Coleta de espermatozoides e análise de espermatozoides assistida por computador no modelo Teleost japonês Medaka (Oryzias latipes)

Resumo

Este artigo descreve dois métodos rápidos e eficientes para a coleta de espermatozoides do pequeno modelo de medaka de peixe (Oryzias latipes), bem como um protocolo para avaliar de forma confiável a qualidade do esperma usando a análise de espermatozoides assistida por computador (CASA).

Resumo

A medaka japonesa (Oryzias latipes) é um peixe teleósteo e um modelo emergente de vertebrados para pesquisa em ecotoxicologia, desenvolvimento, genética e fisiologia. Medaka também é usado extensivamente para investigar a reprodução de vertebrados, que é uma função biológica essencial, pois permite que uma espécie se perpetue. A qualidade do esperma é um importante indicador da fertilidade masculina e, portanto, do sucesso da reprodução. Técnicas para extração de espermatozoides e análise de espermatozoides estão bem documentadas para muitas espécies, incluindo peixes teleósteos. A coleta de espermatozoides é relativamente simples em peixes maiores, mas pode ser mais complicada em peixes modelo pequeno, pois produzem menos espermatozoides e são mais delicados. Este artigo, portanto, descreve dois métodos de coleta de espermatozoides no pequeno modelo de peixe, o medaka japonês: dissecção dos testículos e massagem abdominal. Este artigo demonstra que ambas as abordagens são viáveis para o medaka e mostra que a massagem abdominal pode ser realizada repetidamente várias vezes à medida que o peixe se recupera rapidamente do procedimento. Este artigo também descreve um protocolo para análise de espermatozoides assistida por computador em medaka para avaliar objetivamente vários indicadores importantes da qualidade do esperma de medaka (motilidade, progressividade, duração da motilidade, concentração relativa). Esses procedimentos, especificados para este modelo útil de teleósteo pequeno, aumentarão muito a compreensão dos fatores ambientais, fisiológicos e genéticos que influenciam a fertilidade em vertebrados do sexo masculino.

Introdução

Medaka japonês é um pequeno peixe teleósteo de água doce que põe ovos nativo do leste da Ásia. Medaka tornou-se um excelente sistema modelo de vertebrados para estudos de ecotoxicologia, genética do desenvolvimento, genômica e biologia evolutiva e fisiologia ^1,2. Semelhante ao popular peixe-zebra, eles são relativamente fáceis de reproduzir e altamente resistentes a muitas doenças comuns de peixes ^1,2. Existem várias vantagens em usar a medaka como modelo, incluindo um curto tempo de geração, embriões transparentes ^1,2 e um genoma sequenciado³. Ao contrário do peixe-zebra, o medaka tem um gene⁴ que determina o sexo, bem como uma alta temperatura (de 4-40 °C) e tolerância à salinidade (espécie euryhalina)⁵. Além disso, muitas ferramentas genéticas e anatômicas, bem como protocolos 6,7,8,9,10,11,12^, foram desenvolvidos em Medaka para facilitar o estudo de sua biologia.

A reprodução é uma função fisiológica essencial, pois permite que uma espécie se perpetue. A reprodução de vertebrados requer uma miríade de eventos precisamente orquestrados, incluindo a produção de ovócitos nas fêmeas e a produção de espermatozoides nos machos. Os espermatozoides são células únicas, produzidas através do complexo processo de espermatogênese, no qual existem vários pontos de verificação para garantir a entrega de um produto de alta qualidade¹³. A qualidade dos gametas tornou-se um foco em estudos de aquicultura e população de peixes devido ao seu impacto no sucesso da fertilização e na sobrevivência larval. A qualidade dos espermatozoides é, portanto, um importante indicador da fertilidade masculina em vertebrados.

Três fatores úteis para avaliar a qualidade do esperma de peixes são motilidade, progressividade e longevidade. A porcentagem de motilidade e a motilidade progressiva são indicadores comuns da qualidade espermática, pois o movimento progressivo é necessário e se correlaciona fortemente com o sucesso da fertilização^14,15. A duração do movimento também é um indicador importante nos peixes, pois os espermatozoides permanecem totalmente móveis por menos de 2 minutos na maioria das espécies de teleósteos e a trajetória dos espermatozoides é geralmente menos linear do que nos mamíferos¹⁵. No entanto, muitos estudos que avaliaram a motilidade espermática no passado se basearam em métodos subjetivos ou semiquantitativos de análise espermática^15,16. Por exemplo, a motilidade espermática na medaka foi estimada no passado visualmente sob um microscópio¹⁷. Também foi estimada por meio do registro do movimento espermática e do uso de software de imagem para mesclar quadros e medir o caminho e a velocidade de natação^18,19,20. Tais abordagens muitas vezes carecem de robustez, proporcionando resultados diferentes de acordo com a pessoa que realiza a análise^15,21.

A análise de esperma assistida por computador (CASA) foi inicialmente desenvolvida para mamíferos. O CASA é um método quantitativo rápido para avaliar a qualidade dos espermatozoides por meio do registro e mensuração da velocidade e trajetória de forma automatizada¹⁵. Em peixes, tem sido utilizado em diferentes espécies para monitorar os efeitos de diversos poluentes da água sobre a qualidade dos espermatozoides, para identificar progenitores interessantes para melhorar o reprodutor, melhorar a eficiência da criopreservação e armazenamento e otimizar as condições de fertilização¹⁵. Portanto, é uma ferramenta poderosa para avaliar de forma confiável a qualidade do esperma em diferentes espécies de vertebrados. No entanto, devido à importante diversidade nas estratégias reprodutivas entre os peixes, o esperma dos peixes teleósteos difere do dos mamíferos e de uma espécie de peixe para outra. Os peixes teleósteos, que fertilizam principalmente os óvulos externamente liberando gametas na água, possuem espermatozoides altamente concentrados que são relativamente simples em estrutura, sem acrossoma, ao contrário dos mamíferos, que fertilizam internamente e, portanto, não precisam compensar a diluição na água, mas têm que suportar fluidos mais viscosos¹⁴. Além disso, os espermatozoides da maioria dos peixes se movem rapidamente, mas ficam totalmente móveis por menos de 2 minutos após a ativação, embora existam várias exceções^15,22. Como a motilidade pode diminuir rapidamente na maioria dos peixes, deve-se tomar extremo cuidado com o momento da análise após a ativação ao determinar um protocolo de análise de espermatozoides para peixes.

A reprodução é um dos campos da biologia em que os teleósteos e o medaka têm sido amplamente utilizados como organismos modelo. De fato, os machos medaka apresentam comportamentos reprodutivos e sociais interessantes, como a guarda do acasalamento^23,24. Além disso, existem diversas linhagens transgênicas para estudar o controle neuroendócrino da reprodução nessa espécie^25,26,27. A amostragem de espermatozoides, um procedimento que é relativamente simples em peixes maiores, pode ser mais complicada em peixes pequenos modelos, pois produzem menos espermatozoides e são mais delicados. Por esse motivo, a maioria dos estudos envolvendo amostragem espermática em extrato de medaka milt (sêmen de peixe) por esmagamento dissecou testículos ^17,28,29,30. Alguns estudos também utilizam uma massagem abdominal modificada para expressar o milt diretamente no meio ativador^18,19,20; no entanto, com este método é difícil visualizar a quantidade e a cor do milt extraído. No peixe-zebra, a massagem abdominal é comumente utilizada para expressar o milt, que é imediatamente coletado em um tubo capilar^31,32,33. Esse método permite estimar o volume de milt, bem como a observação da cor ejaculada, que é um indicador rápido e simples da qualidade espermática^32,33. Portanto, falta um protocolo claro e bem descrito para coleta e análise de espermatozoides para o medaka.

Este artigo, portanto, descreve dois métodos de coleta de espermatozoides no pequeno modelo de peixe japonês medaka: dissecção de testículos e massagem abdominal com tubos capilares. Isso demonstra que ambas as abordagens são viáveis para o medaka e mostra que a massagem abdominal pode ser realizada repetidamente várias vezes, à medida que o peixe se recupera rapidamente do procedimento. Ele também descreve um protocolo para análise de espermatozoides assistida por computador em medaka para medir de forma confiável vários indicadores importantes da qualidade do esperma de medaka (motilidade, progressividade, longevidade e concentração relativa de espermatozoides). Esses procedimentos, especificados para este modelo útil de teleósteo pequeno, aumentarão muito a compreensão dos fatores ambientais, fisiológicos e genéticos que influenciam a fertilidade em vertebrados do sexo masculino.

Protocolo

Toda a experimentação e manuseio de animais foram conduzidos de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental da Universidade Norueguesa de Ciências da Vida (NMBU). Os experimentos foram realizados com medaka japonesa macho adulto (6-9 meses de idade) (cepa Hd-rR) criado no NMBU (Ås, Noruega). Os métodos também foram brevemente testados em medaka japonesa macho de 9 meses de idade (cepa CAB) criada no Instituto Nacional de Pesquisa para Agricultura, Alimentação e Meio Ambiente (INRAE, Rennes, França).

1. Preparação do instrumento e da solução

1. Preparar solução anestésica (tricaína a 0,6%).
   1. Diluir 0,6 g de Tricaína (MS-222) em 100 mL de 10x Tampão Fosfato Salino (PBS).
   2. Aliquot 2 mL da solução anestésica estoque em tubos de plástico 50 2 mL e armazenar a -20 °C até o uso para anestesia ou eutanásia.
2. Prepare a água de recuperação (solução de cloreto de sódio [NaCl] a 0,9%).
   1. Adicione 27 g de NaCl em 3 L de água do aquário.
   2. Conservar a solução à temperatura ambiente (RT) até à utilização.
3. Ajuste o meio de ativação, se necessário (solução salina balanceada de Hank [HBSS]).
   NOTA: O HBSS pode ser adquirido comercialmente ou fabricado em laboratório (Tabela de Materiais).
   1. Meça o pH do HBSS usando um medidor de pH. Ajuste o pH, se necessário, usando ácido clorídrico ou hidróxido de sódio, de modo que o pH final seja 7,1-7,3.
   2. Meça a osmolalidade do HBSS usando um osmômetro para relatórios futuros.
      NOTA: A gama no produto comercial é de 266-294 mOsmol/kg; no presente estudo, a osmolalidade foi de 287 mOsmol/kg. Pode ser diluído com água destilada para reduzir a osmolalidade, se desejado, mas isso não é necessário, pois não há uma grande diferença na ativação do esperma medaka em 150-300 mOsmol / kg HBSS.
   3. Armazene a solução no RT até o uso.
4. Prepare a esponja de retenção.
   1. Corte uma esponja macia para caber confortavelmente em uma placa de Petri.
   2. Corte uma linha reta no meio da esponja que seja longa o suficiente para receber o peixe (3-4 cm) e cerca de 1 cm de profundidade (Figura 1A). Esta fenda na esponja irá segurar o lado ventral do peixe para cima para expor a cloaca.

2. Coleta de espermatozoides

NOTA: A coleta de espermatozoides pode ser alcançada por dois métodos diferentes: massagem abdominal ou dissecção dos testículos.

1. Coleta de espermatozoides por massagem abdominal
   1. Preparar solução anestésica a 0,03% diluindo um tubo de Tricaína (0,6%) em 38 mL de água de aquário em um recipiente de vidro de 100 mL.
   2. Preparar os instrumentos, incluindo pinças lisas de extremidade romba e uma micropipeta de vidro calibrada descartável de 10 μL e um conjunto de tubo aspirador (Figura 1A). Umedeça a esponja de retenção preparada no passo 1.4 com a solução anestésica.
   3. Preparar tubos com 36 μL da solução activadora para análise imediata. Pré-aqueça a solução activadora num banho-maria ou incubadora regulada para 27 °C durante, pelo menos, 5 minutos.
      NOTA: Embora as amostras possam ser analisadas a partir de peixes individuais, a variação individual pode ser reduzida pelo agrupamento de amostras de vários machos na mesma solução ativadora. Ao agrupar amostras de vários peixes, use 36 μL de solução ativadora por peixe. Essa diluição pode precisar ser ajustada dependendo da tensão ou das condições de criação do medaka usado, pois esses fatores podem afetar a concentração e o volume do esperma. O programa CASA indicará se a concentração é muito alta para identificar espermatozoides.
   4. Anestesiar o peixe, colocando-o em solução anestésica por 30-90 s.
      NOTA: A duração da anestesia deve ser adaptada, pois varia de acordo com o tamanho do peixe. Para garantir que o peixe esteja totalmente anestesiado, aperte suavemente o pedúnculo caudal com fórceps. Se o peixe não reagir, a massagem pode ser iniciada.
   5. Retire o peixe da solução anestésica e use uma toalha de papel ou limpe suavemente para secar o abdômen do peixe. Colocar o peixe no cocho da esponja úmida do lado ventral da esponja para cima, de modo que suas brânquias fiquem expostas à solução anestésica na esponja (Figura 1B).
   6. Se a área ao redor da cloaca estiver molhada, seque suavemente a parte inferior do peixe com um lenço de papel descartável.
   7. Colocar o peixe na esponja de retenção sob um microscópio de dissecação e colocar a micropipeta com um tubo aspirador preso contra a cloaca do peixe (Figura 1C).
   8. Massageie o abdômen do peixe apertando suavemente com pinças lisas de extremidade romba em movimento rostral a caudal enquanto suga simultaneamente para coletar o milt expelido na pipeta (Figura 1D).
   9. Solte o peixe da esponja na água de recuperação. Deixe-os se recuperar na solução por pelo menos 15 minutos antes de devolvê-los ao sistema do aquário.
   10. Transfira o milt para um tubo preparado com solução ativadora pré-aquecida e pipeta para cima e para baixo várias vezes, sugando e soprando no conjunto do tubo aspirador.
   11. Homogeneizar o esperma diluído suavemente agitando os tubos antes da análise.
       NOTA: Para obter melhores resultados, analise as amostras imediatamente (por exemplo, 5 s) após a ativação. Em medaka, a análise pode ser atrasada, se necessário, pois os espermatozoides permanecem móveis por várias horas, mas o tempo deve permanecer consistente entre as amostras, pois a motilidade diminui com o tempo.
2. Coleta de espermatozoides por dissecção dos testículos
   1. Preparar solução de eutanásia a 0,08% diluindo dois tubos de Tricaína (0,6%) em 26 mL de água de aquário em um recipiente de vidro de 100 mL.
   2. Prepare ferramentas de dissecação, incluindo pinças contundentes e finas e pequenas tesouras de dissecação (Figura 1E).
   3. Preparar um tubo para cada amostra com 120 μL de solução activadora para análise imediata. Pré-aqueça a solução activadora num banho-maria ou incubadora regulada para 27 °C durante, pelo menos, 5 minutos.
      NOTA: Embora as amostras possam ser analisadas a partir de peixes individuais, a variação individual pode ser reduzida pelo agrupamento de amostras de vários machos na mesma solução ativadora. Para o agrupamento de amostras de vários peixes, use 120 μL de solução ativadora por peixe. Essa diluição pode precisar ser ajustada dependendo da tensão ou das condições de criação do medaka usado, pois esses fatores podem afetar a concentração e o volume do esperma. O programa CASA indicará se a concentração é muito alta para identificar espermatozoides.
   4. Eutanasie o peixe, colocando-o na solução anestésica a 0,08% por 30-90 s.
      NOTA: A duração depende do tamanho do peixe. Para garantir que o peixe seja sacrificado, espere que os movimentos do opérculo cessem. O peixe não deve reagir ao toque da pinça.
   5. Retire o peixe da solução de eutanásia e seque suavemente o peixe com uma toalha de papel ou limpe suavemente.
      NOTA: Nesta etapa, o peixe pode ser pesado para posteriormente calcular o índice gonadossomático (GSI, peso gonadal / peso corporal).
   6. Colocar o peixe sob um microscópio de dissecação com o lado lateral esquerdo voltado para cima (Figura 1F).
   7. Usando uma pequena tesoura dissecante, corte um retalho dorsalmente da cloaca e, em seguida, atravesse as costelas até as brânquias para expor os órgãos internos (Figura 1G).
   8. Localize os testículos, corte o acessório em ambas as extremidades com pinça fina e remova os testículos (Figura 1H).
      NOTA: Para calcular o GSI, os testículos podem ser pesados nesta etapa. Trabalhe rapidamente para evitar a secagem do tecido.
   9. Transfira os testículos para um tubo preparado com a solução ativadora pré-aquecida.
   10. Use fórceps para esmagar os testículos várias vezes contra o lado do tubo para liberar o esperma. A liberação de espermatozoides geralmente pode ser visualizada e tornará a solução ligeiramente turva.
   11. Homogeneizar o esperma diluído suavemente agitando os tubos antes da análise.
       NOTA: Para obter melhores resultados, analise as amostras imediatamente (por exemplo, 5 s) após a ativação. Em medaka, a análise pode ser atrasada, se necessário, pois os espermatozoides permanecem móveis por várias horas, mas o tempo deve permanecer consistente entre as amostras, pois a motilidade diminui com o tempo.

Figura 1: Coleta de leves por massagem abdominal (A-D) e dissecção de testículos (E-H). (A) Instrumentos para massagem abdominal: esponja de contenção, pinça lisa contundente e micropipeta de vidro calibrada descartável de 10 μL com montagem de tubo aspirador; (B) Posição do peixe na esponja de retenção, com brânquias expostas à anestesia na esponja e cloaca voltadas para cima; (C) Posição de pinça lisa romba no abdômen e micropipeta contra cloaca; (D) Suave em micropipeta após massagem suave e sucção. (E) Instrumentos para dissecção de testículos: pinça romba, pinça fina e tesoura de dissecação pequena; (F) Posição do peixe para dissecção dos testículos; (G) Vista lateral dos órgãos internos; (H) Remova os testículos cortando o acessório em ambas as extremidades com pinças finas. Barra de escala: 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Análise espermática com sistema CASA

1. O sistema CASA (SCA Evolution) deve ser configurado de acordo com o manual com microscópio utilizando filtro verde e objetiva 10x com contraste de fase.
2. Preparar lâminas descartáveis de câmara de contagem de 20 μm por pré-aquecimento numa placa de aquecimento ou numa incubadora regulada para 27 °C durante, pelo menos, 5 minutos.
3. Abra o software de análise de espermatozoides e selecione o módulo de motilidade.
4. Defina a configuração para o medaka, conforme mostrado na Figura 2B.
5. Coloque uma lâmina de câmara de contagem descartável pré-aquecida de 20 μm sob o microscópio em um palco aquecido ajustado a 27 °C.
6. Pipetar a amostra para a câmara na lâmina até encher a câmara sem encher em excesso. Limpe cuidadosamente o excesso de amostras da entrada da câmara com uma ponta de algodão ou limpe suavemente para evitar células flutuantes.
7. Selecione Analisar para examinar a amostra sob o microscópio.
   NOTA: Se o ícone do microscópio estiver vermelho, a iluminação do microscópio precisa ser ajustada para que o programa rastreie o esperma com precisão. Ajuste o brilho do microscópio, de modo que o movimento da cauda do esperma seja claramente visto. O ícone deve ser azul.
8. Certifique-se de que o microscópio esteja focado e selecione Analisar novamente para registrar o esperma no campo. Mova o slide para que uma nova área da amostra fique no quadro e repita para capturar de 3 a 5 campos de exibição diferentes. Evite campos com bolhas de ar, massas celulares ou artefatos.
9. Selecione Resultados para exibir os resultados.
   NOTA: Se os campos na página de resultados estiverem descritos em vermelho, siga as instruções do sistema para excluir os campos que variam muito em concentração ou motilidade.
10. Clique duas vezes em um campo para visualizar os resultados do campo individual ou para verificar manualmente se há espermatozoides rotulados ou não rastreados incorretamente. Clique com o botão direito do mouse em espermatozoides individuais para renomear a motilidade, se necessário (Figura 2A).

Figura 2: Captura de tela do software SCA Evolution . (A) Resultados de rastreamento de esperma para um campo. Visualize dados de campo no lado direito e clique duas vezes em espermatozoides para visualizar dados individuais; (B) Resumo dos resultados para todos os campos com o menu de configuração aberto. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Tipo de dados obtidos
A análise da motilidade espermática do software SCA Evolution fornece dados sobre motilidade (porcentagem de espermatozoides móveis e imóveis), bem como progressividade (porcentagem de espermatozoides progressivos e não progressivos) e velocidade (porcentagem de espermatozoides rápidos, médios e lentos). Também combina progressividade e velocidade (progressiva rápida, progressiva média, não progressiva). Esses rótulos são baseados em medidas (Fig...

Discussão

A osmolalidade é um fator importante na ativação do espermatozoide de peixes^36,37. Geralmente, os espermatozoides são imóveis nos testículos e tornam-se móveis em meios hiperosmóticos em relação ao líquido seminal para peixes marinhos e hipo-osmóticos em relação ao líquido seminal para peixes de água doce³⁷. Semelhante ao sangue, o plasma seminal em peixes de água doce é tipicamente menor do que o de peixes marinhos (cerc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040