Recolección de espermatozoides y análisis de espermatozoides asistido por computadora en el modelo teleósteo japonés Medaka (Oryzias latipes)

Resumen

Este artículo describe dos métodos rápidos y eficientes para recolectar esperma del pequeño pez modelo medaka (Oryzias latipes), así como un protocolo para evaluar de manera confiable la calidad del esperma utilizando el análisis de esperma asistido por computadora (CASA).

Resumen

La medaka japonesa (Oryzias latipes) es un pez teleósteos y un modelo emergente de vertebrados para la investigación en ecotoxicología, desarrollo, genética y fisiología. Medaka también se utiliza ampliamente para investigar la reproducción de vertebrados, que es una función biológica esencial, ya que permite que una especie se perpetúe. La calidad del esperma es un indicador importante de la fertilidad masculina y, por lo tanto, del éxito de la reproducción. Las técnicas para extraer espermatozoides y el análisis de espermatozoides están bien documentadas para muchas especies, incluido el pez teleósteo. La recolección de esperma es relativamente simple en peces más grandes, pero puede ser más complicada en peces modelo pequeños, ya que producen menos espermatozoides y son más delicados. Este artículo, por lo tanto, describe dos métodos de recolección de esperma en el pequeño pez modelo, la medaka japonesa: disección de testículos y masaje abdominal. Este documento demuestra que ambos enfoques son factibles para medaka y muestra que el masaje abdominal se puede realizar un número repetido de veces a medida que los peces se recuperan rápidamente del procedimiento. Este artículo también describe un protocolo para el análisis de espermatozoides asistido por computadora en medaka para evaluar objetivamente varios indicadores importantes de la calidad del esperma medaka (motilidad, progresividad, duración de la motilidad, concentración relativa). Estos procedimientos, especificados para este útil modelo de teleósteos pequeños, mejorarán en gran medida la comprensión de los factores ambientales, fisiológicos y genéticos que influyen en la fertilidad en los machos vertebrados.

Introducción

La medaka japonesa es un pequeño pez teleósteos de agua dulce nativo del este de Asia. Medaka se ha convertido en un excelente sistema modelo de vertebrados para ecotoxicología, genética del desarrollo, genómica y biología evolutiva y estudios de fisiología ^1,2. Al igual que el popular pez cebra, son relativamente fáciles de criar y altamente resistentes a muchas enfermedades comunes de los peces ^1,2. Hay varias ventajas de usar medaka como modelo, incluyendo un corto tiempo de generación, embriones transparentes ^1,2<....

Protocolo

Toda la experimentación y el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones sobre el bienestar animal experimental en la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida (NMBU). Los experimentos se realizaron utilizando medaka japonesa adulta (6-9 meses de edad) macho (cepa Hd-rR) criada en NMBU (Ås, Noruega). Los métodos también se probaron brevemente en medaka japonesa macho de 9 meses de edad (cepa CAB) criada en el Instituto Nacional de Investigación para la Agricultura, la Alimentación y el Medio Ambiente (INRAE, Rennes, Francia).

1. Preparación del instrumento y de la solución

1. Preparar so....

Resultados

Tipo de datos obtenidos
El análisis de la motilidad de los espermatozoides del software SCA Evolution proporciona datos sobre la motilidad (porcentaje de espermatozoides móviles e inmóviles), así como la progresividad (porcentaje de espermatozoides progresivos y no progresivos) y la velocidad (porcentaje de espermatozoides de movimiento rápido, medio y lento). También combina progresividad y velocidad (progresiva rápida, progresiva media, no progresiva). Estas etiquetas se basan en mediciones (.......

Discusión

La osmolalidad es un factor importante en la activación de los espermatozoides de peces^36,37. Generalmente, los espermatozoides son inmóviles en los testículos y se vuelven móviles en medios que son hiperosmóticos en relación con el líquido seminal para los peces marinos, e hipoosmóticos en relación con el líquido seminal para los peces de agua dulce³⁷. Al igual que en la sangre, el plasma seminal en los peces de agua dulce es t?.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040