Spermienentnahme und computergestützte Spermienanalyse im Teleostmodell Japanisches Medaka (Oryzias latipes)

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und effiziente Methoden zur Entnahme von Spermien aus dem kleinen Modellfisch Medaka (Oryzias latipes) sowie ein Protokoll zur zuverlässigen Beurteilung der Spermienqualität mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA).

Zusammenfassung

Der Japanische Medaka (Oryzias latipes) ist ein Teleostfisch und ein aufstrebendes Wirbeltiermodell für Ökotoxikologie, Entwicklungs-, Genetik- und Physiologieforschung. Medaka wird auch ausgiebig verwendet, um die Fortpflanzung von Wirbeltieren zu untersuchen, was eine wesentliche biologische Funktion ist, da sie es einer Art ermöglicht, sich zu verewigen. Die Spermienqualität ist ein wichtiger Indikator für die männliche Fruchtbarkeit und damit für den Fortpflanzungserfolg. Techniken zur Extraktion von Spermien und Spermienanalysen sind für viele Arten, einschließlich Teleostfische, gut dokumentiert. Das Sammeln von Spermien ist bei größeren Fischen relativ einfach, kann aber bei kleinen Modellfischen komplizierter sein, da sie weniger Spermien produzieren und empfindlicher sind. Dieser Artikel beschreibt daher zwei Methoden der Spermienentnahme beim kleinen Modellfisch, der japanischen Medaka: Hodendissektion und Bauchmassage. Diese Arbeit zeigt, dass beide Ansätze für Medaka machbar sind und zeigt, dass die Bauchmassage mehrmals durchgeführt werden kann, da sich die Fische schnell von dem Eingriff erholen. Dieser Artikel beschreibt auch ein Protokoll für die computergestützte Spermienanalyse in Medaka, um mehrere wichtige Indikatoren der Medaka-Spermienqualität objektiv zu bewerten (Motilität, Progressivität, Dauer der Motilität, relative Konzentration). Diese Verfahren, die für dieses nützliche kleine Teleostmodell spezifiziert wurden, werden das Verständnis der umweltbedingten, physiologischen und genetischen Faktoren, die die Fruchtbarkeit bei männlichen Wirbeltieren beeinflussen, erheblich verbessern.

Einleitung

Japanischer Medaka ist ein kleiner, eierlegender Süßwasser-Teleostfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Medaka hat sich zu einem ausgezeichneten Wirbeltiermodellsystem für Ökotoxikologie, Entwicklungsgenetik, Genomik und evolutionäre Biologie und Physiologie entwickelt ^1,2. Ähnlich wie der beliebte Zebrafisch sind sie relativ einfach zu züchten und sehr resistent gegen viele häufige Fischkrankheiten ^1,2. Die Verwendung von Medaka als Modell bietet mehrere Vorteile, darunter eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen ^1,2 und ein sequenziertes Genom³. Im Gegensatz zu Zebrafischen hat Medaka ein geschlechtsbestimmendes Gen 4 sowie eine hohe Temperatur- (von^4-40 °C) und Salzgehaltstoleranz (Euryhaline-Arten)⁵. Auch viele genetische und anatomische Werkzeuge sowie die Protokolle 6,7,8,9,10,11,12 wurden in Medaka entwickelt^, um das Studium seiner Biologie zu erleichtern.

Fortpflanzung ist eine wesentliche physiologische Funktion, da sie es einer Spezies ermöglicht, sich zu verewigen. Die Fortpflanzung von Wirbeltieren erfordert eine Vielzahl von genau orchestrierten Ereignissen, einschließlich der Produktion von Eizellen bei Frauen und der Produktion von Spermien bei Männern. Spermien sind einzigartige Zellen, die durch den komplexen Prozess der Spermatogenese hergestellt werden, in denen es eine Reihe von Kontrollpunkten gibt, um die Lieferung eines hochwertigen Produkts zu gewährleisten¹³. Die Gametenqualität ist aufgrund ihrer Auswirkungen auf den Befruchtungserfolg und das Überleben der Larven zu einem Schwerpunkt in Aquakultur- und Fischpopulationsstudien geworden. Die Spermienqualität ist daher ein wichtiger Indikator für die männliche Fruchtbarkeit bei Wirbeltieren.

Drei nützliche Faktoren zur Beurteilung der Qualität von Fischspermien sind Motilität, Progressivität und Langlebigkeit. Prozentuale Motilität und progressive Motilität sind häufige Indikatoren für die Spermienqualität, da progressive Bewegung notwendig ist und stark mit dem Befruchtungserfolg korreliert^14,15. Die Dauer der Bewegung ist auch ein wichtiger Indikator bei Fischen, da die Spermien bei den meisten Teleostarten weniger als 2 Minuten lang voll beweglich bleiben und die Flugbahn der Spermien im Allgemeinen weniger linear ist als bei Säugetieren¹⁵. Viele Studien, die die Spermienmotilität in der Vergangenheit bewerteten, stützten sich jedoch auf subjektive oder semiquantitative Methoden zur Analyse von Spermien^15,16. Zum Beispiel wurde die Spermienmotilität in Medaka in der Vergangenheit visuell unter einem Mikroskop geschätzt¹⁷. Es wurde auch geschätzt, indem die Bewegung der Spermien aufgezeichnet und Bildgebungssoftware verwendet wurde, um Rahmen zusammenzuführen und den Schwimmweg und die Geschwindigkeit zu messen^18,19,20. Solchen Ansätzen mangelt es oft an Robustheit und liefert je nach Person, die die Analyse durchführt, unterschiedliche Ergebnisse^15,21.

Die computergestützte Spermienanalyse (CASA) wurde ursprünglich für Säugetiere entwickelt. CASA ist eine schnelle quantitative Methode zur Beurteilung der Spermienqualität durch automatisierte Aufzeichnung und Messung von Geschwindigkeit und Flugbahn¹⁵. Bei Fischen wurde es bei verschiedenen Arten eingesetzt, um die Auswirkungen mehrerer Wasserschadstoffe auf die Spermienqualität zu überwachen, interessante Vorläufer zur Verbesserung des Brutbestands zu identifizieren, die Effizienz der Kryokonservierung und -lagerung zu verbessern und die Bedingungen für die Befruchtung zu optimieren¹⁵. Daher ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur zuverlässigen Beurteilung der Spermienqualität bei verschiedenen Wirbeltierarten. Aufgrund der großen Vielfalt der Fortpflanzungsstrategien zwischen den Fischen unterscheidet sich das Sperma von Teleostfischen jedoch von dem von Säugetieren und von einer Fischart zur anderen. Teleostfische, die Eier hauptsächlich äußerlich befruchten, indem sie Gameten ins Wasser abgeben, haben hochkonzentrierte Spermien, die relativ einfach in der Struktur ohne Akrosom sind, im Gegensatz zu Säugetieren, die intern düngen und daher die Verdünnung in Wasser nicht kompensieren müssen, sondern viskoseren Flüssigkeiten standhalten^{müssen 14}. Darüber hinaus bewegen sich die Spermien der meisten Fische schnell, sind aber für weniger als 2 Minuten nach der Aktivierung vollständig beweglich, obwohl es mehrere Ausnahmen^{gibt 15,22}. Da die Motilität bei den meisten Fischen schnell abnehmen kann, sollte bei der Festlegung eines Spermienanalyseprotokolls für Fische äußerste Vorsicht beim Zeitpunkt der Analyse nach der Aktivierung geboten sein.

Die Fortpflanzung ist eines der Gebiete in der Biologie, in denen Teleosts und Medaka ausgiebig als Modellorganismen eingesetzt wurden. In der Tat zeigen Medaka-Männchen interessante reproduktive und soziale Verhaltensweisen, wie z.B. Mate Guarding^23,24. Darüber hinaus existieren mehrere transgene Linien, um die neuroendokrine Kontrolle der Fortpflanzung bei dieser Spezies^{zu untersuchen 25,26,27}. Die Spermienprobenahme, ein Verfahren, das bei größeren Fischen relativ einfach ist, kann bei kleinen Modellfischen komplizierter sein, da sie weniger Spermien produzieren und empfindlicher sind. Aus diesem Grund extrahieren die meisten Studien mit Spermienentnahme in Medaka Milz (Fischsamen) durch Zerkleinern von sezierten Hoden 17,28,29,30. Einige Studien verwenden auch eine modifizierte Bauchmassage, um die Milz direkt in das aktivierende Medium^18,19,20 auszudrücken; Mit dieser Methode ist es jedoch schwierig, die Menge und Farbe der extrahierten Milz zu visualisieren. Bei Zebrafischen wird die Bauchmassage häufig verwendet, um Milz auszudrücken, die sofort in einem Kapillarrohr^31,32,33 gesammelt wird. Diese Methode ermöglicht die Abschätzung des Milzvolumens sowie die Beobachtung der Ejakulatfarbe, die ein schneller und einfacher Indikator für die Spermienqualität^{ist 32,33}. Daher fehlt für Medaka ein klares und gut beschriebenes Protokoll für die Spermienentnahme und -analyse.

Dieser Artikel beschreibt daher zwei Methoden der Spermiengewinnung im kleinen Modellfisch Japanese Medaka: Hodendissektion und Bauchmassage mit Kapillarschläuchen. Es zeigt, dass beide Ansätze für Medaka machbar sind und zeigt, dass die Bauchmassage mehrmals durchgeführt werden kann, da sich der Fisch schnell von dem Eingriff erholt. Es beschreibt auch ein Protokoll für die computergestützte Spermienanalyse in Medaka, um mehrere wichtige Indikatoren der Medaka-Spermienqualität (Motilität, Progressivität, Langlebigkeit und relative Spermienkonzentration) zuverlässig zu messen. Diese Verfahren, die für dieses nützliche kleine Teleostmodell spezifiziert wurden, werden das Verständnis der umweltbedingten, physiologischen und genetischen Faktoren, die die Fruchtbarkeit bei männlichen Wirbeltieren beeinflussen, erheblich verbessern.

Protokoll

Alle Experimente und der Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen zum experimentellen Tierschutz an der Norwegischen Universität für Biowissenschaften (NMBU) durchgeführt. Die Experimente wurden mit erwachsenen (6-9 Monate alten) männlichen japanischen Medaka (Hd-rR-Stamm) durchgeführt, die am NMBU (Ås, Norwegen) aufgezogen wurden. Die Methoden wurden auch kurz an 9 Monate alten männlichen japanischen Medaka (CAB-Stamm) getestet, die am Nationalen Forschungsinstitut für Landwirtschaft, Ernährung und Umwelt (INRAE, Rennes, Frankreich) aufgezogen wurden.

1. Geräte- und Lösungsvorbereitung

1. Anästhesie-Stammlösung (0,6% Tricain) vorbereiten.
   1. Verdünnen Sie 0,6 g Tricain (MS-222) in 100 ml 10x Phosphatpuffersalzlösung (PBS).
   2. Aliquot 2 mL der Anästhesie-Stammlösung in 50 2 mL Kunststoffröhrchen und bei -20 °C bis zur Verwendung zur Anästhesie oder Euthanasie lagern.
2. Bereiten Sie Rückgewinnungswasser (0,9% Natriumchlorid [NaCl] -Lösung) vor.
   1. 27 g NaCl in 3 L Aquarienwasser geben.
   2. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei Raumtemperatur (RT).
3. Stellen Sie ggf. das Aktivierungsmedium ein (Hanks ausgewogene Salzlösung [HBSS]).
   HINWEIS: HBSS kann kommerziell erworben oder im Labor hergestellt werden (Materialtabelle).
   1. Messen Sie den pH-Wert des HBSS mit einem pH-Meter. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit Salzsäure oder Natriumhydroxid ein, so dass der endgültige pH-Wert 7,1-7,3 beträgt.
   2. Messen Sie die Osmolalität des HBSS mit einem Osmometer für zukünftige Berichte.
      HINWEIS: Der Bereich des kommerziellen Produkts beträgt 266-294 mOsmol / kg; in der aktuellen Studie betrug die Osmolalität 287 mOsmol/kg. Es kann mit destilliertem Wasser verdünnt werden, um die Osmolalität zu reduzieren, falls gewünscht, aber dies ist nicht notwendig, da es keinen großen Unterschied in der Aktivierung von Medaka-Spermien in 150-300 mOsmol / kg HBSS gibt.
   3. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei RT.
4. Bereiten Sie den Halteschwamm vor.
   1. Schneiden Sie einen weichen Schwamm so ab, dass er eng in eine Petrischale passt.
   2. Schneiden Sie eine gerade Linie in die Mitte des Schwamms, die lang genug ist, um den Fisch aufzunehmen (3-4 cm) und etwa 1 cm tief ist (Abbildung 1A). Dieser Schlitz im Schwamm hält die Fischseite ventral nach oben, um die Kloake freizulegen.

2. Samenentnahme

HINWEIS: Die Spermienentnahme kann durch zwei verschiedene Methoden erreicht werden: Bauchmassage oder Hodendissektion.

1. Samenentnahme durch Bauchmassage
   1. Bereiten Sie eine 0,03% ige Anästhesielösung vor, indem Sie ein Röhrchen Tricainbrühe (0,6%) in 38 ml Aquarienwasser in einem 100-ml-Glasbehälter verdünnen.
   2. Bereiten Sie die Instrumente vor, einschließlich einer glatten stumpfen Pinzette und einer kalibrierten 10-μL-Einweg-Glasmikropipette und einer Ansaugröhre (Abbildung 1A). Befeuchten Sie den in Schritt 1.4 vorbereiteten Halteschwamm mit der Narkoselösung.
   3. Röhrchen mit 36 μL der aktivierenden Lösung für die sofortige Analyse vorbereiten. Die aktivierende Lösung in einem auf 27 °C eingestellten Wasserbad oder Inkubator für mindestens 5 min vorheizen.
      HINWEIS: Obwohl Proben von einzelnen Fischen analysiert werden können, kann die individuelle Variation reduziert werden, indem Proben von mehreren männlichen Tieren in derselben aktivierenden Lösung zusammengefasst werden. Wenn Sie Proben von mehreren Fischen poolen, verwenden Sie 36 μL Aktivierungslösung pro Fisch. Diese Verdünnung muss möglicherweise abhängig von der Belastung oder den Aufzuchtbedingungen des verwendeten Medaka angepasst werden, da diese Faktoren die Spermienkonzentration und das Volumen beeinflussen können. Das CASA-Programm zeigt an, ob die Konzentration zu hoch ist, um Spermien zu identifizieren.
   4. Betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-90 s in eine Betäubungslösung geben.
      HINWEIS: Die Anästhesiedauer muss angepasst werden, da sie je nach Größe des Fisches variiert. Um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig betäubt ist, kneifen Sie den Schwanzstiel vorsichtig mit einer Pinzette. Wenn der Fisch nicht reagiert, kann die Massage gestartet werden.
   5. Nehmen Sie den Fisch aus der Anästhesielösung und verwenden Sie ein Papiertuch oder wischen Sie vorsichtig ab, um den Bauch des Fisches zu trocknen. Legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben in den Trog des feuchten Schwamms, so dass seine Kiemen der Anästhesielösung im Schwamm ausgesetzt sind (Abbildung 1B).
   6. Wenn der Bereich um die Kloake nass ist, trocknen Sie die Unterseite des Fisches vorsichtig mit einem Einwegtuchtuch.
   7. Legen Sie den Fisch in den Halteschwamm unter ein Seziermikroskop und legen Sie die Mikropipette mit einem Ansaugrohr gegen die Kloake des Fisches (Abbildung 1C).
   8. Massieren Sie den Bauch des Fisches, indem Sie ihn sanft mit einer stumpfen glatten Pinzette in einer rostralen bis kaudalen Bewegung zusammendrücken und gleichzeitig saugen, um die ausgestoßene Milz in die Pipette zu sammeln (Abbildung 1D).
   9. Lassen Sie die Fische vom Schwamm in das Erholungswasser fallen. Lassen Sie sie mindestens 15 Minuten in der Lösung erholen, bevor Sie sie in das Aquariensystem zurückbringen.
   10. Die Milz in ein vorbereitetes Röhrchen mit vorgewärmter Aktivierungslösung geben und mehrmals durch Saugen und Blasen am Absaugrohr auf und ab pipettieren.
   11. Homogenisieren Sie das verdünnte Sperma vorsichtig, indem Sie die Röhrchen vor der Analyse schnippen.
       HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, analysieren Sie die Proben sofort (z. B. 5 s) nach der Aktivierung. Bei Medaka kann sich die Analyse gegebenenfalls verzögern, da die Spermien mehrere Stunden beweglich bleiben, aber die Zeit zwischen den Proben sollte konsistent bleiben, da die Motilität mit der Zeit abnimmt.
2. Spermienentnahme durch Hodendissektion
   1. Bereiten Sie 0,08% ige Euthanasielösung vor, indem Sie zwei Röhrchen Tricainbrühe (0,6%) in 26 ml Aquarienwasser in einem 100 ml Glasbehälter verdünnen.
   2. Bereiten Sie Dissektionswerkzeuge vor, einschließlich stumpfer und feiner Pinzetten und kleiner Sezierscheren (Abbildung 1E).
   3. Bereiten Sie für jede Probe ein Röhrchen mit 120 μL Aktivierungslösung für die sofortige Analyse vor. Die aktivierende Lösung in einem auf 27 °C eingestellten Wasserbad oder Inkubator für mindestens 5 min vorheizen.
      HINWEIS: Obwohl Proben von einzelnen Fischen analysiert werden können, kann die individuelle Variation reduziert werden, indem Proben von mehreren männlichen Tieren in derselben aktivierenden Lösung zusammengefasst werden. Verwenden Sie für die Pooling-Proben von mehreren Fischen 120 μL Aktivierungslösung pro Fisch. Diese Verdünnung muss möglicherweise abhängig von der Belastung oder den Aufzuchtbedingungen des verwendeten Medaka angepasst werden, da diese Faktoren die Spermienkonzentration und das Volumen beeinflussen können. Das CASA-Programm zeigt an, ob die Konzentration zu hoch ist, um Spermien zu identifizieren.
   4. Euthanasieren Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-90 s in die 0,08% ige Anästhesielösung geben.
      HINWEIS: Die Dauer hängt von der Größe des Fisches ab. Um sicherzustellen, dass der Fisch eingeschläfert wird, warten Sie, bis die Bewegungen des Operculums aufhören. Der Fisch sollte nicht auf die Berührung einer Pinzette reagieren.
   5. Entfernen Sie den Fisch aus der Euthanasielösung und trocknen Sie den Fisch vorsichtig mit einem Papiertuch oder wischen Sie ihn vorsichtig ab.
      HINWEIS: In diesem Schritt können die Fische gewogen werden, um später den gonadosomatischen Index (GSI, Gonadengewicht / Körpergewicht) zu berechnen.
   6. Legen Sie den Fisch mit der linken seitlichen Seite nach oben unter ein Seziermikroskop (Abbildung 1F).
   7. Schneiden Sie mit einer kleinen Sezierschere einen Lappen dorsal von der Kloake ab und dann über die Rippen zu den Kiemen, um die inneren Organe freizulegen (Abbildung 1G).
   8. Suchen Sie die Hoden, schneiden Sie den Aufsatz an beiden Enden mit einer feinen Pinzette ab, und entfernen Sie die Hoden (Abbildung 1H).
      HINWEIS: Zur Berechnung des GSI können die Hoden in diesem Schritt gewogen werden. Arbeiten Sie schnell, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden.
   9. Die Hoden mit der vorgewärmten Aktivierungslösung in ein vorbereitetes Röhrchen geben.
   10. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hoden mehrmals gegen die Seite der Röhre zu drücken, um das Sperma freizusetzen. Die Spermienfreisetzung kann normalerweise visualisiert werden und macht die Lösung leicht trüb.
   11. Homogenisieren Sie das verdünnte Sperma vorsichtig, indem Sie die Röhrchen vor der Analyse schnippen.
       HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, analysieren Sie die Proben sofort (z. B. 5 s) nach der Aktivierung. Bei Medaka kann sich die Analyse gegebenenfalls verzögern, da die Spermien mehrere Stunden beweglich bleiben, aber die Zeit zwischen den Proben sollte konsistent bleiben, da die Motilität mit der Zeit abnimmt.

Abbildung 1: Milzentnahme durch Bauchmassage (A-D) und Hodendissektion (E-H). (A) Instrumente für die Bauchmassage: Halteschwamm, stumpfe glatte Pinzette und 10 μL Einweg-kalibrierte Glasmikropipette mit Absaugrohranordnung; (B) Position der Fische im Haltungsschwamm, wobei die Betäubungskiemen im Schwamm und in der Kloake nach oben zeigen; (C) Position der stumpfen glatten Pinzette auf dem Bauch und Mikropipette gegen Kloake; (D) Milzen in Mikropipette nach sanfter Massage und Saugen. (E) Instrumente zur Hodendissektion: stumpfe Pinzetten, feine Pinzetten und kleine Sezierscheren; (F) Position der Fische für die Hodendissektion; (G) Seitenansicht der inneren Organe; (H) Entfernen Sie die Hoden, indem Sie den Aufsatz an beiden Enden mit einer feinen Pinzette schneiden. Maßstabsleiste: 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Spermienanalyse mit CASA-System

1. Das CASA-System (SCA Evolution) sollte gemäß Handbuch mit einem Mikroskop mit grünem Filter und 10x-Objektiv mit Phasenkontrast eingerichtet werden.
2. Bereiten Sie Einweg-20 μm Zählkammerobjektträger durch Vorwärmen auf einer Wärmeplatte oder in einem auf 27 °C eingestellten Inkubator für mindestens 5 min vor.
3. Öffnen Sie die Spermienanalyse-Software und wählen Sie das Motilitätsmodul.
4. Legen Sie die Konfiguration für die Medaka fest, wie in Abbildung 2B dargestellt.
5. Legen Sie einen vorgewärmten Einweg-20 μm Zählkammerobjektträger unter das Mikroskop auf einen auf 27 °C eingestellten Heiztisch.
6. Pipettieren Sie die Probe in die Kammer auf dem Objektträger, bis sie die Kammer ohne Überfüllung füllt. Wischen Sie überschüssige Proben vorsichtig mit einer Baumwollspitze vom Eingang der Kammer ab oder wischen Sie vorsichtig ab, um schwimmende Zellen zu vermeiden.
7. Wählen Sie Analysieren , um die Probe unter dem Mikroskop zu betrachten.
   HINWEIS: Wenn das Mikroskopsymbol rot ist, muss die Mikroskopbeleuchtung angepasst werden, damit das Programm Spermien genau verfolgt. Stellen Sie die Helligkeit des Mikroskops so ein, dass die Schwanzbewegung der Spermien deutlich zu sehen ist. Das Symbol sollte blau sein.
8. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop fokussiert ist, und wählen Sie erneut Analysieren , um die Spermien im Feld aufzuzeichnen. Verschieben Sie die Folie so, dass sich ein neuer Bereich der Probe im Rahmen befindet, und wiederholen Sie den Vorgang für 3-5 verschiedene Sichtfelder. Vermeiden Sie Felder mit Luftblasen, Zellmassen oder Artefakten.
9. Wählen Sie Ergebnisse aus, um die Ergebnisse anzuzeigen.
   HINWEIS: Wenn die Felder auf der Ergebnisseite rot umrandet sind, folgen Sie den Anweisungen des Systems, um die Felder zu löschen, die sich zu sehr in Konzentration oder Motilität unterscheiden.
10. Doppelklicken Sie auf ein Feld, um die Ergebnisse für das einzelne Feld anzuzeigen oder manuell nach falsch beschrifteten oder nicht verfolgten Spermatozoen zu suchen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf einzelne Spermatozoen, um die Motilität bei Bedarf neu zu kennzeichnen (Abbildung 2A).

Abbildung 2: Screenshot der SCA Evolution-Software . (A) Ergebnisse der Spermienverfolgung für ein Feld. Zeigen Sie Felddaten auf der rechten Seite an und doppelklicken Sie auf Spermatozoen, um einzelne Daten anzuzeigen. (B) Ergebnisübersicht für alle Felder mit geöffnetem Konfigurationsmenü. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergebnisse

Art der erhaltenen Daten
Die Spermienmotilitätsanalyse der SCA Evolution-Software liefert Daten zur Motilität (Prozentsatz der beweglichen und unbeweglichen Spermien) sowie zur Progressivität (Prozentsatz der progressiven und nicht progressiven Spermien) und zur Geschwindigkeit (Prozentsatz der schnellen, mittleren und langsam beweglichen Spermien). Es kombiniert auch Progressivität und Geschwindigkeit (schnell progressiv, mittel progressiv, nicht progressiv). Diese Bezeichnungen basieren auf Mess...

Diskussion

Osmolalität ist ein wichtiger Faktor bei der Aktivierung von Fischspermien^36,37. Im Allgemeinen sind Spermien in den Hoden unbeweglich und werden beweglich in Medien, die im Verhältnis zur Samenflüssigkeit für Meeresfische hyperosmotisch und bei Süßwasserfischen hypoosmotisch relativ zur Samenflüssigkeit sind³⁷. Ähnlich wie Blut ist das Samenplasma bei Süßwasserfischen typischerweise niedriger als bei Meeresfischen (etwa 300 mOsm...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tubes	Axygen	MCT-150-C	Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly	Drummond	2-000-010
10x objective with phase contrast	Nikon	MRP90100
2 mL tubes	Axygen	MCT-200-c-s	Any standard brand can be used
Blunt forceps	Fine Science Tools	11000-12
Blunt smooth forceps	Millipore	XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide	Microptic	20.2.25	Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope	Olympus	SZX7	Any standard brand can be used
Fine forceps	Fine Science Tools	11253-20
HBSS	Sigmaaldrich	H8264-1L
Holding sponge	self-made
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ts2R
SCA Evolution	Microptic
Small dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
Sodium Chloride (NaCl)	Sigmaaldrich	S9888
Tabletop vortex	Labnet	C1301B
Tricaine	Sigmaaldrich	A5040