Un modelo de ratón de intubación orotraqueal y cirugía de reperfusión de isquemia pulmonar ventilada

Resumen

Un modelo quirúrgico de ratón para crear una lesión por isquemia de reperfusión (RI) del pulmón izquierdo mientras se mantiene la ventilación y se evita la hipoxia.

Resumen

La lesión por isquemia de reperfusión (RI) con frecuencia resulta de procesos que implican un período transitorio de flujo sanguíneo interrumpido. En el pulmón, la RI aislada permite el estudio experimental de este proceso específico con ventilación alveolar continua, evitando así los procesos perjudiciales compuestos de hipoxia y atelectasia. En el contexto clínico, la lesión por isquemia pulmonar por reperfusión (también conocida como IRI pulmonar o LIRI) es causada por numerosos procesos, que incluyen, entre otros, embolia pulmonar, traumatismo hemorrágico resucitado y trasplante pulmonar. Actualmente hay opciones de tratamiento efectivas limitadas para LIRI. A continuación, presentamos un modelo quirúrgico reversible de IR pulmonar que incluye la primera intubación orotraqueal seguida de isquemia pulmonar izquierda unilateral y reperfusión con ventilación alveolar preservada o intercambio gaseoso. Los ratones se someten a una toracotomía izquierda, a través de la cual la arteria pulmonar izquierda se expone, visualiza, aísla y comprime usando un nudo deslizante reversible. La incisión quirúrgica se cierra durante el período isquémico, y el animal es despertado y extubado. Con el ratón respirando espontáneamente, la reperfusión se establece liberando el nudo deslizante alrededor de la arteria pulmonar. Este modelo de supervivencia clínicamente relevante permite la evaluación de la lesión pulmonar IR, la fase de resolución, los efectos posteriores sobre la función pulmonar, así como los modelos de dos golpes que involucran neumonía experimental. Si bien técnicamente es un desafío, este modelo se puede dominar en el transcurso de unas pocas semanas o meses con una eventual tasa de supervivencia o éxito del 80% -90%.

Introducción

La lesión por isquemia reperfusión (RI) puede ocurrir cuando se restablece el flujo sanguíneo a un órgano o lecho de tejido después de un período de interrupción. En el pulmón, la RI puede ocurrir de forma aislada o en asociación con otros procesos perjudiciales como infección, hipoxia, atelectasia, volutrauma (por volúmenes corrientes altos durante la ventilación mecánica), barotrauma (altas presiones máximas o sostenidas durante la ventilación mecánica) o lesión por contusión pulmonar contundente (no penetrante) ^1,2,3 . Sigue habiendo varias lagunas en el conocimiento acerca de los mecanismos de LIRI y el impacto de los procesos concurrentes (p.ej., infección) en los resultados de LIRI, y también las opciones de tratamiento para LIRI son limitadas. Se requiere un modelo in vivo de LIRI puro para identificar la fisiopatología de la lesión pulmonar IR de forma aislada y para estudiar su contribución a cualquier proceso de múltiples golpes del cual la lesión pulmonar sea un componente.

Los modelos de IR pulmonar murina se pueden utilizar para estudiar la fisiopatología específica del pulmón de múltiples procesos, incluido el trasplante pulmonar³, la embolia pulmonar⁴ y la lesión pulmonar después de un traumatismo hemorrágico con reanimación⁵. Los modelos utilizados actualmente incluyen trasplante quirúrgico de pulmón⁶, pinzamiento hiliar⁷, perfusión pulmonar ex vivo ⁸ y pulmón ventilado IR⁹. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para un modelo IR pulmonar ventilado murino de lesión pulmonar estéril. Hay múltiples beneficios de este enfoque (Figura 2), incluyendo que induce hipoxia mínima y atelectasia mínima, y es un modelo de cirugía de supervivencia que permite estudios a largo plazo.

Las razones para elegir este modelo de LIRI sobre otros modelos como el pinzamiento hiliar y los modelos de perfusión ex vivo son las siguientes: este modelo minimiza las contribuciones inflamatorias de la atelectasia, la ventilación mecánica y la hipoxia; preserva la ventilación cíclica; mantiene intacto el sistema inmunitario circulatorio in vivo que puede responder a la lesión IR; y, por último, como procedimiento de supervivencia, permite el análisis a más largo plazo de los mecanismos de generación de lesiones secundarias (modelos de 2 golpes) y la resolución de lesiones. En general, creemos que este modelo IR de pulmón ventilado proporciona la forma "más pura" de lesión IR que se puede estudiar experimentalmente.

Otras publicaciones han descrito el uso de la intubación orotraqueal de ratones para realizar inyecciones o instalaciones IT^10,11, pero no como punto de partida para una cirugía de supervivencia como lo es en este modelo. La colocación de un tubo orotraqueal permite la realización de la cirugía pulmonar al permitir el colapso del pulmón operatorio. También permite la reinflación del pulmón al final del procedimiento, lo cual es crítico para el neumotórax y para la capacidad del ratón para volver a la ventilación espontánea al final de los procedimientos. Finalmente, la extracción del tubo orotraqueal asegurado es un procedimiento simple que, a diferencia de una traqueotomía invasiva, es compatible con una cirugía de supervivencia. Esto permite estudios de investigación a largo plazo centrados en la comprensión de la progresión y resolución de LIRI y trastornos asociados, así como la creación de modelos de lesiones crónicas.

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Protocolo

Todos los procedimientos y pasos descritos a continuación fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de California en San Francisco. Se puede utilizar cualquier cepa de ratón, aunque algunas cepas tienen una respuesta inflamatoria IR pulmonar más robusta en comparación con otras¹². Los ratones que tienen aproximadamente 12-15 semanas de edad (30-40 g) o más toleran y sobreviven a la cirugía IR pulmonar mejor que los ratones más jóvenes. Tanto los ratones machos como las hembras se pueden usar para estas cirugías.

1. Protocolo de intubación del ratón

1. Anestesia y preparación para la intubación
   1. Limpie el abdomen del ratón con un hisopo de etanol. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de tribromoetanol (250-400 mg/kg). Evaluar la profundidad apropiada de la anestesia por la falta de reflejo de retirada del pedal. Coloque la pomada lubricante para los ojos ahora o más tarde (paso 2.1.4).
      NOTA: Para este procedimiento, el tribromoetanol (y el etomidato como una opción alternativa) proporciona un plano anestésico estable sin afectar las condiciones hemodinámicas requeridas para esta cirugía. Este anestésico solo se usa una vez para evitar el riesgo de adherencias peritoneales. El isoflurano también podría usarse, pero no lo usamos aquí. El practicante es libre de usar cualquier receta anestésica que considere adecuada.
   2. Coloque el ratón anestesiado en un soporte de intubación o soporte de plástico en posición supina, suspendido por sus incisivos superiores en suturas 4-0 en bucle (seda u otras) a través de dos anclajes de soporte.
   3. Para mantener al ratón inmovilizado durante el procedimiento de intubación, pegue con cinta adhesiva la parte inferior del tórax (o ambas extremidades superiores) a la plataforma.
   4. Coloque la luz flexible de fibra óptica suavemente sobre la tráquea del ratón, ligeramente por debajo de las cuerdas vocales. Ajuste el nivel de iluminación para que solo se vea un campo oscuro cuando se mira dentro de la orofaringe del ratón, excepto la luz roja que emana de debajo de las cuerdas vocales, demostrando el objetivo para la eventual colocación del tubo endotraqueal. Tenga en cuenta que los movimientos de las cuerdas vocales deben ser visibles a simple vista o, si es necesario, bajo aumento.
2. Procedimiento de intubación
   1. Sostenga las pinzas con la mano dominante y úselas para agarrar suavemente y sacar la lengua de la cavidad oral.
   2. Abra la mandíbula inferior con fórceps sostenidos por la mano no dominante y luego empuje los fórceps hacia la laringe para levantar suavemente la epiglotis. En este momento, suelte la lengua de las pinzas.
   3. Busca las cuerdas vocales. Deben abrirse y cerrarse de acuerdo con cada respiración. Sosteniendo la cánula con el alambre guía precargado, inserte la punta del cable a través de las cuerdas vocales.
   4. Teniendo mucho cuidado de no mover el alambre sosteniendo una porción que está fuera de la cánula pero justo por encima de las cuerdas vocales, retire la cánula, dejando solo el cable en su lugar con su extremo distal dentro de la tráquea.
   5. En este punto, realice una segunda visualización de las cuerdas vocales para confirmar que la punta distal del alambre permanece pasada a través de las cuerdas vocales iluminadas y hacia la tráquea, y no está en el esófago no iluminado.
   6. Sostenga el alambre fuera de la boca con las pinzas curvas en la mano izquierda, estabilizado contra una superficie dura, y avance cuidadosamente el catéter 20G con alas de cinta sobre el cable.
   7. Una vez que el extremo distal del alambre emerja del extremo posterior del catéter 20G o tubo endotraqueal, sostenga ese extremo con los fórceps curvos y avance suavemente el catéter 20G hacia la tráquea.
   8. Retire con cuidado el cable del extremo distal del catéter 20G con las pinzas curvas sin desalojar la colocación del catéter.
   9. Conecte brevemente el catéter al ventilador antes de asegurarlo para confirmar la colocación adecuada en la tráquea y no en el esófago. Confirmar la colocación traqueal mediante la observación de movimientos bilaterales de la pared torácica dependientes de la ventilación mecánica y la ausencia de inflado del estómago.
3. Post-intubación
   1. Desconecte el catéter del ventilador. Fije las alas de la cinta (unidas al catéter) a través del labio inferior del ratón con una sutura de vicryl 4-0 para asegurar firmemente el tubo endotraqueal (ETT) al ratón durante todos los procedimientos/manipulaciones posteriores.
      NOTA: Alternativamente, se puede usar cinta de seda u otra cinta para asegurar el ETT, sin embargo, se debe tener cuidado para evitar el desplazamiento del ETT durante el movimiento del animal desde el trineo de intubación hasta la superficie quirúrgica.
   2. Retire con cuidado el ratón del trineo de intubación. Conecte brevemente el catéter al ventilador configurado a un volumen tidal de 0.2-0.225 ml y una frecuencia respiratoria de 120-150 respiraciones por minuto para confirmar la colocación traqueal correcta del tubo orotraqueal y luego desconecte con el ratón respirando espontáneamente a través del tubo orotraqueal.
   3. No deje al animal desatendido a partir de este momento hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal al final del procedimiento.

2. Protocolo quirúrgico de isquemia pulmonar y reperfusión (RI)

1. Analgesia y preparación del sitio quirúrgico
   1. Limpie el abdomen del ratón con un hisopo de etanol e inyecte buprenorfina (0.05-0.1 mg / kg) por vía intraperitoneal.
   2. Afeite el vello sobre el área izquierda del tórax hasta la escápula izquierda. Elimine el exceso de vello afeitado con hisopos con alcohol.
      NOTA: Los pasos 2.1.1 y 2.1.2 también se pueden realizar antes de la intubación si existe preocupación por el desplazamiento del ETT cuando se asegura con cinta de seda.
   3. Coloque el ratón en una almohadilla de calentamiento en una posición lateral izquierda o 3/4 girada y conecte el tubo traqueal en el ventilador con un volumen corriente de 0.2-0.225 ml (~ 8 mg / kg) y una frecuencia respiratoria de 120-150 respiraciones por minuto. No use oxígeno suplementario para este procedimiento.
   4. Aplique lubricante para los ojos con un hisopo estéril de punta de algodón. Gire el ratón a 3/4 del lado izquierdo hacia arriba e inmovilice las cuatro extremidades y la cola con cinta de laboratorio.
   5. Desinfecte el área de la piel afeitada y el pelaje circundante con povidona yodada y espere a que la solución se seque. Luego cubra el campo quirúrgico con una cortina estéril o una película de plástico transparente y cree una abertura rectangular en la cortina o película plástica para el campo quirúrgico.
2. Procedimiento quirúrgico
   1. Confirme el nivel apropiado de anestesia (proporcionado por la administración de tribromoetanol y buprenorfina como se describió anteriormente) mediante la prueba de respuesta al pellizco del dedo del pie.
   2. Usando un par de tijeras afiladas y un par de pinzas más grandes (pinzas de patrón estrecho o similares), haga una incisión transversal de piel de 2 cm por debajo del ángulo inferior de la escápula en el tórax lateral izquierdo. Use las tijeras y un par más fino de fórceps (pinzas graefe extra finas o similares) para cortar la capa muscular y diseccionar hasta las costillas.
   3. Identifique el segundo espacio intercostal y sostenga la segunda costilla con las pinzas extra finas. Tirando de la costilla hacia arriba, use una hoja de bisturí estéril #11 o #12 (curva) (sin necesidad de mango) para ingresar al espacio pleural separando y cortando los músculos intercostales del espacio 2º-3º. Considere pausar la ventilación para reducir la lesión en el ápice pulmonar izquierdo.
   4. Inserte tres retractores esterilizados. Use la cefalada retractora más pequeña/más estrecha a lo largo de la orientación de las costillas, el retractor de tamaño mediano a la izquierda a lo largo de la 2ª costilla y el retractor más grande a la derecha a lo largo de la superficie de la^3ª costilla.
   5. Abra el pecho con una retracción lenta y progresiva utilizando los cordones retractores elásticos. Exponga e identifique la arteria pulmonar izquierda (PA) alejando el ápice pulmonar izquierdo con un hisopo estéril de punta de algodón.
   6. Use los micro fórceps, los fórceps ultrafinos en la mano derecha y la PA o las pinzas dilatadoras de vasos en la mano izquierda, para exponer suavemente y crear el campo en el que la PA izquierda y el bronquio son visibles.
   7. Usando los fórceps de PA, levante el PA izquierdo y tire suavemente pero firmemente hacia arriba y cefálico para visualizar el bronquio transparente debajo. Aumente el aumento en el microscopio de disección (consulte la lista de equipos para obtener más detalles) en este punto hasta el máximo (2x).
      NOTA: Esterilice todo el equipo antes de usarlo. Además, para mantener la esterilidad, solo las puntas de los instrumentos quirúrgicos deben ingresar al campo quirúrgico estéril.
   8. Mientras retrae la PA lejos del bronquio, pase cuidadosamente las pinzas ultrafinas cerradas a través del espacio entre la PA izquierda y el bronquio. Luego, use estos fórceps para sostener y tirar de un 7-0 u 8-0 Sutura de Proleno a través del espacio entre la arteria pulmonar izquierda (arriba) y el bronquio (abajo).
   9. Rodee el PA izquierdo atando un nudo deslizante para crear una oclusión en el PA. La interrupción del flujo sanguíneo se visualiza fácilmente bajo el microscopio. Esto marca el inicio del período isquémico.
   10. Externalice el extremo libre del nudo a través de un punto de entrada diferente en el tórax izquierdo anterior con una aguja 24G-28G y asegure el extremo de la sutura con un pequeño trozo de cinta para facilitar la identificación más adelante.
   11. Vuelva a inflar el pulmón para expulsar la mayor cantidad de aire posible de la cavidad torácica utilizando una válvula / tubo PEEP en el ventilador para roedores. Luego, cierre la caja torácica con dos suturas de nylon 4-0 interrumpidas.
   12. Cierre el músculo y la capa subcutánea con una sutura de nylon 4-0. Luego aplique dos o tres gotas de bupivacaína tópica (0.5%) en la incisión. Use una sutura de nylon 4-0 para cerrar la capa de piel con una sutura para correr.
3. Cuidados postoperatorios
   1. Cuando se haya reanudado la ventilación espontánea, desconecte el tubo endotraqueal del ventilador y extube al ratón.
   2. Coloque el ratón en la almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal durante la recuperación temprana posterior a la anestesia.
   3. Controle cuidadosamente al ratón mientras se recupera de la anestesia general. Tire del nudo deslizante exteriorizado suavemente al final del período isquémico (30 min o 1 h).
   4. Mueva el ratón de la almohadilla de calentamiento a una jaula una vez que haya mostrado signos de recuperación: autoenderezamiento y/o movimiento.
   5. Después del período de reperfusión (1 h o 3 h), sacrificar al animal y recolectar sangre por punción cardíaca y tejido pulmonar para su posterior análisis. Para 1 h de reperfusión, recolectar plasma para ELISA, tejido para ARN y análisis de proteínas; Para la reperfusión de 3 h, además recolectar tejido para histología.

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Resultados

Inflamación generada por lesión unilateral ventilada estéril por isquemia pulmonar (RI): Después de 1 h de isquemia, observamos un aumento de los niveles de citoquinas en el suero y dentro del tejido pulmonar tanto por ELISA como por qRT-PCR que alcanzó su punto máximo a 1 h después de la reperfusión y regresó rápidamente a la línea de base dentro de las 12-24 h después de la reperfusión¹³. Para las muestras recogidas a las 3 h después de la reperfusión, observamos una intensa infil...

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Discusión

Este manuscrito detalla los pasos involucrados en la realización del modelo IR de pulmón ventilado desarrollado por Dodd-o et ^al.9. Este modelo ha ayudado a identificar vías moleculares implicadas en la generación y resolución de la inflamación de la RI pulmonar aislada 14,15,16,17, la RI pulmonar en combinación con la infección coexistente 18, y la RI pulmonar en relación con el eje intestino-pulmón y la contribución del microbioma intestinal^13...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle