Bozulmamış Zebra Balığı Embriyolarında Normal ve Anormal Sitozin Metilasyonunun Hızlı ve Verimli Mekansal Zamansal İzlenmesi

Özet

Bu yazıda, bozulmamış zebra balığı embriyolarında normal ve anormal sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli spatiotemporal izlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Sitozin metilasyonu, omurgalı türleri arasında oldukça korunmuştur ve epigenetik programlama ve kromatin durumunun önemli bir itici gücü olarak, erken embriyonik gelişimde kritik bir rol oynar. Enzimatik modifikasyonlar, aktif metilasyonunu ve sitozinin 5-metilsitozine (5-mC) demetilasyonunu ve ardından 5-mC'nin 5-hidroksimetilsitozin, 5-formilsitozin ve 5-karboksilyosin içine oksidasyonunu yönlendirir. Epigenetik yeniden programlama, in utero gelişim sırasında kritik bir dönemdir ve annenin kimyasallara maruz kalması, yavrulardaki epigenomu yeniden programlama potansiyeline sahiptir. Bu potansiyel olarak acil fenotipik sonuçlar, yetişkin hastalık duyarlılığı üzerinde uzun vadeli etkiler ve kalıtsal epigenetik işaretlerin nesiller arası etkileri gibi olumsuz sonuçlara neden olabilir. Bisülfit bazlı dizileme, araştırmacıların baz çifti çözünürlüğünde sitozin metilasyonunu sorgulamasına izin vermesine rağmen, dizileme tabanlı yaklaşımlar maliyet engelleyicidir ve bu nedenle, gelişimsel aşamalar boyunca sitozin metilasyonunu izleme yeteneğini, kimyasal başına çoklu konsantrasyonları ve tedavi başına embriyoları çoğaltma yeteneğini engeller. Otomatik in vivo görüntüleme, genetik manipülasyonlar, hızlı ex utero gelişim süresi ve embriyogenez sırasında yetiştiriciliğin kolaylığı nedeniyle, zebra balığı embriyoları, erken embriyonik gelişim sırasında olumsuz sonuçlara katkıda bulunan ksenobiyotik aracılı yolakları ortaya çıkarmak için fizyolojik olarak bozulmamış bir model olarak kullanılmaya devam etmektedir. Bu nedenle, ticari olarak temin edilebilen 5-mC'ye özgü antikorları kullanarak, istatistiksel analizden önce programlama dilini kullanarak bütüne monte immünohistokimya, otomatik yüksek içerikli görüntüleme ve verimli veri işlemeden yararlanarak bireysel, bozulmamış zebra balığı embriyolarında sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli mekansal zamansal izlenmesi için uygun maliyetli bir strateji açıklıyoruz. Mevcut bilgilere göre, bu yöntem, erken gelişim sırasında zebra balığı embriyolarında 5-mC seviyelerini yerinde olarak başarılı bir şekilde tespit eden ve ölçen ilk yöntemdir. Yöntem, hücre kütlesi içindeki DNA metilasyonunun tespit edilmesini sağlar ve ayrıca maternal-zigotik geçiş sırasında yumurta sarısı lokalize maternal mRNA'ların sitozin metilasyonunu tespit etme yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yöntem, epigenetik yeniden programlama sırasında sitozin metilasyonunu in situ olarak bozma potansiyeline sahip kimyasalların hızlı bir şekilde tanımlanması için yararlı olacaktır.

Giriş

Enzimatik modifikasyonlar, sitozinin aktif metilasyonunu ve demetilasyonunu 5-metilsitozin (5-mC) içine ve ardından 5-mC'nin 5-hidroksimetilsitozin, 5-formilsitozin ve 5-karboksilsitozin ^1,2'ye oksidasyonunu yönlendirir. Tris (1,3-dikloro-2-propil) fosfat (TDCIPP), Amerika Birleşik Devletleri'nde yaygın olarak kullanılan ve daha önce döllenme sonrası 0.75 saat sonra (hpf) erken gastrulasyona (6 hpf) kadar erken embriyonik maruziyeti takiben sitozin metilasyonunun yörüngesini değiştirdiği daha önce kanıtlanmış bir alev geciktiricidir 3,4,5,6,7,8 . Omurgalılarda, 5-mC ve modifiye edilmiş türevleri, erken embriyonik gelişimi düzenlemek için kritik öneme sahiptir⁹. Bir embriyonun döllenmesi, ebeveyn DNA'sının demetilasyonunu tetikler, bunu maternal mRNA bozunması, zigotik genom aktivasyonu ve zigotik genomun remetilasyonu^{izler 9}. Sitozin metilasyonunu kullanan biyolojik olarak ilgili süreçler arasında histon modifikasyonu, transkripsiyonel makinelerin işe alınması, RNA metilasyonu, epigenetik yeniden programlama ve kromatin yapısının belirlenmesi^10,11 sayılabilir. Sitozin metilasyonu, omurgalı türleri arasında da korunmaktadır ve anormal sitozin metilasyonunun bir organizmanın gelişiminin yörüngesini nasıl etkileyebileceğini anlamanın ve araştırmanın önemini vurgulamaktadır¹¹. Ayrıca, in utero gelişim maternal maruziyete duyarlıdır ve acil fenotipik sonuçlar, yetişkin hastalık duyarlılığı üzerinde uzun vadeli etkiler ve kalıtsal epigenetik işaretlerin nesiller arası etkileri gibi olumsuz sonuçlara neden olma potansiyeline sahiptir^12,13,14.

Sitozin-guanin çiftlerinin veya CpG adalarının uzun uzantıları, genom^15,16,17 boyunca sitozin metilasyonunun dinamiklerini karakterize etmeyi amaçlayan araştırmacıların birincil odakları olmuştur. Tüm genom bisülfit dizilimi, azaltılmış temsili bisülfit dizilimi ve bisülfit amplikon dizilimi gibi bisülfit bazlı stratejiler, baz çifti çözünürlüğünde sitozin metilasyonunu sorgulamak için altın standardı temsil eder. Bununla birlikte, dizilemeye dayalı yaklaşımlar maliyet engelleyicidir ve bu nedenle, gelişimsel aşamalarda sitozin metilasyonunu, kimyasal başına çoklu konsantrasyonları izleme ve tedavi başına embriyoları çoğaltma yeteneğini engeller. Ek olarak, dizileme tabanlı yaklaşımlar, gelişmekte olan bir embriyo içindeki potansiyel olarak etkilenen hücre tiplerini ve alanlarını anlamak için kritik olan mekansal lokalizasyon hakkında bilgi sağlamaz. Benzer şekilde, metilasyona bağımlı kısıtlama analizi, 5-mC enzime bağlı immünotahliller (ELISA'lar) ve 5-metil-2'-deoksisitidin (5-mC) sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) gibi küresel DNA metilasyon testleri, hücre veya doku homojenatlarına dayanır ve bu nedenle, bozulmamış örnekler^12,18 içinde sitozin metilasyonunun uzay ve zaman üzerindeki lokalizasyonunu ve büyüklüğünü izleme yeteneğini engeller.

Otomatik in vivo görüntüleme, genetik manipülasyonlar, hızlı ex utero gelişim süresi ve embriyogenez sırasında hayvancılığın kolaylığı nedeniyle, zebra balığı embriyoları, erken embriyonik gelişim sırasında olumsuz sonuçlara katkıda bulunan ksenobiyotik aracılı yolları ortaya çıkarmak için fizyolojik olarak bozulmamış modeller olarak yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir. Bu nedenle, 5-mC'ye özgü ticari olarak temin edilebilen antikorları kullanarak, aşağıdaki protokol, istatistiksel analizden önce programlama dilini kullanarak bütün-monte immünohistokimyadan (IHC), otomatik yüksek içerikli görüntülemeden ve verimli veri işlemeden yararlanarak bireysel, bozulmamış zebra balığı embriyolarında sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli bir şekilde mekansal zamansal izlenmesi için uygun maliyetli bir stratejiyi açıklamaktadır.

Mevcut bilgilere göre, bu yöntem bozulmamış zebra balığı embriyolarında 5-mC'yi izleyen ilk yöntemdir. Yöntem, hücre kütlesi içindeki DNA metilasyonunun tespit edilmesini sağlar ve ayrıca maternal-zigotik geçiş sırasında yumurta sarısı lokalize maternal mRNA'ların sitozin metilasyonunu tespit etme yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yöntem, epigenetik yeniden programlama sırasında sitozin metilasyonunu in situ olarak bozma potansiyeline sahip kimyasalların hızlı bir şekilde tanımlanması için yararlı olacaktır.

Protokol

Yetişkin yetiştiriciler, Riverside'daki Kaliforniya Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) onaylı bir hayvan kullanım protokolüne (#20180063) uygun olarak ele alındı ve tedavi edildi.

1. Zebra balığı embriyo toplama ve kimyasal maruziyet

1. Cinsel olarak olgun ve üreme açısından uygun yetişkin erkek ve dişi zebra balığı içeren tanklara tank içi üreme tuzakları ekleyin. 6 L tank başına en az 12 saat önce, tanklar içinde yumurtaların yaklaşık döllenme ve yumurtlama zamanı olan ~ 9: 00'da toplamadan en az 12 saat önce en az üç tuzak ekleyin.
2. Toplama sabahı taze bir maruz kalma çözeltisi hazırlayın. Maruz kalma çözeltisi, 5 mL'lik bir pipet kullanılarak ve 60 mm'lik cam Petri kabına 5,0 mL partikülsüz sistem suyu eklenerek hazırlanır.
3. Ardından, cam tabaktaki sistem suyuna 10 μL araç (dimetil sülfoksit veya DMSO) veya kimyasal stok çözeltisi aktarmak için 10 μL'lik bir cam mikrokapiler pipet kullanın.
4. Stok çözeltisinin dağılmasını sağlamak için cam Petri kabını döndürün. Cam Petri kabına 5,0 mL daha sistem suyu ekleyin. Pozlama çözeltisini homojenize etmek için cam Petri kabını döndürün.
5. Tedavi başına dört replikasyon elde etmek için her tedavi grubu için dördlü replikalarda tekrarlayın.
6. Maruz kalma çözeltileri hazırlandıktan sonra, buharlaşmayı en aza indirmek için cam tabakları cam kapaklarla kapatın.
7. Üreme tuzaklarını her tanktan çıkarırken, tanklardan çıkarmadan önce her tuzak içindeki suyun tanka boşalmasına dikkatlice izin verin. Tuzakların sağ tarafta kaldığından emin olun.
8. Üreme tuzaklarını laboratuvar lavabosuna aktarın ve ters ozmoz (RO) suyuyla doldurulmuş bir fışkırtma şişesi kullanarak, daha önce% 10 ağartıcıya batırılmış ve suyla durulanmış bir balık ağına durulayın. Tüm döküntüler temizlenene ve sadece temiz embriyolar kalana kadar embriyoları durulayın.
9. RO su dolu bir fışkırtma şişesi kullanarak embriyoları balık ağından 100 mm'lik plastik bir Petri kabına aktarın. Döllenme sonrası 0.75 saatte (hpf) 50 canlı embriyoyu rastgele sıralayın ve fazla RO suyunu çıkarın.
10. Bir mikrospatula kullanarak, sıralanmış embriyoları tedavi çözeltisine yerleştirin. Tüm embriyolar sabah 9:45'ten önce araç veya tedavi solüsyonu içinde olmalıdır. Embriyoların tedavi çözeltisi içinde eşit şekilde kaplandığından emin olmak için cam tabakları döndürün.
11. Her bir tedavi grubu için dört replika tabak (N = replika başına 50) ayarlandıktan sonra, cam kapağı maruz kalma kaplarının üzerine yerleştirin ve tüm bulaşıkları 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf veya 10 hpf olana kadar 28 ° C'de ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir inkübatöre aktarın.
12. Maruziyetin sonlandırılmasından en az 4 saat önce taze% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
    1. Ocakları 115 ° C'ye kadar açın, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 20 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (2 mL 10x PBS + 18 mL RO suyu) yapın ve 800 mg paraformaldehit ağırlığını boşaltın.
    2. Kimyasal bir duman davlumbazının içinde, 1x PBS çözeltisini 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın, 800 mg paraformaldehit ekleyin ve ardından 2 μL 10 N NaOH ekleyin. Şişenin içine bir termometre yerleştirin, şişeyi sıcak plakaya yerleştirin ve karıştırırken sıcaklığı izleyin.
    3. Sıcaklık 62-65 ° C'ye ulaştığında% 4 PFA'yı sıcak plakadan çıkarın ve oda sıcaklığına (RT) soğumasını bekleyin. %4 PFA'yı 4 °C'de saklayın.
13. Maruziyet süresi sona erdiğinde, embriyoları inkübatörden çıkarın ve tüm canlı embriyoları 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 1 mL pipet kullanarak artık maruz kalma solüsyonunu aspire edin. Herhangi bir embriyoyu aspire etmeyin.
14. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL soğutulmuş% 4 PFA ekleyin ve embriyoları birkaç kez ters çevirerek% 4 PFA'da karıştırın. Embriyoların bir gecede% 4 PFA'da sabitlenmesine izin verin.
    NOT: Embriyoların PFA'da 12 saatten daha uzun süre kalmasına izin verilmesi önerilmez.

2. Embriyoların dekoryonasyonu

1. Ertesi gün,% 4 PFA'yı aspire edin, embriyoları 1x PBS'de yeniden askıya alın ve 30 saniye boyunca hafifçe yukarı ve aşağı pipet yapın. Gerekirse, protokolü bu adımda durdurun ve embriyoları 4 ° C'de 48 saate kadar 1x PBS'de saklayın.
2. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, sabit embriyoları RO su dolu bir cam kaba dikkatlice aktarın ve 30 saniye boyunca yavaşça döndürün. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
3. Tüm embriyoları manuel olarak dekoriyonize etmek için standart bir stereomikroskop kullanarak 5.0x büyütme altında şırınga iğneleri kullanın. Koryonu delmek için iğne ucunu kullanarak bunu yapın ve yumurta sarısı ve hücre kütlesinden yavaşça soyun⁴.
4. Embriyolar dekoriyonize edildikten sonra, 25 adede kadar bozulmamış embriyoyu bir immünokimya (IHC) sepetine aktarmak için bir cam mikrokapiler pipet kullanın ve IHC sepetini 96 delikli bir plakaya yerleştirin. RO suyunu her kuyudan aspire etmek için 1 mL'lik bir pipet kullanın.

3. 5-mC-spesifik antikor kullanan immünohistokimya

1. Embriyoları kuyucuk başına 500 μL bloke edici tamponda (1x PBST +% 2 koyun serumu + 2 mg / mL sığır serum albümini) yeniden askıya alın ve plakayı ışıktan korumak için parafilm ve alüminyum folyo ile sarın. Yörüngesel çalkalayıcıda (100 rpm) 4 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.
2. Parafilm sargısını ve alüminyumu çıkarın ve bloke edici tamponu her bir kuyucuktan aspire etmek için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Bloke edici tampondaki monoklonal fare anti-5-mC antikorunun 1:100 seyreltilmesinin 500 μL'si ile değiştirin. Arka plan gürültüsünü hesaba katmak için bloke edici tamponla inkübe edilecek araç kontrol embriyolarının bir alt kümesi hariç tüm embriyoları birincil antikorlarla inkübe edin. Bu adımda embriyoların bütünlüğünü bozmamaya veya embriyoları aspire etmemeye dikkat edin.
3. Plakayı parafilm ve alüminyum folyoya yeniden sarın ve plakanın bir orbital çalkalayıcı (100 rpm) üzerinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe olmasına izin verin.
4. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini her bir kuyucuktan çıkarın ve 1x PBS +% 0.1 Ara-20 (1x PBST) ile değiştirin. Her bir kuyuyu, yörüngesel bir çalkalayıcıda (100 rpm) yıkama başına 15 dakika boyunca 1x PBST ile üç kez yıkayın.
5. Tamponu bloke etmek için 1x PBST'yi keçi anti-fare IgG antikorunun 1:500 seyreltilmesiyle değiştirin ve tüm embriyoları ikincil antikor ile inkübe edin. Plakanın bir orbital çalkalayıcıda (100 rpm) gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilmesine izin verin.
6. Ertesi gün, ikincil antikoru çıkarın ve artık çözeltiyi orbital çalkalayıcıda (100 rpm) yıkama başına 15 dakika boyunca 1x PBST ile üç kez yıkayın.
   NOT: IHC sepetleri 1x PBS ile doldurulmuş temiz kuyucuklarda saklanırsa, protokol burada 48 saate kadar durdurulabilir.
7. Her bir kuyucuktan 1x PBST'yi aspire etmek için 1 mL'lik bir pipet kullanın ve IHC sepetini RO suyuyla dolu bir cam Petri kabına yerleştirin. Standart bir stereomikroskop altında, bozulmamış embriyoları rastgele 96 kuyucuklu bir plakaya ayırın ve kuyu başına bir embriyo elde edin.
8. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, tüm RO suyunu ayrı ayrı kuyulardan çıkarın ve 200 μL 1x PBS ile değiştirin. Plakayı 1 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.

4. 96 kuyucuklu plakalar içindeki embriyoların otomatik görüntülenmesi

1. Yüksek içerikli bir tarama sistemi (Malzeme Tablosu) kullanarak embriyoları iletilen ışık ve FITC altında 2x objektifle görüntüleyin.
   NOT: Her embriyonun floresan görüntüsü, yukarıda belirtilen büyütme ve bir FITC filtresi¹⁹ kullanılarak otomatik olarak yakalanmıştır.
   1. Fotoğraf makinesinin netlemesinin plakanın altında olduğundan ve alt kalınlıkla dengelendiğinden emin olmak için Otomatik Netleme'yi seçin.
   2. Pozlama süresi 100 ms olan bir FITC dalga boyu seçin ve Otomatik Netlemeyi Z-ofsetli lazere ayarlayın. Plaka alımına başlamadan önce birkaç kuyuda uygun görüntü alımını gözlemleyin ve onaylayın.
      NOT: Cihaz, embriyo içeren tüm seçilmiş kuyulardan görüntüleri otomatik olarak alır. 96 kuyulu bir plaka, görüntü toplama ve veri depolama için yaklaşık 30 dakika gerektiriyordu. Edinme süresi boyunca, görüntüleme sistemindeki iç sıcaklık RT'de tutuldu.
2. Görüntü alımını takiben, yüksek içerikli tarama sistemini ve özel bir otomatik görüntü analizi prosedürünü kullanarak veri analizi gerçekleştirin. Toplam alan ve entegre floresan yoğunluğu için analiz edilecek 96 delikli plakadaki her embriyoyu seçin.
   NOT: Analiz, analizden veri noktalarının bindirmelerini içeren görüntüler sağlamayı içeriyordu.
3. Ardından, veri noktalarını tablolaştırın ve Ölçüm'ün altına gidip Veri Günlüğünü Aç'ı seçerek bunları bir elektronik tabloya aktararak bunları yüksek içerikli tarama sisteminden dışa aktarın. Plaka toplama ve veri analizi bölümleri Şekil 1'de gösterilmiştir.

5. Veri analizi

1. Dışa aktarılan elektronik tabloyu, dağıtıcı (dplyr) paketinin her bir kuyu için verileri sıralamak, toplamak ve kuyu numarasına göre filtrelemek için kullanıldığı bir bilgisayar programına yükleyin. Writexl paketi daha sonra toplanan verileri bir e-tabloya dışa aktarmak için kullanılır. 5mC program kodu Ek Dosya 1'de gösterilmiştir.

Sonuçlar

Bu protokolün genel amacı, sabit ve etiketli zebra balığı embriyolarındaki floresanın toplam alanını ve göreceli yoğunluğunu değerlendirerek bir tedavinin 5-mC'nin göreceli bolluğunu etkileyip etkilemediğini belirlemektir. Protokolü tamamladıktan sonra, ilk önce tüm montajlı IHC'nin başarılı olup olmadığını belirlemek için bir floresan stereomikroskop kullanılabilir. Etiketlenmiş embriyolar bir FITC veya GFP filtresi altında gözlendiğinde, pozitif bir sonuç embriyo içinde pozitif bir F...

Tartışmalar

Bu protokol sırasında, kritik olan birkaç adım vardır. İlk olarak, embriyoları dekoryonize ederken, gelişmekte olan embriyonun bu kısımları çok kırılgan ve delinmesi kolay olduğundan, iğneyi embriyo / yumurta sarısı kesesi / hücre kütlesinin dokusundan uzağa yönlendirmek önemlidir. İkincisi, etiketli embriyoları bireysel kuyucuklara aktarırken, plastik bir pipete yapışacakları için embriyoları transfer etmek için bir cam pipet kullanın. Üçüncüsü, tam montajlı IHC yaparken, plakanın...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML