АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье описаны два быстрых и эффективных метода сбора спермы у мелкомодельных рыбок медака (Oryzias latipes), а также протокол достоверной оценки качества спермы с помощью компьютерного анализа спермы (CASA).

Аннотация

Японская медака (Oryzias latipes) — телеостная рыба и новая модель позвоночных для экотоксикологии, развития, генетики и физиологических исследований. Медака также широко используется для исследования размножения позвоночных, что является важной биологической функцией, поскольку оно позволяет виду увековечиваться. Качество спермы является важным показателем мужской фертильности и, таким образом, успешности размножения. Методы извлечения спермы и анализ спермы хорошо документированы для многих видов, включая телеостных рыб. Сбор спермы относительно прост у более крупных рыб, но может быть более сложным у мелких модельных рыб, поскольку они производят меньше спермы и являются более деликатными. В данной статье, таким образом, описаны два метода сбора спермы у маленькой образцовой рыбки, японской медаки: рассечение яичек и массаж живота. Эта статья демонстрирует, что оба подхода возможны для медаки и показывает, что массаж живота может быть выполнен повторно несколько раз, поскольку рыба быстро восстанавливается после процедуры. В данной статье также описан протокол компьютерного анализа спермы в медаке для объективной оценки нескольких важных показателей качества сперматозоидов медака (подвижность, прогрессивность, продолжительность подвижности, относительная концентрация). Эти процедуры, указанные для этой полезной модели малого телеоста, значительно улучшат понимание экологических, физиологических и генетических факторов, влияющих на фертильность у самцов позвоночных.

Введение

Японская медака - это небольшая, откладывающая яйца пресноводная рыба, родом из Восточной Азии. Medaka стала отличной модельной системой позвоночных для экотоксикологии, генетики развития, геномики и эволюционной биологии и физиологических исследований 1,2. Подобно популярным рыбкам данио, они относительно просты в разведении и очень устойчивы ко многим распространенным заболеваниям рыб 1,2. Существует несколько преимуществ использования медаки в качестве модели, включая короткое время генерации, прозрачные эмбрионы 1,2 и секвенированный геном3. В отличие от рыбок данио, медака имеет определяющий пол ген4, а также толерантность к высокой температуре (от 4-40 °C) и солености (эвригалинные виды)5. Кроме того, многие генетические и анатомические инструменты, а также протоколы 6,7,8,9,10,11,12 были разработаны в медаке для облегчения изучения ее биологии.

Размножение является важной физиологической функцией, поскольку оно позволяет виду увековечиваться. Размножение позвоночных требует множества точно организованных событий, включая производство ооцитов у самок и производство спермы у самцов. Сперматозоиды являются уникальными клетками, полученными в результате сложного процесса сперматогенеза, в котором существует ряд контрольных точек, гарантирующих доставку высококачественного продукта13. Качество гамет стало центром внимания в аквакультуре и исследованиях популяций рыб из-за его влияния на успех оплодотворения и выживание личинок. Поэтому качество спермы является важным показателем мужской фертильности у позвоночных.

Тремя полезными факторами для оценки качества спермы рыб являются подвижность, прогрессивность и долговечность. Процент подвижности и прогрессирующая подвижность являются общими показателями качества спермы, поскольку прогрессивное движение необходимо и сильно коррелирует с успехом оплодотворения14,15. Продолжительность движения также является важным показателем у рыб, поскольку сперматозоиды остаются полностью подвижными менее 2 мин у большинства видов телеостов, а траектория сперматозоидов, как правило, менее линейна, чем у млекопитающих15. Однако многие исследования, оценивающие подвижность сперматозоидов в прошлом, опирались на субъективные или полуколичественные методы анализа сперматозоидов15,16. Например, подвижность сперматозоидов в медаке оценивалась в прошлом визуально под микроскопом17. Он также был оценен путем регистрации движения сперматозоидов и использования программного обеспечения для визуализации для слияния кадров и измерения траектории плавания и скорости 18,19,20. Таким подходам часто не хватает надежности, обеспечивая различные результаты в зависимости от человека, выполняющего анализ15,21.

Компьютерный анализ спермы (CASA) был первоначально разработан для млекопитающих. CASA - это быстрый количественный метод оценки качества спермы путем регистрации и измерения скорости и траектории автоматическим способом15. У рыб он использовался у различных видов для мониторинга воздействия нескольких загрязнителей воды на качество спермы, для выявления интересных прародителей для улучшения маточного поголовья, для повышения эффективности криоконсервации и хранения, а также для оптимизации условий для оплодотворения15. Поэтому он является мощным инструментом для достоверной оценки качества спермы у разных видов позвоночных. Однако из-за важного разнообразия репродуктивных стратегий между рыбами сперма телеостных рыб отличается от спермы млекопитающих и от одного вида рыб к другому. Телеостные рыбы, которые в основном оплодотворяют икру внешне, выпуская гаметы в воду, имеют высококонцентрированные сперматозоиды, которые относительно просты по структуре без акросом, в отличие от млекопитающих, которые оплодотворяются внутренне и поэтому не должны компенсировать разбавление в воде, но должны выдерживать больше вязких жидкостей14. Кроме того, сперматозоиды большинства рыб движутся быстро, но полностью подвижны менее чем через 2 минуты после активации, хотя есть несколько исключений15,22. Поскольку подвижность может быстро снижаться у большинства рыб, следует проявлять крайнюю осторожность со сроками анализа после активации при определении протокола анализа спермы для рыб.

Размножение является одной из областей в биологии, в которой телеосты и медака широко используются в качестве модельных организмов. Действительно, самцы медаки демонстрируют интересное репродуктивное и социальное поведение, такое как мат, охраняющий23,24 человека. Кроме того, существует несколько трансгенных линий для изучения нейроэндокринного контроля размножения у этого вида 25,26,27. Отбор проб спермы, процедура, которая относительно проста у более крупных рыб, может быть более сложной у мелких моделей рыб, поскольку они производят меньше спермы и являются более деликатными. По этой причине большинство исследований, связанных с отбором проб спермы в медаке, извлекают milt (сперму рыбы) путем дробления рассеченных яичек 17,28,29,30. В нескольких исследованиях также используется модифицированный массаж живота для экспрессии молока непосредственно в активирующую среду 18,19,20; однако с помощью этого метода трудно визуализировать количество и цвет извлеченного молока. У рыбок данио массаж живота обычно используется для сцеживания молока, которое сразу собирается в капиллярную трубку 31,32,33. Этот метод позволяет оценить объем молока, а также наблюдать цвет эякулята, который является быстрым и простым показателем качества спермы32,33. Поэтому для медаки отсутствует четкий и хорошо описанный протокол сбора и анализа спермы.

Поэтому в данной статье описаны два метода сбора спермы у маленькой модели рыбки японской медаки: рассечение яичек и массаж живота капиллярными трубками. Это демонстрирует, что оба подхода осуществимы для медаки и показывает, что массаж живота может быть выполнен повторно несколько раз, так как рыба быстро восстанавливается после процедуры. В нем также описывается протокол компьютерного анализа спермы в медаке для надежного измерения нескольких важных показателей качества спермы медака (подвижность, прогрессивность, долговечность и относительная концентрация сперматозоидов). Эти процедуры, указанные для этой полезной модели малого телеоста, значительно улучшат понимание экологических, физиологических и генетических факторов, влияющих на фертильность у самцов позвоночных.

протокол

Все эксперименты и обращение с животными проводились в соответствии с рекомендациями по благополучию экспериментальных животных в Норвежском университете естественных наук (NMBU). Эксперименты проводились с использованием взрослого (6-9-месячного) самца японской медаки (штамм Hd-rR), выращенного в NMBU (Ос, Норвегия). Методы также были кратко протестированы на 9-месячном самце японской медаки (штамм CAB), выращенном в Национальном научно-исследовательском институте сельского хозяйства, продовольствия и окружающей среды (INRAE, Ренн, Франция).

1. Подготовка инструмента и раствора

  1. Готовят раствор анестетика (0,6% трикаин).
    1. Развести 0,6 г трикаина (MS-222) в 100 мл 10x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
    2. Aliquot 2 мл раствора анестетика в пластиковые пробирки по 50 2 мл и хранят при -20 °C до использования для анестезии или эвтаназии.
  2. Приготовьте рекуперационную воду (0,9% раствор хлорида натрия [NaCl]).
    1. Добавьте 27 г NaCl в 3 л аквариумной воды.
    2. Хранить раствор при комнатной температуре (RT) до использования.
  3. При необходимости отрегулируйте среду активации (сбалансированный раствор соли Хэнка [HBSS]).
    ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS можно приобрести в коммерческих целях или сделать в лаборатории (Таблица материалов).
    1. Измерьте pH HBSS с помощью рН-метра. Отрегулируйте рН при необходимости, используя соляную кислоту или гидроксид натрия, чтобы конечный рН составлял 7,1-7,3.
    2. Измерьте осмоляльность HBSS с помощью осмометра для будущих отчетов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ассортимент товарного продукта составляет 266-294 мОсмоль/кг; в текущем исследовании осмоляльность составляла 287 мОсмоль/кг. При желании его можно разбавлять дистиллированной водой для снижения осмоляльности, но в этом нет необходимости, так как нет большой разницы в активации сперматозоидов медака в 150-300 мОсмоль/кг HBSS.
    3. Храните раствор в RT до использования.
  4. Подготовьте губку для хранения.
    1. Нарежьте мягкую губку, чтобы плотно поместиться в чашке Петри.
    2. Вырежьте прямую линию в середине губки, которая достаточно длинна, чтобы принять рыбу (3-4 см) и около 1 см глубиной (рисунок 1А). Эта щель в губке будет удерживать вентральную сторону рыбы вверх, чтобы обнажить клоаку.

2. Сбор спермы

ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор спермы может быть достигнут двумя различными методами: массаж живота или рассечение яичек.

  1. Сбор спермы методом массажа живота
    1. Приготовить 0,03% раствор анестетика, разбавлив один тюбик запаса трикаина (0,6%) в 38 мл аквариумной воды в стеклянной емкости объемом 100 мл.
    2. Подготовьте инструменты, включая гладкие щипцы с тупым концом и одноразовый калиброванный стеклянный микропипетку 10 мкл и аспираторную трубку в сборе (рисунок 1A). Смочите губку, приготовленную на этапе 1.4, раствором анестетика.
    3. Подготовьте пробирки с 36 мкл активирующего раствора для немедленного анализа. Разогрейте активирующий раствор на водяной бане или в инкубаторе, установив до 27 °C в течение не менее 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя образцы могут быть проанализированы из отдельных рыб, индивидуальные вариации могут быть уменьшены путем объединения образцов от нескольких самцов в одном и том же активирующем растворе. При объединении образцов из нескольких рыб используйте 36 мкл активирующего раствора на рыбу. Это разведение, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от деформации или условий выращивания используемой медаки, поскольку эти факторы могут влиять на концентрацию и объем сперматозоидов. Программа CASA укажет, не слишком ли высока концентрация для идентификации сперматозоидов.
    4. Обезболить рыбу, поместив ее в обезболивающий раствор на 30-90 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность анестезии должна быть адаптирована, так как она варьируется в зависимости от размера рыбы. Чтобы убедиться, что рыба полностью обезболена, аккуратно зажмите хвостовую ножку щипцами. Если рыба не реагирует, можно начинать массаж.
    5. Выньте рыбу из раствора анестетика и используйте бумажное полотенце или аккуратно протрите, чтобы высушить брюшко рыбы. Поместите рыбу в корыто влаги, удерживающей губку брюшной стороной вверх, чтобы ее жабры подвергались воздействию раствора анестетика в губке (рисунок 1B).
    6. Если область вокруг клоаки влажная, аккуратно высушите нижнюю сторону рыбы одноразовой салфеткой.
    7. Поместите рыбу в губку под рассекающий микроскоп и поместите микропипетку с трубкой аспиратора, прикрепленной к клоаке рыбы (рисунок 1C).
    8. Массируйте живот рыбы, осторожно сжимая тупым концом гладкие щипцы в ростральном и каудальном движении, одновременно сосая, чтобы собрать вытесненное молоко в пипетку (рисунок 1D).
    9. Выпустите рыбу из губки в восстановительную воду. Дайте им восстановиться в растворе не менее 15 минут, прежде чем возвращать их в аквариумную систему.
    10. Переложите молоко в подготовленную трубку с предварительно нагретым активирующим раствором и пипеткой вверх и вниз несколько раз путем всасывания и продувания на аспираторную трубку в сборе.
    11. Гомогенизируйте разбавленную сперму осторожно, щелкнув трубками перед анализом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов анализируйте образцы сразу (например, через 5 с) после активации. При медаке анализ может быть отложен, если это необходимо, так как сперматозоиды остаются подвижными в течение нескольких часов, но время должно оставаться последовательным между образцами, поскольку подвижность со временем уменьшается.
  2. Забор спермы путем рассечения яичек
    1. Приготовьте 0,08% раствор для эвтаназии, разбавляя две трубки с запасом трикаина (0,6%) в 26 мл аквариумной воды в стеклянной емкости объемом 100 мл.
    2. Подготовьте инструменты для рассечения, включая тупые и тонкие щипцы и небольшие рассекающие ножницы (рисунок 1E).
    3. Подготовьте пробирку для каждого образца со 120 мкл активирующего раствора для немедленного анализа. Разогрейте активирующий раствор на водяной бане или в инкубаторе, установив до 27 °C в течение не менее 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя образцы могут быть проанализированы из отдельных рыб, индивидуальные вариации могут быть уменьшены путем объединения образцов от нескольких самцов в одном и том же активирующем растворе. Для объединения образцов из нескольких рыб используйте 120 мкл активирующего раствора на рыбу. Это разведение, возможно, потребуется скорректировать в зависимости от деформации или условий выращивания используемой медаки, поскольку эти факторы могут влиять на концентрацию и объем сперматозоидов. Программа CASA укажет, не слишком ли высока концентрация для идентификации сперматозоидов.
    4. Усыпить рыбу, поместив ее в 0,08% раствор анестетика на 30-90 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность зависит от размера рыбы. Чтобы убедиться, что рыба усыплена, дождитесь прекращения движений оперкулума. Рыба не должна реагировать на прикосновение щипцов.
    5. Выньте рыбу из раствора для эвтаназии и аккуратно высушите рыбу бумажным полотенцем или аккуратно протрите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рыбу можно взвесить, чтобы впоследствии рассчитать гонадосоматический индекс (GSI, гонадная масса / масса тела).
    6. Поместите рыбу под рассекающий микроскоп левой боковой стороной вверх (рисунок 1F).
    7. Используя небольшие рассекающие ножницы, отрежьте лоскут дорсально от клоаки, а затем через ребра к жабрам, чтобы обнажить внутренние органы (рисунок 1G).
    8. Найдите яички, отрежьте насадку с обоих концов тонкими щипцами и удалите яички (рисунок 1H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета GSI яички можно взвесить на этом этапе. Работайте быстро, чтобы избежать пересыхания тканей.
    9. Переложите яички в подготовленную пробирку с предварительно нагретым активирующим раствором.
    10. Используйте щипцы, чтобы раздавить яички несколько раз о сторону трубки, чтобы выпустить сперму. Высвобождение сперматозоидов обычно можно визуализировать и сделать раствор немного мутным.
    11. Гомогенизируйте разбавленную сперму осторожно, щелкнув трубками перед анализом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов анализируйте образцы сразу (например, через 5 с) после активации. При медаке анализ может быть отложен, если это необходимо, так как сперматозоиды остаются подвижными в течение нескольких часов, но время должно оставаться последовательным между образцами, поскольку подвижность со временем уменьшается.

figure-protocol-9024
Рисунок 1: Сбор milt методом массажа живота (A-D) и рассечения яичек (E-H). (A) Инструменты для массажа живота: удерживающие губки, тупые гладкие щипцы и 10 мкл одноразовая калиброванная стеклянная микропипетка с аспираторной трубкой в сборе; (B) Положение рыбы в держащей губке, с жабрами, подвергшимися анестезии в губке, и клоакой, обращенной вверх; (C) Положение тупых гладких щипцов на брюшной полости и микропипетке на фоне клоаки; (D) Молочница в микропипетке после нежного массажа и сосания. (E) Инструменты для рассечения яичек: тупые щипцы, тонкие щипцы и небольшие рассекающие ножницы; F) положение рыбы для рассечения яичек; G) боковой вид внутренних органов; H) Удалите яички, разрезав крепление с обоих концов тонкими щипцами. Шкала: 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Анализ спермы с помощью системы CASA

  1. Система CASA (SCA Evolution) должна быть настроена в соответствии с руководством с помощью микроскопа с использованием зеленого фильтра и 10-кратного объектива с фазовым контрастом.
  2. Подготовьте одноразовые слайды счетной камеры 20 мкм путем предварительного нагрева на нагревательной пластине или в инкубаторе, установленном на 27 °C в течение не менее 5 минут.
  3. Откройте программное обеспечение для анализа спермы и выберите модуль подвижности.
  4. Задайте конфигурацию для medaka, как показано на рисунке 2B.
  5. Поместите предварительно расплавленный одноразовый предмет 20 мкм счетной камеры под микроскоп на нагретой сцене, установленной на 27 °C.
  6. Пипетка образца в камеру на слайде до тех пор, пока он не заполнит камеру без переполнения. Тщательно вытрите лишние образцы со входа в камеру хлопковым наконечником или аккуратно протрите, чтобы предотвратить плавающие клетки.
  7. Выберите Анализ , чтобы посмотреть на образец под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если значок микроскопа красный, освещение микроскопа должно быть отрегулировано, чтобы программа точно отслеживала сперму. Отрегулируйте яркость микроскопа, чтобы движение хвоста сперматозоида было хорошо видно. Значок должен быть синего цвета.
  8. Убедитесь, что микроскоп сфокусирован, и снова выберите «Проанализировать », чтобы записать сперму в поле. Переместите слайд так, чтобы новая область образца оказалась в кадре, и повторите для захвата для 3-5 различных полей зрения. Избегайте полей с пузырьками воздуха, клеточными массами или артефактами.
  9. Выберите Результаты, чтобы просмотреть результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если поля на странице результатов выделены красным цветом, следуйте подсказкам системы, чтобы удалить поля, которые слишком сильно различаются по концентрации или подвижности.
  10. Дважды щелкните по полю, чтобы просмотреть результаты для отдельного поля или вручную проверить наличие неправильно маркированных или неотслеженных сперматозоидов. Щелкните правой кнопкой мыши на отдельных сперматозоидах, чтобы при необходимости перемаркировать подвижность (рисунок 2A).

figure-protocol-12624
Рисунок 2: Скриншот программного обеспечения SCA Evolution. (A) Результаты отслеживания сперматозоидов для одного поля. Просмотр данных поля с правой стороны и двойной щелчок сперматозоидов для просмотра отдельных данных; (B) Сводка результатов для всех полей с открытым меню конфигурации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Тип полученных данных
Анализ подвижности сперматозоидов с помощью программного обеспечения SCA Evolution предоставляет данные о подвижности (процент подвижных и неподвижных сперматозоидов), а также о прогрессивности (процент прогрессивных и непрогрессирующих сперматозоидов) и ...

Обсуждение

Осмоляльность является важным фактором активации сперматозоидов рыб36,37. Как правило, сперматозоиды являются бессодержательными в яичках и становятся подвижными в средах, которые являются гиперосмотическими относительно семенной жидкости для морских ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Норвежским университетом естественных наук и американской программой Фулбрайта. Авторы хотели бы поблагодарить Энтони Пелтье и Лурдес Карреон Г Тан в NMBU за обслуживание рыбного хозяйства и Гийома Гурмелина из ISC LPGP в INRAE (Франция) за предоставление рыбы и лабораторных помещений для дальнейшего тестирования этих методов.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubesAxygenMCT-150-CAny standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assemblyDrummond2-000-010
10x objective with phase contrastNikonMRP90100
2 mL tubesAxygenMCT-200-c-sAny standard brand can be used
Blunt forcepsFine Science Tools11000-12
Blunt smooth forcepsMilliporeXX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slideMicroptic20.2.25 Leja 2 chamber slides
Dissecting microscopeOlympusSZX7Any standard brand can be used
Fine forcepsFine Science Tools11253-20
HBSSSigmaaldrichH8264-1L
Holding spongeself-made
Inverted microscopeNikonEclipse Ts2R
SCA EvolutionMicroptic
Small dissecting scissorsFine Science Tools14090-09
Sodium Chloride (NaCl)SigmaaldrichS9888
Tabletop vortexLabnetC1301B
TricaineSigmaaldrichA5040

Ссылки

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

188casa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены