Orotracheal 삽관 및 환기 폐 허혈 재관류 수술의 마우스 모델

요약

환기를 유지하고 저산소증을 피하면서 왼쪽 폐 허혈 재관류 (IR) 손상을 만드는 마우스 수술 모델.

초록

허혈 재관류 (IR) 손상은 종종 일시적인 혈류 중단을 포함하는 과정에서 발생합니다. 폐에서 격리 된 IR은 지속적인 폐포 환기와 함께이 특정 과정에 대한 실험적 연구를 허용하여 저산소증과 무기폐의 복잡한 해로운 과정을 피할 수 있습니다. 임상적 맥락에서 폐허혈 재관류 손상(폐 IRI 또는 LIRI라고도 함)은 폐색전증, 소생출혈성 외상 및 폐 이식을 포함하되 이에 국한되지 않는 수많은 과정에 의해 유발됩니다. 현재 LIRI에 대한 효과적인 치료 옵션은 제한적입니다. 여기에서는 첫 번째 구강 기관 삽관에 이어 편측성 좌측 폐 허혈 및 보존된 폐포 환기 또는 가스 교환을 통한 재관류를 포함하는 폐 IR의 가역적 수술 모델을 제시합니다. 마우스는 왼쪽 개흉술을 받는데,이를 통해 왼쪽 폐동맥이 노출되고, 시각화되고, 분리되고, 가역적 인 슬립 매듭을 사용하여 압축됩니다. 그런 다음 허혈성 기간 동안 수술 절개를 닫고 동물을 깨우고 발관합니다. 마우스가 자발적으로 호흡하면 폐동맥 주위의 슬립 매듭을 풀어 재관류가 이루어집니다. 이 임상적으로 관련된 생존 모델은 폐 IR 손상, 해결 단계, 폐 기능에 대한 다운스트림 효과 및 실험적 폐렴과 관련된 2-hit 모델의 평가를 허용합니다. 기술적으로 어렵지만 이 모델은 몇 주에서 몇 달에 걸쳐 마스터할 수 있으며 최종 생존율 또는 성공률은 80%-90%입니다.

서문

허혈 재관류 (IR) 손상은 일정 기간의 중단 후 혈류가 장기 또는 조직 베드로 회복 될 때 발생할 수 있습니다. 폐에서 IR은 감염, 저산소증, 무기폐, 부피 외상(기계적 환기 중 높은 일회 호흡량), 기압 외상(기계적 환기 중 높은 피크 또는 지속적인 압력) 또는 둔기(비관통) 폐 타박상 손상 ^1,2,3과 같은 다른 유해한 과정과 관련하여 단독으로 또는 발생할 수 있습니다. . LIRI의 메커니즘과 동시 프로세스(예: 감염)가 LIRI 결과에 미치는 영향에 대한 지식에는 몇 가지 격차가 남아 있으며 LIRI에 대한 치료 옵션도 제한적입니다. 순수한 LIRI의 생체 내 모델은 폐 IR 손상의 병태생리학을 단독으로 식별하고 폐 손상이 구성 요소인 다중 히트 과정에 대한 기여도를 연구하는 데 필요합니다.

쥐 폐 IR 모델은 폐 이식³, 폐색전증⁴ 및 소생술을 동반한 출혈성 외상 후 폐 손상⁵을 포함한 여러 과정의 폐 특이적 병태생리학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 현재 사용되는 모델에는 외과적 폐 이식6, 힐라 클램핑⁷, 체외 폐 관류⁸ 및 환기 폐 IR⁹가 포함됩니다. 여기에서, 우리는 멸균 폐 손상의 뮤린 환기 폐 IR 모델에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 접근법에는 최소 저산소증과 최소 무기폐를 유도하고 장기 연구를 허용하는 생존 수술 모델을 포함하여 여러 가지 이점이 있습니다 (그림 2).

힐라 클램핑 및 체외 관류 모델과 같은 다른 모델보다 LIRI 모델을 선택하는 이유는 다음과 같습니다. 이 모델은 무기폐, 기계적 환기 및 저산소증의 염증성 기여를 최소화합니다. 주기적 환기를 보존합니다. IR 손상에 반응할 수 있는 온전한 생체 내 순환 면역 체계를 유지하고; 마지막으로 생존 절차로서 2차 부상 생성(2히트 모델) 및 부상 해결 메커니즘에 대한 장기 분석이 가능합니다. 전반적으로, 우리는이 환기 된 폐 IR 모델이 실험적으로 연구 할 수있는 "가장 순수한"형태의 IR 손상을 제공한다고 믿습니다.

다른 간행물에서는 IT 주사 또는 설치^10,11을 수행하기 위해 마우스의 구강 기관 삽관을 사용하는 것을 설명했지만이 모델에서와 같이 생존 수술의 출발점은 아닙니다. 구강 기관 튜브의 배치는 수술 폐의 붕괴를 허용함으로써 폐 수술의 수행을 허용합니다. 또한 절차가 끝날 때 폐의 재 팽창을 허용하는데, 이는 기흉과 절차가 끝날 때 마우스가 자발적인 환기로 돌아갈 수있는 능력에 중요합니다. 마지막으로, 고정 된 구강 기관 튜브의 제거는 침습적 기관 절개술과 달리 생존 수술과 호환되는 간단한 절차입니다. 이를 통해 LIRI 및 관련 장애의 진행 및 해결을 이해하고 만성 손상 모델을 만드는 데 중점을 둔 장기 연구 연구가 가능합니다.

프로토콜

아래에 설명 된 모든 절차와 단계는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 모든 마우스 균주를 사용할 수 있지만 일부 균주는 다른 균주에 비해 더 강력한 폐 IR 염증 반응을 보입니다¹². 약 12-15주령(30-40g) 이상인 마우스는 어린 마우스보다 폐 IR 수술을 더 잘 견디고 생존합니다. 수컷과 암컷 마우스 모두 이러한 수술에 사용할 수 있습니다.

1. 마우스 삽관 프로토콜

1. 마취 및 삽관 준비
   1. 에탄올 면봉으로 마우스 복부를 닦으십시오. 트리 브로 모 에탄올 (250-400 mg / kg)의 복강 주사로 마우스를 마취하십시오. 페달 철수 반사의 부족으로 적절한 마취 깊이를 평가하십시오. 눈 윤활 연고를 지금 또는 나중에 두십시오 (2.1.4 단계).
      참고: 이 절차의 경우 트리브로모에탄올(및 대체 옵션으로 에토미데이트)은 이 수술에 필요한 혈역학적 상태에 영향을 미치지 않으면서 안정적인 마취면을 제공합니다. 이 마취제는 복막 유착의 위험을 피하기 위해 한 번만 사용됩니다. 이소플루란도 사용할 수 있지만 여기서는 사용하지 않습니다. 의사는 적합하다고 생각하는 마취법을 자유롭게 사용할 수 있습니다.
   2. 마취된 마우스를 삽관 스탠드 또는 플라스틱 지지대에 앙와위 자세로 놓고 두 개의 지지 앵커에 걸쳐 고리가 있는 4-0 봉합사(실크 또는 기타)에 위쪽 앞니에 매달아 놓습니다.
   3. 삽관 절차 중에 마우스를 고정한 상태로 유지하려면 가슴의 아래쪽(또는 양쪽 상지)을 플랫폼에 느슨하게 테이프로 붙입니다.
   4. 광섬유 유연한 빛을 성대 약간 아래의 마우스 기관에 부드럽게 놓습니다. 성대 아래에서 나오는 붉은 빛을 제외하고 마우스 구인두를 들여다 볼 때 어두운 필드 만 보이도록 조명 수준을 조정하여 기관 내 튜브의 최종 배치 대상을 보여줍니다. 성대의 움직임은 육안으로 또는 필요한 경우 확대하여 볼 수 있어야합니다.
2. 삽관 절차
   1. 지배적 인 손으로 핀셋을 잡고 부드럽게 잡고 구강 밖으로 혀를 빼내는 데 사용하십시오.
   2. 지배적이지 않은 손으로 잡은 집게를 사용하여 아래턱을 연 다음 집게를 후두로 밀어 후두개를 부드럽게 들어 올립니다. 이때 핀셋에서 혀를 풀어줍니다.
   3. 성대를 찾으십시오. 그들은 각 호흡에 따라 열리고 닫혀 야합니다. 가이드 와이어가 미리로드 된 캐뉼러를 잡고 성대를 통해 와이어 끝을 삽입합니다.
   4. 캐뉼라 바깥쪽이 아니라 성대 바로 위에 있는 와이어의 일부를 잡고 와이어를 움직이지 않도록 매우 조심하면서 캐뉼러를 빼내고 기관 내의 말단부가 있는 와이어만 제자리에 둡니다.
   5. 이 시점에서 성대의 두 번째 시각화를 수행하여 와이어 원위 팁이 조명 된 성대를 통과하여 기관으로 전달되고 조명이없는 식도에 있지 않은지 확인하십시오.
   6. 왼손에 구부러진 집게로 와이어를 입 밖으로 잡고 단단한 표면에 고정하고 테이프 날개로 20G 카테터를 와이어 위로 조심스럽게 전진시킵니다.
   7. 와이어의 말단부가 20G 카테터 또는 기관 내 튜브의 뒤쪽 끝에서 나오면 구부러진 집게로 그 끝을 잡고 20G 카테터를 기관으로 부드럽게 전진시킵니다.
   8. 카테터의 배치를 제거하지 않고 구부러진 집게로 20G 카테터의 말단부에서 와이어를 조심스럽게 제거합니다.
   9. 카테터를 고정하기 전에 인공 호흡기에 간단히 연결하여 식도가 아닌 기관에 적절한 배치를 확인하십시오. 기계적 환기에 의존하는 양측 흉벽 움직임과 위 팽창이없는 것을 관찰하여 기관 배치를 확인하십시오.
3. 삽관 후
   1. 인공 호흡기에서 카테터를 분리하십시오. 4-0 vicryl 봉합사를 사용하여 마우스의 아랫입술을 통해 테이프 날개(카테터에 부착됨)를 고정하여 모든 후속 절차/조작 중에 기관 내 튜브(ETT)를 마우스에 단단히 고정합니다.
      알림: 또는 실크 테이프 또는 기타 테이프를 사용하여 ETT를 고정할 수 있지만 삽관 썰매에서 수술 표면으로 동물을 이동하는 동안 ETT가 빠지지 않도록 주의해야 합니다.
   2. 삽관 슬레드에서 마우스를 조심스럽게 제거하십시오. 카테터를 일회 호흡량 0.2-0.225 mL 및 분당 120-150 호흡의 호흡 속도로 설정된 인공 호흡기에 간단히 연결하여 구강 기관 튜브의 올바른 기관 배치를 확인한 다음 구강 기관 튜브를 통해 자발적으로 호흡하는 마우스와 연결을 끊습니다.
   3. 절차가 끝날 때 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지이 시점부터 동물을 방치하지 마십시오.

2. 폐허혈 및 재관류(IR) 수술 프로토콜

1. 진통 및 수술 부위 준비
   1. 에탄올 면봉으로 마우스 복부를 닦고 부 프레 노르 핀 (0.05-0.1 mg / kg)을 복강 내 주사합니다.
   2. 왼쪽 흉부 부위의 머리카락을 왼쪽 견갑골까지 면도하십시오. 알코올 면봉을 사용하여 과도하게 면도한 모발을 제거합니다.
      참고: 2.1.1단계 및 2.1.2단계는 실크 테이프로 고정할 때 ETT가 이탈될 우려가 있는 경우 삽관 전에 수행할 수도 있습니다.
   3. 마우스를 왼쪽 측면 또는 3/4 회전 위치의 온난화 패드에 놓고 인공호흡기의 기관 튜브를 0.2-0.225mL(~8mg/kg)의 일회 호흡량과 분당 120-150회의 호흡수로 연결합니다. 이 절차에는 보충 산소를 사용하지 마십시오.
   4. 멸균 면봉으로 눈 윤활제를 바르십시오. 마우스를 왼쪽으로 3/4 위로 돌리고 실험실 테이프로 네 팔다리와 꼬리를 모두 고정시킵니다.
   5. 면도 한 피부 부위와 주변 모피를 포비돈 요오드로 소독하고 용액이 마를 때까지 기다리십시오. 그런 다음 멸균 드레이프 또는 투명 플라스틱 필름으로 수술 부위를 덮고 수술 부위의 드레이프 또는 플라스틱 필름에 직사각형 개구부를 만듭니다.
2. 수술
   1. 발가락 꼬집음에 대한 반응을 테스트하여 적절한 수준의 마취 (앞에서 설명한 트리브로 모 에탄올 및 부 프레 노르 핀 투여로 제공)를 확인하십시오.
   2. 한 쌍의 날카로운 가위와 한 쌍의 큰 집게 (좁은 패턴 집게 또는 이와 유사한 것)를 사용하여 왼쪽 측면 흉부의 견갑골의 열등한 각도 아래에서 2cm의 가로 피부 절개를하십시오. 가위와 더 미세한 집게 쌍 (초미세 그레이프 집게 또는 이와 유사한 것)을 사용하여 근육층을 자르고 갈비뼈까지 해부하십시오.
   3. 두 번째 늑간 공간을 식별하고 여분의 미세한 집게로 두 번째 갈비뼈를 잡습니다. 갈비뼈를 위로 당기고 멸균 #11 또는 #12(곡선) 메스 블레이드(손잡이 필요 없음)를 사용하여^{2-3번째 공간의 늑}간근을 분리하고 절단하여 흉막 공간으로 들어갑니다. 왼쪽 폐 정점의 손상을 줄이기 위해 환기를 일시 중지하는 것을 고려하십시오.
   4. 3 개의 멸균 된 견인기를 삽입하십시오. 리브의 방향을 따라 가장 작은/가장 좁은 견인기 cephalad를 사용하고, 중간 크기 견인기는 2^번째 리브를 따라 왼쪽으로, 가장 큰 견인기는 3^{번째 리브} 의 표면을 따라 오른쪽에 사용합니다.
   5. 탄성 견인기 코드를 사용하여 느리고 점진적인 수축으로 가슴을여십시오. 멸균 면봉으로 왼쪽 폐 정점을 멀리 이동하여 왼쪽 폐동맥(PA)을 노출하고 식별합니다.
   6. 마이크로 집게, 오른손의 초미세 집게, 왼손의 PA 또는 혈관 확장 집게를 사용하여 왼쪽 PA와 기관지가 모두 보이는 필드를 부드럽게 노출하고 만듭니다.
   7. PA 집게를 사용하여 왼쪽 PA를 들어 올리고 부드럽지만 단단히 위쪽으로 당기고 두부를 당겨 아래의 투명한 기관지를 시각화합니다. 이 시점에서 해부 현미경의 배율(자세한 내용은 장비 목록 참조)을 최대(2x)로 늘립니다.
      알림: 사용하기 전에 모든 장비를 소독하십시오. 또한 불임을 유지하려면 수술 도구의 끝 부분 만 멸균 수술 분야에 들어가야합니다.
   8. PA를 기관지에서 멀어지게하면서 닫힌 초 미세 집게를 왼쪽 PA와 기관지 사이의 공간을 통해 조심스럽게 통과시킵니다. 그런 다음이 집게를 사용하여 7-0 또는 8-0을 잡고 당깁니다. 왼쪽 폐동맥 (위)과 기관지 (아래) 사이의 공간을 통한 Prolene 봉합사.
   9. 슬립 매듭을 묶어 왼쪽 PA를 둘러싸고 PA에 폐색을 만듭니다. 혈류 중단은 현미경으로 쉽게 시각화됩니다. 이것은 허혈성의 시작을 표시합니다.
   10. 24G-28G 바늘을 사용하여 전방 왼쪽 흉부의 다른 진입점을 통해 매듭의 자유 끝을 외부화하고 나중에 쉽게 식별할 수 있도록 작은 테이프로 봉합사의 끝을 고정합니다.
   11. 설치류 인공 호흡기의 PEEP 밸브 / 튜브를 사용하여 가능한 한 많은 공기를 흉강 밖으로 배출하도록 폐를 다시 팽창시킵니다. 그런 다음 두 개의 중단 된 4-0 나일론 봉합사로 흉곽을 닫습니다.
   12. 달리기 4-0 나일론 봉합사로 근육과 피하 층을 닫습니다. 그런 다음 국소 부피 바카 인 (0.5 %)을 절개 부위에 두세 방울 떨어 뜨립니다. 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 흐르는 봉합사로 피부층을 닫습니다.
3. 수술 후 관리
   1. 자발적 환기가 재개되면 인공 호흡기에서 기관 내 튜브를 분리하고 마우스를 발관하십시오.
   2. 마취 후 조기 회복 중에 체온을 유지하기 위해 마우스를 온난화 패드에 놓습니다.
   3. 전신 마취에서 회복하는 동안 마우스를주의 깊게 모니터링하십시오. 허혈성 기간(30분 또는 1시간)이 끝날 때 외부화된 슬립매듭을 부드럽게 당깁니다.
   4. 마우스를 보온화 패드에서 케이지로 옮기면 회복 징후가 보이면 (자기 교정 및 / 또는 움직임).
   5. 재관류 기간 (1 시간 또는 3 시간) 후, 동물을 안락사시키고 추가 분석을 위해 심장 천자 및 폐 조직으로 혈액을 수집합니다. 1 시간 재관류를 위해 ELISA를위한 혈장, RNA를위한 조직 및 단백질 분석을 위해 혈장을 수집하십시오. 3 시간 재관류의 경우 조직학을 위해 조직을 추가로 수집하십시오.

결과

일방적 환기 멸균 폐허혈 재관류(IR) 손상으로 생성된 염증: 허혈 1시간 후, ELISA 및 qRT-PCR 모두에 의해 혈청 및 폐 조직 내 사이토카인 수치가 증가한 것을 관찰했으며, 이는 재관류 후 1시간에 최고조에 달하고 재관류 후 12-24시간 이내에 기준선으로 빠르게 돌아왔습니다¹³. 재관류 후 3 시간에 수집 된 샘플의 경우, 우리는 왼쪽 폐 조직 내에서 강렬한 호중구 침윤을 관찰했으며 염?...

토론

이 원고는 Dodd-o et ^al.9에 의해 개발 된 환기 된 폐 IR 모델을 수행하는 단계를 자세히 설명합니다. 이 모델은 분리 된 폐 IR 14,15,16,17, 공존하는 감염과 결합 된 폐 IR 18, 장-폐 축 및 장내 미생물 군집의 기여와 관련된 폐 IR에서 염증의 생성 및 해결에 관여하는 분자 경로를 식별하는 데 도움이되었습니다^13,18,19

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle