JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, küçük model balık medakasından (Oryzias latipes) sperm toplamak için iki hızlı ve etkili yöntemin yanı sıra, bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) kullanarak sperm kalitesini güvenilir bir şekilde değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Japon medaka (Oryzias latipes) bir teleost balığı ve ekotoksikoloji, gelişimsel, genetik ve fizyoloji araştırmaları için ortaya çıkan bir omurgalı modelidir. Medaka ayrıca, bir türün devam etmesine izin verdiği için önemli bir biyolojik işlev olan omurgalı üremesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sperm kalitesi, erkek doğurganlığının ve dolayısıyla üreme başarısının önemli bir göstergesidir. Sperm ve sperm analizi çıkarma teknikleri, teleost balıkları da dahil olmak üzere birçok tür için iyi belgelenmiştir. Sperm toplamak büyük balıklarda nispeten basittir, ancak daha az sperm ürettikleri ve daha hassas oldukları için küçük model balıklarda daha karmaşık olabilir. Bu nedenle, bu makalede, küçük model balıklarda, Japon medakasında iki sperm toplama yöntemi açıklanmaktadır: testisler diseksiyonu ve karın masajı. Bu makale, her iki yaklaşımın da medaka için uygulanabilir olduğunu ve balıklar prosedürden hızla iyileştikçe karın masajının tekrarlanan sayıda yapılabileceğini göstermektedir. Bu makalede ayrıca, medakada sperm kalitesinin birkaç önemli göstergesini (motilite, progresiflik, motilitenin süresi, bağıl konsantrasyon) objektif olarak değerlendirmek için medakada bilgisayar destekli sperm analizi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu yararlı küçük teleost modeli için belirtilen bu prosedürler, omurgalı erkeklerde doğurganlığı etkileyen çevresel, fizyolojik ve genetik faktörlerin anlaşılmasını büyük ölçüde artıracaktır.

Giriş

Japon medaka, Doğu Asya'ya özgü küçük, yumurtlayan bir tatlı su teleost balığıdır. Medaka, ekotoksikoloji, gelişimsel genetik, genomik ve evrimsel biyoloji ve fizyoloji çalışmaları için mükemmel bir omurgalı model sistemi haline gelmiştir 1,2. Popüler zebra balıklarına benzer şekilde, üremeleri nispeten kolaydır ve birçok yaygın balık hastalığına karşı oldukça dirençlidirler 1,2. Medaka'yı model olarak kullanmanın kısa bir üretim süresi, şeffaf embriyolar 1,2 ve sıralı bir genom3 dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Zebra balıklarının aksine, medaka, cinsiyet belirleyici bir gen 4'ün yanı sıra yüksek sıcaklık (4-40 ° C'den) ve tuzluluk (euryhaline türleri) toleransınasahiptir 5. Ayrıca, birçok genetik ve anatomik aracın yanı sıra 6,7,8,9,10,11,12 protokolleri, biyolojisinin incelenmesini kolaylaştırmak için Medaka'da geliştirilmiştir.

Üreme, bir türün devam etmesine izin verdiği için önemli bir fizyolojik işlevdir. Omurgalı üremesi, kadınlarda oosit üretimi ve erkeklerde sperm üretimi de dahil olmak üzere çok sayıda hassas şekilde düzenlenmiş olay gerektirir. Sperm, yüksek kaliteli bir ürünün teslimini garanti altına almak için bir dizi kontrol noktasının bulunduğu karmaşık spermatogenez süreci yoluyla üretilen benzersiz hücrelerdir13. Gamet kalitesi, döllenme başarısı ve larva sağkalımı üzerindeki etkisi nedeniyle su ürünleri yetiştiriciliği ve balık popülasyonu çalışmalarında odak noktası haline gelmiştir. Bu nedenle sperm kalitesi, omurgalılarda erkek fertilitesinin önemli bir göstergesidir.

Balık sperm kalitesini değerlendirmek için üç yararlı faktör hareketlilik, progresiflik ve uzun ömürlüdür. Yüzde motilitesi ve progresif motilite, sperm kalitesinin yaygın göstergeleridir, çünkü progresif hareket için gereklidir ve döllenme başarısı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir14,15. Hareket süresi de balıklarda önemli bir göstergedir, çünkü sperm çoğu teleost türünde 2 dakikadan daha az bir süre boyunca tamamen hareketli kalır ve spermin yörüngesi genellikle memelilerden daha az lineerdir15. Bununla birlikte, geçmişte sperm motilitesini değerlendiren birçok çalışma, sperm analizinde öznel veya yarı kantitatif yöntemlere dayanıyordu15,16. Örneğin, medakadaki sperm hareketliliği geçmişte mikroskop altında görsel olarak tahmin edilmiştir17. Ayrıca sperm hareketini kaydederek ve çerçeveleri birleştirmek ve yüzme yolunu ve hızını ölçmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak tahmin edilmiştir18,19,20. Bu tür yaklaşımlar genellikle sağlamlıktan yoksundur ve analizi yapan kişiye göre farklı sonuçlar verir15,21.

Bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) başlangıçta memeliler için geliştirilmiştir. CASA, hızı ve yörüngeyi otomatik bir şekilde kaydederek ve ölçerek sperm kalitesini değerlendirmek için hızlı bir nicel yöntemdir15. Balıklarda, çeşitli su kirleticilerinin sperm kalitesi üzerindeki etkilerini izlemek, kuluçka stokunu iyileştirmek, kriyoprezervasyon ve depolama verimliliğini artırmak ve döllenme koşullarını optimize etmek için ilginç progenitörleri tanımlamak için farklı türlerde kullanılmıştır15. Bu nedenle, farklı omurgalı türlerinde sperm kalitesini güvenilir bir şekilde değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, balıklar arasındaki üreme stratejilerindeki önemli çeşitlilik nedeniyle, teleost balıklarının spermleri memelilerinkinden ve bir balık türünden diğerine farklılık gösterir. Gametleri suya bırakarak yumurtaları öncelikle dışarıdan dölleyen teleost balıkları, dahili olarak döllenen ve bu nedenle sudaki seyreltmeyi telafi etmek zorunda kalmayan, ancak daha viskoz sıvılara dayanmak zorunda kalan memelilerin aksine, akrozomsuz yapıda nispeten basit olan oldukça konsantre spermlere sahiptir14. Ek olarak, çoğu balıktan elde edilen sperm hızla hareket eder, ancak aktivasyondan sonra 2 dakikadan daha kısa bir süre boyunca tamamen hareketlidir, ancak birkaç istisna vardır15,22. Çoğu balıkta hareketlilik hızla azalabileceğinden, balıklar için bir sperm analiz protokolü belirlenirken aktivasyondan sonra analizin zamanlamasına çok dikkat edilmelidir.

Üreme, biyolojide teleostların ve medakaların model organizmalar olarak yaygın olarak kullanıldığı alanlardan biridir. Gerçekten de, medaka erkekleri,eş koruma 23,24 gibi ilginç üreme ve sosyal davranışlar göstermektedir. Ek olarak, bu türdeki üremenin nöroendokrin kontrolünü incelemek için birkaç transgenik çizgi vardır25,26,27. Büyük balıklarda nispeten basit olan bir prosedür olan sperm örneklemesi, daha az sperm ürettikleri ve daha hassas oldukları için küçük model balıklarda daha karmaşık olabilir. Bu nedenle medakada sperm örneklemesi içeren çalışmaların çoğunda disseke testislerin ezilmesi suretiyle süt (balık menisi) ekstrakte edilmesi 17,28,29,30. Birkaç çalışma, sütü doğrudan aktive edici ortama 18,19,20 olarak ifade etmek için modifiye edilmiş bir karın masajı da kullanmaktadır; Bununla birlikte, bu yöntemle, ekstrakte edilen sütün miktarını ve rengini görselleştirmek zordur. Zebra balığında, karın masajı, hemen kılcal bir tüp31,32,33'te toplanan sütü ifade etmek için yaygın olarak kullanılır. Bu yöntem, süt hacminin tahmin edilmesini ve sperm kalitesinin hızlı ve basit bir göstergesi olan ejakülat renginin gözlemlenmesini sağlar32,33. Bu nedenle, medaka için sperm toplama ve analizi için açık ve iyi tanımlanmış bir protokol yoktur.

Bu nedenle bu makalede, küçük model balıklar Japon medakasında sperm toplamanın iki yöntemi açıklanmaktadır: testisler diseksiyonu ve kılcal tüplerle karın masajı. Her iki yaklaşımın da medaka için uygulanabilir olduğunu ve balıklar işlemden hızla iyileştikçe karın masajının tekrarlanan sayıda yapılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, medaka'da bilgisayar destekli sperm analizi için medaka sperm kalitesinin birkaç önemli göstergesini (hareketlilik, progresiflik, uzun ömürlülük ve göreceli sperm konsantrasyonu) güvenilir bir şekilde ölçmek için bir protokol açıklar. Bu yararlı küçük teleost modeli için belirtilen bu prosedürler, omurgalı erkeklerde doğurganlığı etkileyen çevresel, fizyolojik ve genetik faktörlerin anlaşılmasını büyük ölçüde artıracaktır.

Protokol

Tüm deneyler ve hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki (NMBU) deneysel hayvan refahı ile ilgili tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirildi. Deneyler, NMBU'da (Ås, Norveç) yetiştirilen yetişkin (6-9 aylık) erkek Japon medaka (Hd-rR suşu) kullanılarak gerçekleştirildi. Yöntemler ayrıca Ulusal Tarım, Gıda ve Çevre Araştırma Enstitüsü'nde (INRAE, Rennes, Fransa) yetiştirilen 9 aylık erkek Japon medakasında (CAB suşu) kısaca test edildi.

1. Cihaz ve çözelti hazırlama

  1. Anestezik stok çözeltisi hazırlayın (% 0.6 Trikain).
    1. 0.6 g Trikain (MS-222) 100 mL'lik 10x Fosfat Tampon Salin (PBS) içinde seyreltin.
    2. Aliquot 2 mL anestezik stok çözeltisi 50 2 mL plastik tüplere ve anestezi veya ötenazi için kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın.
  2. Geri kazanım suyu hazırlayın (% 0.9 sodyum klorür [NaCl] çözeltisi).
    1. 3 L akvaryum suyuna 27 g NaCl ekleyin.
    2. Çözeltiyi kullanana kadar oda sıcaklığında (RT) saklayın.
  3. Gerekirse aktivasyon ortamını ayarlayın (Hank'in dengeli tuz çözeltisi [HBSS]).
    NOT: HBSS ticari olarak satın alınabilir veya laboratuvarda yapılabilir (Malzeme Tablosu).
    1. Bir pH metre kullanarak HBSS'nin pH'ını ölçün. Gerekirse hidroklorik asit veya sodyum hidroksit kullanarak pH'ı ayarlayın, böylece nihai pH 7.1-7.3 olur.
    2. HBSS'nin ozmolalitesini gelecekteki raporlama için bir ozmometre kullanarak ölçün.
      NOT: Ticari ürün yelpazesi 266-294 mOsmol/kg'dır; Bu çalışmada ozmolalite 287 mOsmol/kg idi. İstenirse ozmolaliteyi azaltmak için damıtılmış su ile seyreltilebilir, ancak 150-300 mOsmol / kg HBSS'de medaka sperminin aktivasyonunda büyük bir fark olmadığı için bu gerekli değildir.
    3. Çözümü kullanana kadar RT'de saklayın.
  4. Tutma süngerini hazırlayın.
    1. Petri kabına sıkıca oturması için yumuşak bir sünger kesin.
    2. Süngerin ortasında, balıkları alacak kadar uzun (3-4 cm) ve yaklaşık 1 cm derinliğinde (Şekil 1A) düz bir çizgi kesin. Süngerdeki bu yarık, kloakayı açığa çıkarmak için balık ventral tarafını yukarı doğru tutacaktır.

2. Sperm toplama

NOT: Sperm toplanması iki farklı yöntemle sağlanabilir: karın masajı veya testis diseksiyonu.

  1. Karın masajı ile sperm toplama
    1. 100 mL'lik bir cam kapta 38 mL akvaryum suyunda bir tüp Trikain stoğunu (% 0.6) seyrelterek% 0.03 anestezik çözelti hazırlayın.
    2. Künt uçlu pürüzsüz forseps ve 10 μL tek kullanımlık kalibre edilmiş cam mikropipet ve aspiratör tüpü tertibatı dahil olmak üzere aletleri hazırlayın (Şekil 1A). Adım 1.4'te hazırlanan tutma süngerini anestezik solüsyonla nemlendirin.
    3. Anında analiz için 36 μL aktive edici çözelti içeren tüpler hazırlayın. Aktive edici çözeltiyi en az 5 dakika boyunca 27 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosunda veya inkübatörde önceden ısıtın.
      NOT: Her ne kadar numuneler tek tek balıklardan analiz edilebilse de, birden fazla erkekten alınan numunelerin aynı aktive edici çözeltide toplanmasıyla bireysel varyasyon azaltılabilir. Birden fazla balıktan alınan örnekleri bir araya getirirken, balık başına 36 μL aktive edici çözelti kullanın. Bu seyreltmenin, kullanılan medakanın gerilme veya yetiştirme koşullarına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir, çünkü bu faktörler sperm konsantrasyonunu ve hacmini etkileyebilir. CASA programı, konsantrasyonun spermi tanımlamak için çok yüksek olup olmadığını gösterecektir.
    4. Balıkları 30-90 sn için anestezik çözeltiye koyarak anestezi yapın.
      NOT: Anestezi süresi, balığın büyüklüğüne göre değiştiği için uyarlanmalıdır. Balığın tamamen uyuşturulmasını sağlamak için, kaudal pedinkülü forseps ile hafifçe sıkıştırın. Balık tepki vermezse, masaj başlatılabilir.
    5. Balıkları anestezik solüsyondan çıkarın ve bir kağıt havlu kullanın veya balığın karnını kurutmak için hafifçe silin. Balıkları nemli tutan sünger ventral tarafının oluğuna yerleştirin, böylece solungaçları süngerdeki anestezik çözeltiye maruz kalır (Şekil 1B).
    6. Kloak etrafındaki alan ıslaksa, balığın alt tarafını tek kullanımlık bir mendil ile hafifçe kurulayın.
    7. Balıkları disseksiyon mikroskobu altında tutma süngerine yerleştirin ve mikropipeti balığın kloakına tutturulmuş bir aspiratör tüpü ile yerleştirin (Şekil 1C).
    8. Balığın karnına, künt uçlu pürüzsüz forsepslerle hafifçe sıkarak masaj yapın ve aynı anda dışarı atılan sütü pipete toplamak için emerken (Şekil 1D).
    9. Balıkları süngerden geri kazanım suyuna bırakın. Akvaryum sistemine geri göndermeden önce çözeltide en az 15 dakika iyileşmelerine izin verin.
    10. Süt, aspiratör tüp tertibatı üzerinde emerek ve üfleyerek önceden ısıtılmış aktivasyon çözeltisi ve pipeti ile hazırlanmış bir tüpe birkaç kez yukarı ve aşağı aktarın.
    11. Seyreltilmiş spermi, analizden önce tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin.
      NOT: En iyi sonuçlar için, etkinleştirmeden hemen sonra numuneleri analiz edin (örneğin, 5 sn). Medaka'da, sperm birkaç saat boyunca hareketli kaldığı için gerekirse analiz gecikebilir, ancak motilitesi zamanla azaldıkça zaman örnekler arasında tutarlı kalmalıdır.
  2. Testislerin diseksiyonu ile sperm toplanması
    1. 100 mL'lik bir cam kapta 26 mL akvaryum suyunda iki tüp Trikain stoğunu (% 0.6) seyrelterek% 0.08 ötenazi çözeltisi hazırlayın.
    2. Künt ve ince forseps ve küçük diseksiyon makasları dahil olmak üzere diseksiyon aletleri hazırlayın (Şekil 1E).
    3. Anında analiz için her numune için 120 μL aktive edici çözelti içeren bir tüp hazırlayın. Aktive edici çözeltiyi en az 5 dakika boyunca 27 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosunda veya inkübatörde önceden ısıtın.
      NOT: Her ne kadar numuneler tek tek balıklardan analiz edilebilse de, birden fazla erkekten alınan numunelerin aynı aktive edici çözeltide toplanmasıyla bireysel varyasyon azaltılabilir. Birden fazla balıktan alınan numunelerin havuzlanması için, balık başına 120 μL aktive edici çözelti kullanın. Bu seyreltmenin, kullanılan medakanın gerilme veya yetiştirme koşullarına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir, çünkü bu faktörler sperm konsantrasyonunu ve hacmini etkileyebilir. CASA programı, konsantrasyonun spermi tanımlamak için çok yüksek olup olmadığını gösterecektir.
    4. Balıkları 30-90 s'de% 0.08 anestezik çözeltiye koyarak ötenazileştirin.
      NOT: Süre, balığın büyüklüğüne bağlıdır. Balığın ötenazi yapılmasını sağlamak için, operkulum hareketlerinin durmasını bekleyin. Balık, forsepslerin dokunuşuna tepki vermemelidir.
    5. Balıkları ötenazi çözeltisinden çıkarın ve balıkları bir kağıt havluyla hafifçe kurutun veya hafifçe silin.
      NOT: Bu adımda, balıklar daha sonra gonadosomatik indeksi (GSI, gonadal ağırlık / vücut ağırlığı) hesaplamak için tartılabilir.
    6. Balıkları, sol yanal tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 1F).
    7. Küçük diseksiyon makası kullanarak, kloaktan dorsal olarak bir flep kesin ve daha sonra iç organları açığa çıkarmak için kaburgalardan solungaçlara doğru (Şekil 1G).
    8. Testisleri bulun, her iki uçtaki eki ince forsepslerle kesin ve testisleri çıkarın (Şekil 1H).
      NOT: GSI'yı hesaplamak için, testisler bu adımda tartılabilir. Dokunun kurumasını önlemek için hızlı çalışın.
    9. Testisleri, önceden ısıtılmış aktivasyon çözeltisi ile hazırlanmış bir tüpe aktarın.
    10. Spermi serbest bırakmak için testisleri tüpün yan tarafına karşı birkaç kez ezmek için forseps kullanın. Sperm salınımı genellikle görselleştirilebilir ve çözeltiyi biraz bulanık hale getirir.
    11. Seyreltilmiş spermi, analizden önce tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin.
      NOT: En iyi sonuçlar için, etkinleştirmeden hemen sonra numuneleri analiz edin (örneğin, 5 sn). Medaka'da, sperm birkaç saat boyunca hareketli kaldığı için gerekirse analiz gecikebilir, ancak motilitesi zamanla azaldıkça zaman örnekler arasında tutarlı kalmalıdır.

figure-protocol-8485
Şekil 1: Karın masajı (A-D) ve testisler diseksiyonu (E-H) ile süt toplanması. (A) Karın masajı için aletler: aspiratör tüp tertibatı ile sünger, künt pürüzsüz forseps ve 10 μL tek kullanımlık kalibre edilmiş cam mikropipet tutma; (B) Sünger ve kloakta anesteziye maruz kalan solungaçlar yukarı bakacak şekilde, tutma süngerinde balığın konumu; (C) Künt pürüzsüz forsepslerin karın ve mikropipet üzerinde kloaca karşı pozisyonu; (D) Nazik masaj ve emme işleminden sonra mikropipette süt. (E) Testislerin diseksiyonu için aletler: künt forsepsler, ince forsepsler ve küçük diseksiyon makasları; (F) Testislerin diseksiyonu için balığın konumu; (G) İç organların yanal görünümü; (H) Her iki uçtaki ataşmanı ince forsepslerle keserek testisleri çıkarın. Ölçek çubuğu: 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. CASA sistemi ile sperm analizi

  1. CASA sistemi (SCA Evolution), yeşil bir filtre ve faz kontrastlı 10x objektif kullanılarak mikroskopla kılavuza göre kurulmalıdır.
  2. Tek kullanımlık 20 μm sayım odası kızaklarını, bir ısıtma plakası üzerinde veya en az 5 dakika boyunca 27 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde önceden ısıtarak hazırlayın.
  3. Sperm analiz yazılımını açın ve hareketlilik modülünü seçin.
  4. Medakanın yapılandırmasını Şekil 2B'de gösterildiği gibi ayarlayın.
  5. Önceden ısıtılmış tek kullanımlık 20 μm sayım odası sürgüsünü, 27 ° C'ye ayarlanmış ısıtılmış bir aşamaya mikroskop altına yerleştirin.
  6. Numuneyi, odayı aşırı doldurmadan doldurana kadar slayttaki hazneye pipetleyin. Odanın girişindeki fazla numuneleri pamuklu bir uçla dikkatlice silin veya yüzen hücreleri önlemek için hafifçe silin.
  7. Örneğe mikroskop altında bakmak için Analiz Et'i seçin.
    NOT: Mikroskop simgesi kırmızıysa, programın spermi doğru bir şekilde izlemesi için mikroskop aydınlatmasının ayarlanması gerekir. Mikroskobun parlaklığını ayarlayın, böylece spermin kuyruk hareketi açıkça görülür. Simge mavi olmalıdır.
  8. Mikroskobun odaklandığından emin olun ve spermi sahaya kaydetmek için tekrar Analiz Et'i seçin. Slaytı, numunenin yeni bir alanı çerçevede olacak şekilde hareket ettirin ve 3-5 farklı görüş alanı yakalamak için bu işlemi tekrarlayın. Hava kabarcıkları, hücre kütleleri veya yapıtlar içeren alanlardan kaçının.
  9. Sonuçları görüntülemek için Sonuçlar'ı seçin.
    NOT: Sonuç sayfasındaki alanlar kırmızı renkle özetlenmişse, konsantrasyon veya hareketlilik bakımından çok fazla değişiklik gösteren alanları silmek için sistemin istemlerini izleyin.
  10. Tek tek alanın sonuçlarını görüntülemek veya yanlış etiketlenmiş veya izlenmemiş spermatozoa olup olmadığını manuel olarak kontrol etmek için bir alana çift tıklayın. Gerekirse hareketliliği yeniden etiketlemek için bireysel spermatozoaya sağ tıklayın (Şekil 2A).

figure-protocol-11932
Şekil 2: SCA Evolution yazılımı ekran görüntüsü . (A) Bir alan için sperm izleme sonuçları. Alan verilerini sağ tarafta görüntüleyin ve tek tek verileri görüntülemek için spermatozoaya çift tıklayın; (B) Yapılandırma menüsü açık olan tüm alanlar için sonuç özeti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Elde edilen verilerin türü
SCA Evolution yazılımından sperm motilitesi analizi, motilitenin (hareketli ve hareketsiz sperm yüzdesi), progresivites (ilerleyici ve progresif olmayan sperm yüzdesi) ve hız (hızlı, orta ve yavaş hareket eden sperm yüzdesi) hakkında veri sağlar. Aynı zamanda ilericiliği ve hızı birleştirir (hızlı ilerici, orta ilerici, ilerici olmayan). Bu etiketler, program tarafından sağlanan spermatozoon hareketinin ölçümlerine (Şekil 3A

Tartışmalar

Ozmolalite, balık sperminin aktivasyonunda önemli bir faktördür36,37. Genel olarak, sperm testislerde hareketsizdir ve deniz balıkları için seminal sıvıya göre hiperozmotik ve tatlı su balıkları için seminal sıvıya göre hipo-ozmotik olan ortamlarda hareketli hale gelir37. Kana benzer şekilde, tatlı su balıklarında seminal plazma tipik olarak deniz balıklarından daha düşüktür (400 mOsmol / kg'a kıyasla yaklaşık...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi ve ABD Fulbright programı tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, balık tesisi bakımı için NMBU'dan Anthony Peltier ve Lourdes Carreon G Tan'a ve INRAE'deki (Fransa) ISC LPGP'den Guillaume Gourmelin'e bu yöntemleri daha fazla test etmek için balık ve laboratuvar alanı sağladıkları için teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubesAxygenMCT-150-CAny standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assemblyDrummond2-000-010
10x objective with phase contrastNikonMRP90100
2 mL tubesAxygenMCT-200-c-sAny standard brand can be used
Blunt forcepsFine Science Tools11000-12
Blunt smooth forcepsMilliporeXX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slideMicroptic20.2.25 Leja 2 chamber slides
Dissecting microscopeOlympusSZX7Any standard brand can be used
Fine forcepsFine Science Tools11253-20
HBSSSigmaaldrichH8264-1L
Holding spongeself-made
Inverted microscopeNikonEclipse Ts2R
SCA EvolutionMicroptic
Small dissecting scissorsFine Science Tools14090-09
Sodium Chloride (NaCl)SigmaaldrichS9888
Tabletop vortexLabnetC1301B
TricaineSigmaaldrichA5040

Referanslar

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 188gonadlarsperms ttestismedakabal kremecasa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır