Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen.

Zusammenfassung

Die Cytosinmethylierung ist bei Wirbeltierarten hoch konserviert und spielt als Schlüsselfaktor für epigenetische Programmierung und Chromatinzustand eine entscheidende Rolle in der frühen Embryonalentwicklung. Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin voran. Epigenetische Reprogrammierung ist eine kritische Phase während der utero-Entwicklung , und die mütterliche Exposition gegenüber Chemikalien hat das Potenzial, das Epigenom innerhalb der Nachkommen neu zu programmieren. Dies kann möglicherweise zu nachteiligen Ergebnissen wie unmittelbaren phänotypischen Folgen, langfristigen Auswirkungen auf die Krankheitsanfälligkeit bei Erwachsenen und transgenerationalen Auswirkungen vererbter epigenetischer Markierungen führen. Obwohl die Bisulfit-basierte Sequenzierung es Forschern ermöglicht, die Cytosinmethylierung mit Basenpaarauflösung abzufragen, sind sequenzierungsbasierte Ansätze unerschwinglich und schließen daher die Fähigkeit aus, die Cytosinmethylierung über Entwicklungsstadien, mehrere Konzentrationen pro Chemikalie und Replikation von Embryonen pro Behandlung hinweg zu überwachen. Aufgrund der Leichtigkeit der automatisierten In-vivo-Bildgebung , genetischer Manipulationen, schneller Ex-utero-Entwicklungszeit und Haltung während der Embryogenese werden Zebrafischembryonen weiterhin als physiologisch intaktes Modell zur Aufdeckung von xenobiotisch vermittelten Signalwegen verwendet, die zu nachteiligen Ergebnissen während der frühen embryonalen Entwicklung beitragen. Daher beschreiben wir unter Verwendung kommerziell verfügbarer 5-mC-spezifischer Antikörper eine kostengünstige Strategie für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der Cytosinmethylierung in einzelnen, intakten Zebrafischembryonen durch Nutzung der gesamten Immunhistochemie, automatisierter High-Content-Bildgebung und effizienter Datenverarbeitung unter Verwendung der Programmiersprache vor der statistischen Analyse. Nach heutigem Kenntnisstand ist diese Methode die erste, die erfolgreich 5-mC-Spiegel in situ in Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung nachweist und quantifiziert. Die Methode ermöglicht den Nachweis von DNA-Methylierung innerhalb der Zellmasse und hat auch die Fähigkeit, Cytosin-Methylierung von Eigelb-lokalisierten mütterlichen mRNAs während des mütterlichen zu zygotischen Übergangs nachzuweisen. Insgesamt wird diese Methode für die schnelle Identifizierung von Chemikalien nützlich sein, die das Potenzial haben, die Cytosinmethylierung in situ während der epigenetischen Reprogrammierung zu stören.

Einleitung

Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin ^1,2 voran. Tris(1,3-dichlor-2-propyl) phosphat (TDCIPP) ist ein in den Vereinigten Staaten weit verbreitetes Flammschutzmittel, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es den Verlauf der Cytosinmethylierung nach früher embryonaler Exposition von 0,75 Stunden nach der Befruchtung (hpf) bis zur frühen Gastrulation (6 hpf⁾ verändert3,4,5,6,7,8 . Bei Wirbeltieren sind 5-mC und seine modifizierten Derivate entscheidend für die Regulierung der frühen Embryonalentwicklung⁹. Die Befruchtung eines Embryos löst die Demethylierung der elterlichen DNA aus, gefolgt vom mütterlichen mRNA-Abbau, der Aktivierung des zygotischen Genoms und der Remethylierung des zygotischen Genoms⁹. Zu den biologisch relevanten Prozessen, die die Cytosinmethylierung nutzen, gehören die Histonmodifikation, die Rekrutierung von Transkriptionsmaschinen, die RNA-Methylierung, die epigenetische Reprogrammierung und die Bestimmung der Chromatinstruktur^10,11. Die Cytosinmethylierung ist auch bei Wirbeltierarten konserviert, was unterstreicht, wie wichtig es ist, zu verstehen und zu untersuchen, wie aberrante Cytosinmethylierung den Entwicklungsverlauf eines Organismus beeinflussen kann¹¹. Darüber hinaus reagiert die Entwicklung in utero empfindlich auf mütterliche Exposition und hat das Potenzial, nachteilige Ergebnisse wie unmittelbare phänotypische Folgen, langfristige Auswirkungen auf die Krankheitsanfälligkeit bei Erwachsenen und transgenerationale Effekte von vererbten epigenetischen Markierungen zu verursachen^12,13,14.

Lange Strecken von Cytosin-Guanin-Paaren oder CpG-Inseln waren die primären Schwerpunkte von Forschern, die darauf abzielen, die Dynamik der Cytosinmethylierung über das Genom 15,16,17 zu charakterisieren. Bisulfit-basierte Strategien wie die Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms, die Bisulfitsequenzierung mit reduzierter Repräsentation und die Bisulfitamplikonsequenzierung stellen den Goldstandard für die Abfrage der Cytosinmethylierung bei Basenpaarauflösung dar. Sequenzierungsbasierte Ansätze sind jedoch unerschwinglich und schließen daher die Möglichkeit aus, die Cytosinmethylierung über Entwicklungsstadien, mehrere Konzentrationen pro Chemikalie und Replikation von Embryonen pro Behandlung hinweg zu überwachen. Darüber hinaus liefern sequenzierungsbasierte Ansätze keine Informationen über die räumliche Lokalisation, die für das Verständnis potenziell betroffener Zelltypen und -bereiche innerhalb eines sich entwickelnden Embryos entscheidend ist. In ähnlicher Weise beruhen globale DNA-Methylierungsassays wie die methylierungsabhängige Restriktionsanalyse, 5-mC-Enzym-verknüpfte Immunoassays (ELISAs) und die 5-Methyl-2'-Desoxycytidin-(5-mC)-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) auf Zell- oder Gewebehomogenaten und schließen daher die Fähigkeit aus, die Lokalisation und das Ausmaß der Cytosinmethylierung über Raum und Zeit innerhalb intakter Proben zu überwachen^12,18.

Aufgrund der einfachen automatisierten In-vivo-Bildgebung , genetischer Manipulationen, schneller Ex-utero-Entwicklungszeit und Haltung während der Embryogenese werden Zebrafischembryonen weiterhin häufig als physiologisch intakte Modelle verwendet, um xenobiotisch vermittelte Signalwege aufzudecken, die zu nachteiligen Ergebnissen während der frühen Embryonalentwicklung beitragen. Daher beschreibt das folgende Protokoll unter Verwendung kommerziell verfügbarer Antikörper, die spezifisch für 5-mC sind, eine kostengünstige Strategie für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der Cytosinmethylierung in einzelnen, intakten Zebrafischembryonen durch Nutzung der gesamten Immunhistochemie (IHC), automatisierter High-Content-Bildgebung und effizienter Datenverarbeitung unter Verwendung der Programmiersprache vor der statistischen Analyse.

Nach heutigem Kenntnisstand ist diese Methode die erste, die 5-mC in intakten Zebrafischembryonen überwacht. Die Methode ermöglicht den Nachweis von DNA-Methylierung innerhalb der Zellmasse und hat auch die Fähigkeit, Cytosin-Methylierung von Eigelb-lokalisierten mütterlichen mRNAs während des mütterlichen zu zygotischen Übergangs nachzuweisen. Insgesamt wird diese Methode für die schnelle Identifizierung von Chemikalien nützlich sein, die das Potenzial haben, die Cytosinmethylierung in situ während der epigenetischen Reprogrammierung zu stören.

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Protokoll

Erwachsene Züchter wurden in Übereinstimmung mit einem vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Tierverwendungsprotokoll (#20180063) an der University of California, Riverside, behandelt und behandelt.

1. Embryonenentnahme durch Zebrafische und chemische Exposition

1. Fügen Sie Becken mit geschlechtsreifen und reproduktiv lebensfähigen erwachsenen männlichen und weiblichen Zebrafischen Zuchtfallen hinzu. Fügen Sie mindestens drei Fallen pro 6-L-Tank mindestens 12 Stunden vor der Entnahme um ~9:00 Uhr hinzu, was der ungefähren Zeit der Befruchtung und des Laichens von Eiern in Tanks entspricht.
2. Bereiten Sie am Morgen der Entnahme eine frische Expositionslösung vor. Die Expositionslösung wird mit einer 5-ml-Pipette hergestellt und 5,0 mL partikelfreies Systemwasser in eine 60 mm Glas-Petrischale gegeben.
3. Verwenden Sie dann eine 10-μL-Glas-Mikrokapillarpipette, um 10 μl Vehikel (Dimethylsulfoxid oder DMSO) oder chemische Stammlösung in Systemwasser in der Glasschale zu übertragen.
4. Schwenken Sie die Glaspetrischale, um sicherzustellen, dass sich die Stammlösung auflöst. Weitere 5,0 ml Systemwasser in die Glas-Petrischale geben. Schwenken Sie die Glas-Petrischale, um die Belichtungslösung zu homogenisieren.
5. Wiederholen Sie dies für jede Behandlungsgruppe in Wiederholungen von vier, um vier Replikate pro Behandlung zu erhalten.
6. Nachdem die Belichtungslösungen vorbereitet wurden, verschließen Sie das Glasgeschirr mit Glasdeckeln, um die Verdunstung zu minimieren.
7. Lassen Sie beim Entfernen der Zuchtfallen aus jedem Tank vorsichtig das Wasser in jeder Falle in den Tank abfließen, bevor Sie es aus den Tanks entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Fallen mit der rechten Seite nach oben bleiben.
8. Bringen Sie die Zuchtfallen in die Laborspüle und spülen Sie sie mit einer Spritzflasche, die mit Umkehrosmosewasser (RO) gefüllt ist, in ein Fischnetz, das zuvor mit 10% Bleichmittel getränkt und mit Wasser gespült wurde. Spülen Sie die Embryonen, bis alle Trümmer beseitigt sind und nur saubere Embryonen übrig bleiben.
9. Die Embryonen aus dem Fischnetz mit einer mit RO-Wasser gefüllten Spritzflasche in eine 100 mm große Kunststoff-Petrischale geben. Sortieren Sie 50 lebende Embryonen nach dem Zufallsprinzip 0,75 h nach der Befruchtung (hpf) und entfernen Sie überschüssiges RO-Wasser.
10. Legen Sie die sortierten Embryonen mit einem Mikrospatel in die Behandlungslösung. Alle Embryonen müssen sich frühestens um 9:45 Uhr im Vehikel oder in der Behandlungslösung befinden. Schwenken Sie die Glasschalen, um sicherzustellen, dass die Embryonen gleichmäßig in der Behandlungslösung beschichtet sind.
11. Nachdem vier Replikatschalen (N = 50 pro Replikat) für jede Behandlungsgruppe aufgestellt wurden, setzen Sie den Glasdeckel auf die Belichtungsschalen und geben Sie alle Schalen in einen temperaturgesteuerten Inkubator, der auf 28 °C bis 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf oder 10 hpf eingestellt ist.
12. Frisches 4%iges Paraformaldehyd (PFA) mindestens 4 h vor Beendigung der Exposition zubereiten und bei 4 °C lagern.
    1. Drehen Sie die Kochplatte auf 115 °C, stellen Sie 20 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (2 ml 10x PBS + 18 ml RO-Wasser) in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen her und wiegen Sie 800 mg Paraformaldehyd aus.
    2. In einem chemischen Abzug 1x PBS-Lösung in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben geben, 800 mg Paraformaldehyd hinzufügen und dann 2 μL 10 N NaOH hinzufügen. Legen Sie ein Thermometer in den Kolben, stellen Sie den Kolben auf die Heizplatte und beobachten Sie die Temperatur unter Rühren.
    3. Wenn die Temperatur 62-65 °C erreicht, entfernen Sie die 4% PFA von der Heizplatte und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) abkühlen. Lagern Sie die 4% PFA bei 4 °C.
13. Sobald die Expositionsdauer abgelaufen ist, entnehmen Sie die Embryonen aus dem Inkubator und übertragen Sie alle lebenden Embryonen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Saugen Sie die Restexpositionslösung mit einer 1-ml-Pipette ab. Saugen Sie keine Embryonen ab.
14. Geben Sie 500 μL gekühltes 4% PFA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie die Embryonen in 4% PFA durch mehrmaliges Invertieren. Lassen Sie die Embryonen über Nacht 4% PFA fixieren.
    HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, Embryonen länger als 12 h in PFA zu lassen.

2. Dechorionation von Embryonen

1. Am nächsten Tag saugen Sie die 4% PFA ab, resuspendieren Sie die Embryonen in 1x PBS und pipettieren Sie vorsichtig für 30 s. Falls erforderlich, stoppen Sie das Protokoll bei diesem Schritt und lagern Sie die Embryonen in 1x PBS bei 4 °C für bis zu 48 h.
2. Mit einer Kunststoff-Transferpipette die fixierten Embryonen vorsichtig in eine mit RO-Wasser gefüllte Glasschale übertragen und 30 s lang sanft schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
3. Verwenden Sie Spritzennadeln unter 5,0-facher Vergrößerung mit einem Standard-Stereomikroskop, um alle Embryonen manuell zu dechorionieren. Tun Sie dies, indem Sie die Nadelspitze verwenden, um das Chorion zu punktieren und es sanft vom Eigelb und der Zellmasse abzuziehen⁴.
4. Sobald die Embryonen dechorioniert wurden, verwenden Sie eine Glasmikrokapillarpipette, um bis zu 25 intakte Embryonen in einen Immunchemie-Korb (IHC) zu übertragen und den IHC-Korb in eine 96-Well-Platte zu legen. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um das RO-Wasser aus jedem Brunnen abzusaugen.

3. Immunhistochemie mit 5-mC-spezifischen Antikörpern

1. Resuspendieren Sie die Embryonen in 500 μL Blockierpuffer (1x PBST + 2% Schafserum + 2 mg/ml Rinderserumalbumin) pro Vertiefung und wickeln Sie die Platte mit Parafilm und Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen. Bei 4 °C 4 h auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) inkubieren.
2. Entfernen Sie die Parafilmfolie und das Aluminium und verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um den Blockierpuffer aus jeder Vertiefung abzusaugen. Ersetzen Sie es durch 500 μL einer 1:100-Verdünnung eines monoklonalen Maus-Anti-5-mC-Antikörpers im Blockierungspuffer. Inkubation aller Embryonen mit primären Antikörpern mit Ausnahme einer Untergruppe von Vehikelkontrollembryonen, die mit dem Blockierungspuffer inkubiert werden, um Hintergrundgeräusche zu berücksichtigen. Achten Sie darauf, die Integrität der Embryonen nicht zu stören oder Embryonen während dieses Schrittes abzusaugen.
3. Wickeln Sie die Platte wieder in Parafilm und Aluminiumfolie ein und lassen Sie die Platte über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) inkubieren.
4. Am nächsten Tag entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie sie durch 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 1x PBST für 15 min pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler (100 U/min).
5. Ersetzen Sie 1x PBST durch eine 1:500 Verdünnung von Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörpern im Blockierpuffer und inkubieren Sie alle Embryonen mit dem sekundären Antikörper. Lassen Sie die Platte bei 4 °C über Nacht auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) inkubieren.
6. Am nächsten Tag den sekundären Antikörper entfernen und die Restlösung dreimal mit 1x PBST für 15 min pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) waschen.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier für bis zu 48 h gestoppt werden, wenn die IHC-Körbe in sauberen Brunnen gelagert werden, die mit 1x PBS gefüllt sind.
7. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um 1x PBST aus jedem Brunnen abzusaugen und den IHC-Korb in eine mit RO-Wasser gefüllte Glas-Petrischale zu stellen. Sortieren Sie unter einem Standard-Stereomikroskop zufällig intakte Embryonen in eine 96-Well-Platte, was zu einem Embryo pro Vertiefung führt.
8. Entfernen Sie mit einer 1-ml-Pipette das gesamte RO-Wasser aus den einzelnen Vertiefungen und ersetzen Sie es durch 200 μL 1x PBS. Zentrifugieren Sie die Platte für 3 min bei 1 x g.

4. Automatisierte Bildgebung von Embryonen innerhalb von 96-Well-Platten

1. Bilden Sie die Embryonen mit einem 2x-Objektiv unter Durchlicht und FITC mit einem High-Content-Screening-System (Table of Materials) ab.
   HINWEIS: Ein fluoreszierendes Bild jedes Embryos wurde automatisch mit der oben genannten Vergrößerung und einem FITC-Filter¹⁹ aufgenommen.
   1. Wählen Sie Autofokus , um sicherzustellen, dass sich der Fokus der Kamera auf der Unterseite der Platte befindet und um die untere Dicke versetzt ist.
   2. Wählen Sie eine FITC-Wellenlänge mit einer Belichtungsdauer von 100 ms und stellen Sie den Autofokus auf Laser mit Z-Offset ein. Beobachten und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Bildaufnahme in mehreren Vertiefungen, bevor Sie mit der Plattenaufnahme beginnen.
      HINWEIS: Das Gerät erfasst automatisch Bilder von allen ausgewählten Vertiefungen, die Embryonen enthalten. Eine 96-Well-Platte benötigte ca. 30 Minuten für die Bildaufnahme und Datenspeicherung. Für die Dauer des Aufnahmezeitraums wurde die Innentemperatur innerhalb des Bildgebungssystems auf RT gehalten.
2. Nach der Bildaufnahme führen Sie eine Datenanalyse mit dem High-Content-Screening-System und einem benutzerdefinierten automatisierten Bildanalyseverfahren durch. Wählen Sie jeden Embryo auf der 96-Well-Platte aus, der auf Gesamtfläche und integrierte Intensität der Fluoreszenz analysiert werden soll.
   HINWEIS: Die Analyse umfasste die Bereitstellung von Bildern, die Überlagerungen von Datenpunkten aus der Analyse enthielten.
3. Tabellieren Sie dann die Datenpunkte und exportieren Sie sie aus dem High-Content-Screening-System, indem Sie unter Measure die Option Open Data Log to a spreadsheet auswählen. Die Teile der Plattenerfassung und Datenanalyse sind in Abbildung 1 dargestellt.

5. Datenanalyse

1. Laden Sie die exportierte Tabelle in ein Computerprogramm hoch, in dem das Deployer-Paket (dplyr) verwendet wird, um Daten für jedes Bohrloch zu sortieren, zu summieren und nach Bohrlochnummer zu filtern. Das writexl-Paket wird dann verwendet, um die summierten Daten in eine Tabelle zu exportieren. Der 5mC-Programmcode wird in Supplemental File 1 angezeigt.

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Ergebnisse

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, festzustellen, ob eine Behandlung die relative Häufigkeit von 5-mC beeinflusst, indem die Gesamtfläche und relative Intensität der Fluoreszenz in fixierten und markierten Zebrafischembryonen bewertet wird. Nach Abschluss des Protokolls kann zunächst mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop festgestellt werden, ob der IHC für die gesamte Montage erfolgreich war. Wenn markierte Embryonen unter einem FITC- oder GFP-Filter beobachtet werden, wird ein positives Ergebnis durc...

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Diskussion

Während dieses Protokolls gibt es einige Schritte, die kritisch sind. Erstens ist es bei der Dechorionierung von Embryonen wichtig, die Nadel vom Gewebe des Embryos / Dottersacks / der Zellmasse wegzuzeigen, da diese Teile des sich entwickelnden Embryos sehr zerbrechlich und leicht zu durchstechen sind. Zweitens, wenn Sie markierte Embryonen in einzelne Vertiefungen übertragen, verwenden Sie eine Glaspipette, um Embryonen zu übertragen, da sie an einer Kunststoffpipette haften. Drittens ist bei der Durchführung von I...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML