש להשעות את העוברים ב-500 μL של חיץ חוסם (1x PBST + 2% סרום כבשים + 2 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר) לכל באר, ולעטוף את הצלחת בפרפילם ובנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות על שייקר מסלולי (100 סל"ד).
2. הסר את עטיפת הפרפילם והאלומיניום והשתמש בפיפטה של 1 מ"ל כדי לשאוף את המאגר החוסם מכל באר. החלף אותו עם 500 μL של דילול 1:100 של נוגדן עכבר חד שבטי נגד 5-mC במאגר החסימה. דגירה של כל העוברים עם נוגדנים ראשוניים למעט תת-קבוצה של עוברי בקרת רכב אשר יודגרו עם המאגר החוסם כדי להתחשב ברעשי רקע. היזהר לא לשבש את שלמות העוברים, ולא לשאוף עוברים במהלך שלב זה.
3. עטפו מחדש את הצלחת בפרפילם ובנייר אלומיניום ואפשרו לצלחת לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר מסלולי (100 סל"ד).
4. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית מכל באר והחלף אותה ב- 1x PBS + 0.1% Tween-20 (1x PBST). יש לשטוף כל באר שלוש פעמים עם PBST אחד למשך 15 דקות לכל שטיפה על שייקר אורביטלי (100 סל"ד).
5. החלף PBST 1x בדילול 1:500 של נוגדן IgG נגד עכברים עזים בחסימת חיץ ודגירה של כל העוברים עם הנוגדן המשני. תנו לצלחת לדגור ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר אורביטלי (100 סל"ד).
6. למחרת, הסר את הנוגדן המשני ושטוף את התמיסה השיורית שלוש פעמים עם PBST אחד למשך 15 דקות לכל שטיפה על שייקר אורביטלי (100 סל"ד).
   הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן עד 48 שעות אם סלי IHC מאוחסנים בבארות נקיות מלאות ב- PBS 1x.
7. השתמש בפיפטה של 1 מ"ל כדי לשאוף 1x PBST מכל באר והנח את סל ה- IHC לתוך צלחת פטרי זכוכית מלאה במי RO. תחת סטריאומיקרוסקופ סטנדרטי, מיין באופן אקראי עוברים שלמים לצלחת של 96 בארות, והתוצאה היא עובר אחד לכל באר.
8. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הסר את כל מי ה- RO מבארות בודדות והחלף אותם ב- 200 μL של PBS אחד. צנטריפוגה את הצלחת במשך 3 דקות ב 1 x גרם.

4. הדמיה אוטומטית של עוברים בתוך לוחות 96 בארות

1. דמיינו את העוברים עם מטרה של פי 2 תחת האור המועבר ו-FITC באמצעות מערכת סינון בעלת תוכן גבוה (Table of Materials).
   הערה: תמונה פלואורסצנטית של כל עובר צולמה באופן אוטומטי באמצעות ההגדלה הנ"ל ומסנן FITC¹⁹.
   1. בחר מיקוד אוטומטי כדי להבטיח שהמיקוד של המצלמה יהיה בתחתית הלוח ויוסט על-ידי העובי התחתון.
   2. בחר אורך גל FITC עם משך חשיפה של 100 אלפיות השנייה, והגדר את המיקוד האוטומטי ללייזר עם היסט Z. שימו לב ואשרו רכישת תמונה נכונה במספר בארות לפני תחילת רכישת הלוחות.
      הערה: המכשיר מקבל באופן אוטומטי תמונות מכל הבארות שנבחרו המכילות עוברים. לוח של 96 בארות דרש כ-30 דקות לרכישת תמונות ואחסון נתונים. במשך תקופת הרכישה, הטמפרטורה הפנימית בתוך מערכת ההדמיה נשמרה ב- RT.
2. לאחר רכישת תמונה, בצע ניתוח נתונים באמצעות מערכת סינון תוכן גבוהה והליך ניתוח תמונה אוטומטי מותאם אישית. בחר כל עובר על צלחת 96 באר כדי לנתח את השטח הכולל ואת עוצמת הפלואורסצנציה המשולבת.
   הערה: הניתוח כלל מתן תמונות שהכילו שכבות-על של נקודות נתונים מהניתוח.
3. לאחר מכן, טבל את נקודות הנתונים וייצא אותן ממערכת הסינון בעלת התוכן הגבוה על-ידי מעבר תחת מדידה ובחירה באפשרות פתח יומן נתונים לגיליון אלקטרוני. חלקי רכישת הלוחות וניתוח הנתונים מתוארים באיור 1.

5. ניתוח נתונים

1. העלה את הגיליון האלקטרוני המיוצא לתוכנית מחשב שבה חבילת הפורס (dplyr) משמשת למיון, לסיכום נתונים עבור כל באר ולסינון לפי מספר באר. לאחר מכן, חבילת writexl משמשת לייצוא הנתונים המסוכמים לגיליון אלקטרוני. קוד התוכנית 5mC מוצג בקובץ משלים 1.

תוצאות

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לקבוע אם טיפול משפיע על השפע היחסי של 5-mC על ידי הערכת השטח הכולל והעוצמה היחסית של פלואורסצנטיות בתוך עוברים קבועים ומסומנים של דגי זברה. לאחר השלמת הפרוטוקול, ניתן להשתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע תחילה אם IHC השלם היה מוצלח. כאשר עוברים מסומני...

Discussion

במהלך פרוטוקול זה, ישנם כמה שלבים שהם קריטיים. ראשית, בעת דכוריזציה של עוברים, חשוב לכוון את המחט הרחק מהרקמה של העובר/שק החלמון/מסת התא, שכן חלקים אלה של העובר המתפתח שבריריים מאוד וקלים לניקוב. שנית, בעת העברת עוברים מסומנים לבארות בודדות, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר עוברים מכיוון שהם ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML