온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

요약

이 논문은 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화의 신속하고 효율적인 시공간적 모니터링을 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

시토신 메틸화는 척추동물 종에 걸쳐 고도로 보존되어 있으며 후성유전학적 프로그래밍과 염색질 상태의 핵심 동인으로서 초기 배아 발달에 중요한 역할을 합니다. 효소 변형은 시토신의 활성 메틸화 및 탈메틸화를 5-메틸시토신(5-mC)으로 유도하고 이후 5-mC를 5-하이드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신 및 5-카르복실시토신으로 산화시킵니다. 후성유전학적 재프로그래밍은 자궁 발달 중 중요한 시기이며, 산모가 화학 물질에 노출되면 자손 내에서 후성유전체를 재프로그래밍할 가능성이 있습니다. 이것은 잠재적으로 즉각적인 표현형 결과, 성인 질병 감수성에 대한 장기적인 영향 및 유전 된 후성 유전 학적 마크의 세대 간 효과와 같은 불리한 결과를 유발할 수 있습니다. 중아황산염 기반 시퀀싱을 통해 연구자는 염기쌍 분해능에서 시토신 메틸화를 조사할 수 있지만 시퀀싱 기반 접근 방식은 비용이 많이 들기 때문에 발달 단계에 걸쳐 시토신 메틸화를 모니터링하고 화학 물질당 여러 농도를 모니터링하고 치료당 배아를 복제하는 기능을 배제합니다. 자동화된 생체 내 이미징, 유전자 조작, 빠른 자궁 외 발달 시간 및 배아 발생 중 사육의 용이성으로 인해 제브라피쉬 배아는 초기 배아 발달 동안 불리한 결과에 기여하는 이생물 매개 경로를 밝히기 위한 생리학적으로 온전한 모델로 계속 사용됩니다. 따라서 상용 5-mC 특이적 항체를 사용하여 전체 마운트 면역조직화학, 자동화된 고함량 이미징 및 통계 분석 전에 프로그래밍 언어를 사용한 효율적인 데이터 처리를 활용하여 개별 온전한 제브라피쉬 배아 내 시토신 메틸화의 빠르고 효율적인 시공간 모니터링을 위한 비용 효율적인 전략을 설명합니다. 현재 지식에 따르면, 이 방법은 초기 발달 동안 제브라피쉬 배아 내에서 in situ 5-mC 수준을 성공적으로 검출하고 정량화한 최초의 방법입니다. 이 방법은 세포 덩어리 내에서 DNA 메틸화의 검출을 가능하게하고 또한 모체에서 접합체로의 전이 동안 노른자 국소화 된 모체 mRNA의 시토신 메틸화를 검출 할 수있는 능력을 갖는다. 전반적으로, 이 방법은 후성유전학적 재프로그래밍 동안 현장에서 시토신 메틸화를 방해할 가능성이 있는 화학물질을 신속하게 식별하는 데 유용할 것입니다.

서문

효소 변형은 시토신의 활성 메틸화 및 탈메틸화를 5-메틸시토신(5-mC)으로 유도하고 후속 5-mC를 5-하이드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신 및 5-카르복실시토신 ^1,2로 산화시킵니다. 트리스 (1,3- 디클로로 -2- 프로필) 포스페이트 (TDCIPP)는 미국에서 널리 사용되는 난연제로, 수정 후 0.75 시간 (HPF)에서 조기 위장 (6 hpf)까지 초기 배아 노출 후 시토신 메틸화의 궤적을 변경하는 것으로 이전에 입증되었습니다.3,4,5,6,7,8 . 척추동물 내에서 5-mC와 그 변형된 유도체는 초기 배^{아 발달을} 조절하는 데 중요합니다9. 배아의 수정은 부모 DNA의 탈메틸화를 유발하고, 모체 mRNA 분해, 접합체 게놈 활성화 및 접합체^게놈의 재메틸화를 유발합니다9. 시토신 메틸화를 활용하는 생물학적으로 관련된 과정에는 히스톤 변형, 전사 기계의 모집, RNA 메틸화, 후성유전학적 재프로그래밍 및 염색질 구조^10,11의 결정이 포함됩니다. 시토신 메틸화는 또한 척추동물 종들 사이에서 보존되며, 비정상적인 시토신 메틸화가 유기체의 발달 궤적에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하고 조사하는 것의 중요성을 강조합니다¹¹. 또한, 자궁 내 발달은 산모의 노출에 민감하며 즉각적인 표현형 결과, 성인 질병 감수성에 대한 장기적인 영향 및 유전 된 후성 유전 학적 표시의 세대 간 영향과 같은 불리한 결과를 초래할 가능성이 있습니다^12,13,14.

시토신-구아닌 쌍 또는 CpG 섬의 긴 스트레칭은 게놈^15,16,17에 걸친 시토신 메틸화의 역학을 특성화하는 것을 목표로 하는 연구자의 주요 초점이었습니다. 전체 게놈 중아황산염 시퀀싱, 감소된 표현 중아황산염 시퀀싱 및 중아황산염 앰플리콘 시퀀싱과 같은 중아황산염 기반 전략은 염기쌍 분해능에서 시토신 메틸화를 조사하기 위한 황금 표준을 나타냅니다. 그러나 시퀀싱 기반 접근 방식은 비용이 많이 들기 때문에 발달 단계에 걸쳐 시토신 메틸화를 모니터링하고 화학 물질당 여러 농도를 모니터링하고 치료당 배아를 복제하는 기능을 배제합니다. 또한 시퀀싱 기반 접근 방식은 공간 국소화에 대한 정보를 제공하지 않으며, 이는 잠재적으로 영향을 받는 세포 유형 및 발달 중인 배아 내 영역을 이해하는 데 중요합니다. 유사하게, 메틸화 의존적 제한 분석, 5-mC 효소 결합 면역 분석법 (ELISAs) 및 5-메틸-2'-데옥시시티딘 (5-mC) 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)과 같은 글로벌 DNA 메틸화 분석은 세포 또는 조직 균질물에 의존하며, 따라서 손상되지 않은 표본^12,18 내에서 공간 및 시간에 따른 시토신 메틸화의 국소화 및 크기를 모니터링하는 능력을 배제합니다.

자동화된 생체 내 이미징의 용이성, 유전자 조작, 빠른 자궁 외 발달 시간 및 배아 발생 중 축산으로 인해 제브라피쉬 배아는 초기 배아 발달 동안 불리한 결과에 기여하는 이물질적 매개 경로를 밝히기 위해 생리학적으로 온전한 모델로 계속 널리 사용되고 있습니다. 따라서 아래 프로토콜은 5-mC에 특이적인 시판되는 항체를 사용하여 전체 마운트 면역조직화학(IHC), 자동화된 고함량 이미징 및 통계 분석 전에 프로그래밍 언어를 사용한 효율적인 데이터 처리를 활용하여 개별 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 시토신 메틸화의 빠르고 효율적인 시공간 모니터링을 위한 비용 효율적인 전략을 설명합니다.

현재 지식에 따르면,이 방법은 손상되지 않은 제브라 피쉬 배아 내에서 5-mC를 모니터링하는 최초의 방법입니다. 이 방법은 세포 덩어리 내에서 DNA 메틸화의 검출을 가능하게하고 또한 모체에서 접합체로의 전이 동안 노른자 국소화 된 모체 mRNA의 시토신 메틸화를 검출 할 수있는 능력을 갖는다. 전반적으로, 이 방법은 후성유전학적 재프로그래밍 동안 현장에서 시토신 메틸화를 방해할 가능성이 있는 화학물질을 신속하게 식별하는 데 유용할 것입니다.

프로토콜

성인 육종가는 리버 사이드에있는 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 승인 동물 사용 프로토콜 (# 20180063)에 따라 취급 및 처리되었습니다.

1. 제브라피쉬 배아 수집 및 화학 물질 노출

1. 성적으로 성숙하고 생식 가능한 성인 수컷과 암컷 제브라 피쉬가 들어있는 탱크에 탱크 내 번식 트랩을 추가하십시오. 수거 최소 12 시간 전에 ~ 9 : 00 AM에 6L 탱크 당 최소 3 개의 트랩을 추가하십시오.이 트랩은 탱크 내에서 알의 수정 및 산란의 대략적인 시간입니다.
2. 수집 아침에 신선한 노출 용액을 준비하십시오. 노출 용액은 5mL 피펫을 사용하고 60mm 유리 페트리 접시에 5.0mL의 무미립자 시스템 수를 추가하여 준비합니다.
3. 그런 다음 10μL 유리 미세 모세관 피펫을 사용하여 10μL의 비히클(디메틸 설폭사이드 또는 DMSO) 또는 화학 원액을 유리 접시의 시스템 물로 옮깁니다.
4. 유리 페트리 접시를 소용돌이 치면 저장 용액이 사라집니다. 유리 페트리 접시에 시스템 물 5.0mL를 더 추가합니다. 유리 페트리 접시를 소용돌이 치며 노출 용액을 균질화합니다.
5. 각 처리 그룹에 대해 4회 반복하여 치료당 4회 반복을 생성합니다.
6. 노출 용액을 준비한 후 증발을 최소화하기 위해 유리 뚜껑으로 유리 접시를 덮으십시오.
7. 각 탱크에서 번식 트랩을 제거하는 동안 탱크에서 제거하기 전에 각 트랩 내의 물이 탱크로 배출되도록 주의하십시오. 트랩이 오른쪽이 위로 향하도록 하십시오.
8. 번식 트랩을 실험실 싱크대로 옮기고 역삼 투 (RO) 물로 채워진 분출 병을 사용하여 이전에 10 % 표백제에 담그고 물로 헹구어 낸 어망에 헹굽니다. 모든 파편이 제거되고 깨끗한 배아 만 남을 때까지 배아를 헹굽니다.
9. RO 물이 채워진 분출 병을 사용하여 어망에서 배아를 100mm 플라스틱 페트리 접시로 옮깁니다. 수정 후 0.75시간(hpf)에 50개의 살아있는 배아를 무작위로 분류하고 과도한 RO 물을 제거합니다.
10. 미세 주걱을 사용하여 분류 된 배아를 치료 용액에 넣습니다. 모든 배아는 오전 9시 45분 이전에 비히클 또는 치료 용액 내에 있어야 합니다. 유리 접시를 소용돌이 치면 배아가 치료 용액 내에 고르게 코팅됩니다.
11. 각 처리 그룹에 대해 4 개의 반복 접시 (반복 당 N = 50)를 설정 한 후 유리 뚜껑을 노출 접시 위에 놓고 모든 접시를 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf 또는 10 hpf가 될 때까지 28 ° C로 설정된 온도 제어 인큐베이터로 옮깁니다.
12. 노출 종료 최소 4시간 전에 신선한 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비하고 4°C에서 보관하십시오.
    1. 핫플레이트를 115°C로 켜고 50mL 원심분리 튜브에 20mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(2mL의 10x PBS + 18mL의 RO 물)를 만들고 800mg의 파라포름알데히드의 무게를 뽑습니다.
    2. 화학 흄 후드 내에서 1x PBS 용액을 250mL 삼각 플라스크에 옮기고 800mg의 파라포름알데히드를 추가한 다음 2μL의 10N NaOH를 추가합니다. 플라스크 안에 온도계를 놓고 플라스크를 핫 플레이트에 놓고 저으면서 온도를 관찰합니다.
    3. 온도가 62-65°C에 도달하면 핫 플레이트에서 4% PFA를 제거하고 실온(RT)으로 식힙니다. 4% PFA를 4°C에서 보관한다.
13. 노출 기간이 끝나면 인큐베이터에서 배아를 제거하고 모든 살아있는 배아를 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1mL 피펫을 사용하여 잔류 노출 용액을 흡인합니다. 배아를 흡인하지 마십시오.
14. 500μL의 냉각된 4% PFA를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 넣고 여러 번 뒤집어 배아를 4% PFA에 혼합합니다. 배아가 밤새 4 % PFA로 고정되도록하십시오.
    참고: 배아가 PFA에 12시간 이상 머무르도록 두는 것은 권장하지 않습니다.

2. 배아의 탈코리오네이션

1. 다음 날, 4% PFA를 흡인하고, 배아를 1x PBS에 재현탁시키고, 30초 동안 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 필요한 경우 이 단계에서 프로토콜을 중지하고 배아를 4°C의 1x PBS에 최대 48시간 동안 보관합니다.
2. 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 고정 된 배아를 RO 물이 채워진 유리 접시에 조심스럽게 옮기고 30 초 동안 부드럽게 소용돌이 치십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
3. 표준 실체 현미경을 사용하여 5.0x 배율의 주사기 바늘을 사용하여 모든 배아를 수동으로 탈균합니다. 바늘 끝을 사용하여 융모막에 구멍을 뚫고 노른자와 세포 덩어리에서 부드럽게 떼어냅니다⁴.
4. 배아가 탈육종되면 유리 미세모세관 피펫을 사용하여 최대 25개의 온전한 배아를 하나의 면역화학(IHC) 바구니에 옮기고 IHC 바구니를 96웰 플레이트에 넣습니다. 1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 RO 물을 흡입합니다.

3. 5-mC 특이 항체를 이용한 면역조직화학

1. 웰당 500μL의 블로킹 완충액(1x PBST + 2% 양 혈청 + 2mg/mL 소 혈청 알부민)에 배아를 재현탁하고 플레이트를 파라필름과 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호합니다. 오비탈 쉐이커(100rpm) 상에서 4°C에서 4시간 동안 배양한다.
2. 파라필름 랩과 알루미늄을 제거하고 1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 차단 완충액을 흡인합니다. 블로킹 완충액에서 1:100 희석된 단일클론 마우스 항-5-mC 항체 500μL로 교체합니다. 배경 소음을 설명하기 위해 차단 완충액과 함께 인큐베이션될 비히클 대조 배아의 하위 세트를 제외한 모든 배아를 1차 항체와 함께 인큐베이션합니다. 이 단계에서 배아의 무결성을 손상시키거나 배아를 흡인하지 않도록 주의하십시오.
3. 플레이트를 파라필름 및 알루미늄 호일로 다시 감싸고 플레이트를 오비탈 쉐이커(100rpm)에서 밤새 4°C에서 배양하도록 합니다.
4. 다음날, 각 웰에서 1차 항체 용액을 제거하고 1x PBS + 0.1% Tween-20(1x PBST)으로 교체합니다. 오비탈 셰이커(100rpm)에서 세척당 15분 동안 1x PBST로 각 웰을 3회 세척합니다.
5. 1x PBST를 차단 완충액에서 염소 항-마우스 IgG 항체의 1:500 희석으로 대체하고 모든 배아를 2차 항체와 함께 배양합니다. 플레이트를 오비탈 쉐이커(100 rpm) 상에서 밤새 4°C에서 인큐베이션하도록 하였다.
6. 다음날, 2차 항체를 제거하고, 잔류 용액을 오비탈 쉐이커 상에서 세척 당 15분 동안 1x PBST로 3회 세척한다(100 rpm).
   알림: IHC 바스켓이 48x PBS로 채워진 깨끗한 우물에 보관되는 경우 최대 1시간 동안 프로토콜을 중지할 수 있습니다.
7. 1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 1x PBST를 흡입하고 IHC 바스켓을 RO 물로 채워진 유리 페트리 접시에 넣습니다. 표준 실체 현미경으로 온전한 배아를 96웰 플레이트에 무작위로 분류하여 웰당 하나의 배아를 만듭니다.
8. 1mL 피펫을 사용하여 개별 웰에서 모든 RO 물을 제거하고 200μL의 1x PBS로 교체합니다. 플레이트를 1 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.

4. 96웰 플레이트 내 배아의 자동 이미징

1. 투과광 및 FITC에서 2x 대물렌즈로 배아를 고함량 스크리닝 시스템(재료 표)을 사용하여 이미지화합니다.
   참고: 각 배아의 형광 이미지는 상기 언급된 배율 및 FITC 필터(¹⁹)를 사용하여 자동으로 캡처되었다.
   1. 자동 초점을 선택하여 카메라의 초점이 플레이트 하단에 있고 하단 두께만큼 오프셋되도록 합니다.
   2. 노출 지속 시간이 100ms인 FITC 파장을 선택하고 자동 초점을 Z 오프셋이 있는 레이저로 설정합니다. 플레이트 획득을 시작하기 전에 여러 웰에서 적절한 이미지 획득을 관찰하고 확인합니다.
      알림: 기기는 배아가 포함된 선택된 모든 웰에서 이미지를 자동으로 획득합니다. 96웰 플레이트는 이미지 획득 및 데이터 저장에 약 30분이 소요되었습니다. 획득 기간 동안 이미징 시스템 내의 내부 온도는 RT로 유지되었습니다.
2. 이미지 획득 후 고함량 스크리닝 시스템과 맞춤형 자동 이미지 분석 절차를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 96웰 플레이트에서 각 배아를 선택하여 전체 면적과 통합 형광 강도를 분석합니다.
   참고: 분석에는 분석에서 데이터 포인트의 오버레이가 포함된 이미지 제공이 포함되었습니다.
3. 그런 다음 데이터 요소를 표로 만들고 측정 아래로 이동하고 스프레드시트로 데이터 로그 열기 를 선택하여 고함량 심사 시스템에서 내보냅니다. 플레이트 수집 및 데이터 분석 부분은 그림 1에 나와 있습니다.

5. 데이터 분석

1. 내보낸 스프레드시트를 배포자(dplyr) 패키지를 사용하여 각 웰에 대한 데이터를 정렬, 합산하고 웰 번호로 필터링하는 컴퓨터 프로그램에 업로드합니다. 그런 다음 writexl 패키지를 사용하여 합산된 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 5mC 프로그램 코드는 보충 파일 1에 나와 있습니다.

결과

이 프로토콜의 전반적인 목표는 고정 및 표지된 제브라피쉬 배아 내에서 형광의 전체 면적과 상대적 강도를 평가하여 치료가 5-mC의 상대적 풍부도에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것입니다. 프로토콜을 완료한 후 형광 실체 현미경을 사용하여 먼저 전체 장착 IHC가 성공했는지 여부를 결정할 수 있습니다. 표지된 배아를 FITC 또는 GFP 필터 하에서 관찰할 때, 양성 결과는 배아 내에서 양성 FITC ?...

토론

이 프로토콜 중에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 배아를 제거 할 때 발달중인 배아의 이러한 부분은 매우 연약하고 구멍을 뚫기 쉽기 때문에 배아 / 난황낭 / 세포 덩어리의 조직에서 바늘을 멀리 향하게하는 것이 중요합니다. 둘째, 라벨이 붙은 배아를 개별 웰로 옮길 때 유리 피펫을 사용하여 배아가 플라스틱 피펫에 부착되므로 배아를 옮깁니다. 셋째, 전체 장착 IHC를 수행할 때 플레?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML