Collecte de sperme et analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes dans le modèle téléostéen japonais Medaka (Oryzias latipes)

Résumé

Cet article décrit deux méthodes rapides et efficaces pour collecter le sperme du petit poisson modèle medaka (Oryzias latipes), ainsi qu’un protocole pour évaluer de manière fiable la qualité du sperme à l’aide de l’analyse assistée par ordinateur du sperme (CASA).

Résumé

Le médaka japonais (Oryzias latipes) est un poisson téléostéen et un modèle vertébré émergent pour la recherche en écotoxicologie, développement, génétique et physiologie. Medaka est également largement utilisé pour étudier la reproduction des vertébrés, qui est une fonction biologique essentielle car elle permet à une espèce de se perpétuer. La qualité du sperme est un indicateur important de la fertilité masculine et, par conséquent, du succès de la reproduction. Les techniques d’extraction du sperme et d’analyse du sperme sont bien documentées pour de nombreuses espèces, y compris les poissons téléostéens. La collecte de sperme est relativement simple chez les gros poissons, mais peut être plus compliquée chez les petits poissons modèles car ils produisent moins de spermatozoïdes et sont plus délicats. Cet article décrit donc deux méthodes de collecte de sperme chez le petit poisson modèle, le médaka japonais: la dissection des testicules et le massage abdominal. Cet article démontre que les deux approches sont réalisables pour le medaka et montre que le massage abdominal peut être effectué un nombre répété de fois car les poissons se remettent rapidement de la procédure. Cet article décrit également un protocole d’analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes en medaka pour évaluer objectivement plusieurs indicateurs importants de la qualité du sperme medaka (motilité, progressivité, durée de motilité, concentration relative). Ces procédures, spécifiées pour ce modèle utile de petits téléostéens, amélioreront grandement la compréhension des facteurs environnementaux, physiologiques et génétiques influençant la fertilité chez les mâles vertébrés.

Introduction

Le medaka japonais est un petit poisson téléostéen d’eau douce pondeur originaire d’Asie de l’Est. Medaka est devenu un excellent système modèle de vertébrés pour l’écotoxicologie, la génétique du développement, la génomique et les études de biologie et de physiologie évolutives ^1,2. Semblables au poisson zèbre populaire, ils sont relativement faciles à élever et très résistants à de nombreuses maladies courantes^des poissons ^1,2. L’utilisation de medaka comme modèle présente plusieurs avantages, notamment un temps de génération court, des embryons tran....

Protocole

Toutes les expériences et manipulations des animaux ont été menées conformément aux recommandations sur le bien-être animal expérimental à l’Université norvégienne des sciences de la vie (NMBU). Les expériences ont été réalisées en utilisant des medakas japonais mâles adultes (âgés de 6 à 9 mois) (souche Hd-rR) élevés à la NMBU (Ås, Norvège). Les méthodes ont également été brièvement testées sur un medaka japonais mâle (souche CAB) âgé de 9 mois élevé à l’Institut national de recherche pour l’agriculture, l’alimentation et l’environnement (INRAE, Rennes, France).

1. Préparation de l’instrument et de la solution

1. Pr....

Résultats

Type de données obtenues
L’analyse de la motilité des spermatozoïdes du logiciel SCA Evolution fournit des données sur la motilité (pourcentage de spermatozoïdes mobiles et immotiles), ainsi que sur la progressivité (pourcentage de spermatozoïdes progressifs et non progressifs) et la vitesse (pourcentage de spermatozoïdes rapides, moyens et lents). Il combine également progressivité et vélocité (rapide progressif, moyen progressif, non progressif). Ces étiquettes sont basées sur des m.......

Discussion

L’osmolalité est un facteur important dans l’activation des spermatozoïdes de poisson^36,37. En général, les spermatozoïdes sont immotiles dans les testicules et deviennent mobiles dans les milieux hyperosmotiques par rapport au liquide séminal pour les poissons marins, et hypo-osmotiques par rapport au liquide séminal pour les poissons d’eau douce³⁷. Comme dans le sang, le plasma séminal chez les poissons d’eau douce est g?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040