Un modello murino di intubazione orotracheale e chirurgia ventilata di ischemia polmonare riperfusione

Riepilogo

Un modello chirurgico murino per creare lesioni da ischemia polmonare sinistra (IR) mantenendo la ventilazione ed evitando l'ipossia.

Abstract

Il danno da ischemia da riperfusione (IR) deriva frequentemente da processi che comportano un periodo transitorio di interruzione del flusso sanguigno. Nel polmone, l'IR isolata consente lo studio sperimentale di questo specifico processo con ventilazione alveolare continua, evitando così i processi dannosi composti di ipossia e atelettasia. Nel contesto clinico, il danno da ischemia da riperfusione polmonare (noto anche come IRI polmonare o LIRI) è causato da numerosi processi, inclusi ma non limitati a embolia polmonare, trauma emorragico rianimato e trapianto di polmone. Attualmente ci sono limitate opzioni di trattamento efficaci per LIRI. Qui, presentiamo un modello chirurgico reversibile di IR polmonare che coinvolge prima l'intubazione orotracheale seguita da ischemia unilaterale del polmone sinistro e riperfusione con ventilazione alveolare preservata o scambio gassoso. I topi subiscono una toracotomia sinistra, attraverso la quale l'arteria polmonare sinistra viene esposta, visualizzata, isolata e compressa utilizzando un nodo reversibile. L'incisione chirurgica viene quindi chiusa durante il periodo ischemico e l'animale viene risvegliato ed estubato. Con il topo che respira spontaneamente, la riperfusione viene stabilita rilasciando il nodo scivoloso attorno all'arteria polmonare. Questo modello di sopravvivenza clinicamente rilevante consente la valutazione del danno IR polmonare, della fase di risoluzione, degli effetti a valle sulla funzione polmonare, nonché di modelli a due colpi che coinvolgono la polmonite sperimentale. Sebbene tecnicamente impegnativo, questo modello può essere padroneggiato nel corso di poche settimane o mesi con un eventuale tasso di sopravvivenza o successo dell'80% -90%.

Introduzione

La lesione da riperfusione ischemia (IR) può verificarsi quando il flusso sanguigno viene ripristinato in un organo o in un letto di tessuto dopo un certo periodo di interruzione. Nel polmone, l'IR può verificarsi isolatamente o in associazione con altri processi dannosi come infezione, ipossia, atelettasia, volutrauma (da alti volumi correnti durante la ventilazione meccanica), barotrauma (picchi elevati o pressioni sostenute durante la ventilazione meccanica) o contusioni polmonari^contundenti (non penetranti) ^1,2,3 . Rimangono diverse lacune nella nostra conoscenza dei meccanismi di LIRI e dell'impatto dei processi concomitanti (ad esempio, infezione) sugli esiti LIRI, e anche le opzioni di trattamento per LIRI sono limitate. È necessario un modello in vivo di LIRI puro per identificare la fisiopatologia del danno IR polmonare in isolamento e per studiare il suo contributo a qualsiasi processo multi-hit di cui il danno polmonare è una componente.

I modelli IR polmonari murini possono essere utilizzati per studiare la fisiopatologia polmonare specifica di più processi, tra cui il trapianto polmonare³, l'embolia polmonare⁴ e la lesione polmonare a seguito di trauma emorragico con rianimazione⁵. I modelli attualmente utilizzati includono il trapianto polmonare chirurgico⁶, il clampaggio ilare⁷, la perfusione polmonare ex vivo ⁸ e il polmone ventilato IR⁹. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello IR polmonare ventilato murino di danno polmonare sterile. Ci sono molteplici vantaggi di questo approccio (Figura 2), tra cui che induce ipossia minima e atelettasia minima, ed è un modello di chirurgia di sopravvivenza che consente studi a lungo termine.

I motivi per scegliere questo modello di LIRI rispetto ad altri modelli come il clampaggio ilare e i modelli di perfusione ex vivo sono i seguenti: questo modello riduce al minimo i contributi infiammatori di atelettasia, ventilazione meccanica e ipossia; preserva la ventilazione ciclica; mantiene intatto un sistema immunitario circolatorio in vivo che può rispondere alla lesione IR; Infine, come procedura di sopravvivenza, consente l'analisi a lungo termine dei meccanismi di generazione di lesioni secondarie (modelli 2-hit) e risoluzione delle lesioni. Nel complesso, riteniamo che questo modello IR polmonare ventilato fornisca la forma "più pura" di lesione IR che possa essere studiata sperimentalmente.

Altre pubblicazioni hanno descritto l'uso dell'intubazione orotracheale dei topi per eseguire iniezioni o installazioni IT^10,11, ma non come punto di partenza per un intervento chirurgico di sopravvivenza come in questo modello. Il posizionamento di un tubo orotracheale consente l'esecuzione della chirurgia polmonare consentendo il collasso del polmone operativo. Consente inoltre il regonfiamento del polmone alla fine della procedura, che è fondamentale per il pneumotorace e per la capacità del topo di tornare alla ventilazione spontanea al termine delle procedure. Infine, la rimozione del tubo orotracheale assicurato è una procedura semplice che, a differenza di una tracheotomia invasiva, è compatibile con un intervento chirurgico di sopravvivenza. Ciò consente studi di ricerca a lungo termine incentrati sulla comprensione della progressione e della risoluzione del LIRI e dei disturbi associati, nonché sulla creazione di modelli di lesioni croniche.

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Protocollo

Tutte le procedure e le fasi descritte di seguito sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università della California di San Francisco. È possibile utilizzare qualsiasi ceppo di topo, sebbene alcuni ceppi abbiano una risposta infiammatoria IR polmonare più robusta rispetto ad altri¹². I topi che hanno circa 12-15 settimane di età (30-40 g) o più anziani tollerano e sopravvivono alla chirurgia IR polmonare meglio dei topi più giovani. Sia i topi maschi che le femmine possono essere utilizzati per questi interventi chirurgici.

1. Protocollo di intubazione del topo

1. Anestesia e preparazione per l'intubazione
   1. Pulire l'addome del topo con un tampone di etanolo. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo (250-400 mg/kg). Valutare la profondità appropriata dell'anestesia dalla mancanza di riflesso di ritiro del pedale. Posizionare un unguento lubrificante per gli occhi ora o più tardi (passaggio 2.1.4).
      NOTA: Per questa procedura, il tribromoetanolo (e l'etomidato come opzione alternativa) fornisce un piano anestetico stabile senza influire sulle condizioni emodinamiche richieste per questo intervento chirurgico. Questo anestetico viene utilizzato solo una volta per evitare il rischio di aderenze peritoneali. Anche l'isoflurano potrebbe essere usato, ma non lo usiamo qui. Il praticante è libero di usare qualsiasi ricetta anestetica ritenga opportuna.
   2. Posizionare il topo anestetizzato su un supporto per intubazione o un supporto di plastica in posizione supina, sospeso dagli incisivi superiori su suture 4-0 ad anello (seta o altro) su due ancoraggi di supporto.
   3. Per mantenere il topo immobilizzato durante la procedura di intubazione, fissare liberamente la parte inferiore del torace (o entrambi gli arti superiori) alla piattaforma.
   4. Posizionare delicatamente la luce flessibile a fibre ottiche sulla trachea del mouse, leggermente al di sotto delle corde vocali. Regolare il livello di illuminazione in modo che sia visibile solo un campo scuro quando si guarda nell'orofaringe del topo, ad eccezione della luce rossa che emana da sotto le corde vocali, dimostrando il bersaglio per l'eventuale posizionamento del tubo endotracheale. Si noti che i movimenti delle corde vocali dovrebbero essere visibili ad occhio nudo o, se necessario, sotto ingrandimento.
2. Procedura di intubazione
   1. Tenere le pinzette con la mano dominante e usarle per afferrare delicatamente e tirare la lingua fuori dalla cavità orale.
   2. Aprire la mascella inferiore usando una pinza tenuta dalla mano non dominante, quindi spingere la pinza nella laringe per sollevare delicatamente l'epiglottide. In questo momento, rilascia la lingua dalle pinzette.
   3. Cerca le corde vocali. Dovrebbero aprirsi e chiudersi secondo ogni respiro. Tenendo la cannula con il filo guida precaricato, inserire la punta del filo attraverso le corde vocali.
   4. Facendo molta attenzione a non muovere il filo tenendo una porzione di esso che si trova all'esterno della cannula ma appena sopra le corde vocali, ritirare la cannula, lasciando solo il filo in posizione con la sua estremità distale all'interno della trachea.
   5. A questo punto, eseguire una seconda visualizzazione delle corde vocali per confermare che la punta distale del filo rimane passata attraverso le corde vocali illuminate e nella trachea e non si trova nell'esofago spento.
   6. Tenere il filo fuori dalla bocca con la pinza curva nella mano sinistra, stabilizzata contro una superficie dura, e far avanzare con attenzione il catetere 20G con ali di nastro sul filo.
   7. Una volta che l'estremità distale del filo emerge dall'estremità posteriore del catetere 20G o del tubo endotracheale, tenere quell'estremità con la pinza curva e far avanzare dolcemente il catetere 20G nella trachea.
   8. Rimuovere con cautela il filo dall'estremità distale del catetere 20G con la pinza curva senza rimuovere il posizionamento del catetere.
   9. Collegare brevemente il catetere al ventilatore prima di fissarlo per confermare il corretto posizionamento nella trachea e non nell'esofago. Confermare il posizionamento tracheale osservando i movimenti bilaterali della parete toracica dipendenti dalla ventilazione meccanica e l'assenza di gonfiaggio dello stomaco.
3. Post-intubazione
   1. Scollegare il catetere dal ventilatore. Fissare le ali del nastro (attaccate al catetere) attraverso il labbro inferiore del mouse utilizzando una sutura vicrylica 4-0 per fissare saldamente il tubo endotracheale (ETT) al mouse durante tutte le successive procedure / manipolazioni.
      NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare nastro di seta o altro nastro per fissare l'ETT, tuttavia è necessario prestare attenzione per evitare lo spostamento dell'ETT durante il movimento dell'animale dalla slitta di intubazione alla superficie chirurgica.
   2. Rimuovere con cautela il mouse dalla slitta di intubazione. Collegare brevemente il catetere al ventilatore impostato a un volume corrente di 0,2-0,225 ml e una frequenza respiratoria di 120-150 respiri al minuto per confermare il corretto posizionamento tracheale del tubo orotracheale e quindi disconnettere con il topo che respira spontaneamente attraverso il tubo orotracheale.
   3. Non lasciare l'animale incustodito da questo punto in poi fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la sdraiata sternale alla fine della procedura.

2. Ischemia polmonare e protocollo chirurgico di riperfusione (IR)

1. Analgesia e preparazione del sito chirurgico
   1. Pulire l'addome del topo con un tampone etanolo e iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via intraperitoneale.
   2. Rasare i capelli sulla zona del torace sinistro fino alla scapola sinistra. Rimuovere i peli rasati in eccesso con tamponi imbevuti di alcool.
      NOTA: I passaggi 2.1.1 e 2.1.2 possono essere eseguiti anche prima dell'intubazione se vi è preoccupazione per lo spostamento dell'ETT quando fissato con nastro di seta.
   3. Posizionare il mouse su un pad riscaldante in posizione laterale sinistra o ruotata di 3/4 e collegare il tubo tracheale sul ventilatore con un volume corrente di 0,2-0,225 ml (~ 8 mg / kg) e una frequenza respiratoria di 120-150 respiri al minuto. Non utilizzare ossigeno supplementare per questa procedura.
   4. Applicare il lubrificante per gli occhi con un tampone sterile di cotone. Ruotare il mouse a 3/4 del lato sinistro verso l'alto e immobilizzare tutti e quattro gli arti e la coda con nastro da laboratorio.
   5. Disinfettare la zona della pelle rasata e la pelliccia circostante con povidone-iodio e attendere che la soluzione si asciughi. Quindi coprire il campo chirurgico con un drappo sterile o un film plastico trasparente e creare un'apertura rettangolare nel drappo o nel film plastico per il campo chirurgico.
2. Procedura chirurgica
   1. Confermare il livello appropriato di anestesia (fornito dalla somministrazione di tribromoetanolo e buprenorfina come descritto in precedenza) testando la risposta al pizzico del piede.
   2. Usando un paio di forbici affilate e un paio di pinze più grandi (pinze a pattern stretto o simili), fai un'incisione cutanea trasversale di 2 cm sotto l'angolo inferiore della scapola nel torace laterale sinistro. Usa le forbici e un paio di pinze più fini (pinze extra fini o simili) per tagliare lo strato muscolare e sezionare fino alle costole.
   3. Identificare il secondo spazio intercostale e tenere la seconda costola con la pinza extra fine. Tirando la costola verso l'alto, utilizzare una lama sterile #11 o #12 (curva) per bisturi (senza maniglia necessaria) per entrare nello spazio pleurico separando e tagliando attraverso i muscoli intercostali del 2 ° -3^° spazio. Prendi in considerazione la sospensione della ventilazione per ridurre le lesioni all'apice del polmone sinistro.
   4. Inserire tre divaricatori sterilizzati. Utilizzare il riavvolgitore cefalo più piccolo / più stretto lungo l'orientamento delle costole, il divaricatore di medie dimensioni a sinistra lungo la 2 ° costola e il più grande divaricatore a destra lungo la superficie della 3^° costola.
   5. Aprire il torace con una retrazione lenta e progressiva utilizzando le corde elastiche del divaricatore. Esporre e identificare l'arteria polmonare sinistra (PA) spostando l'apice del polmone sinistro con un tampone sterile di cotone.
   6. Utilizzare le micro pinze, le pinze ultrafini nella mano destra e le pinze dilatatorie PA o vaso nella mano sinistra, per esporre delicatamente e creare il campo in cui il PA sinistro e il bronco sono entrambi visibili.
   7. Usando la pinza PA, prendi il PA sinistro e tira delicatamente ma saldamente verso l'alto e cefalade per visualizzare il bronco trasparente sottostante. Aumentare l'ingrandimento sul microscopio a dissezione (vedere l'elenco delle apparecchiature per maggiori dettagli) a questo punto al massimo (2x).
      NOTA: Sterilizzare tutte le apparecchiature prima dell'uso. Inoltre, per mantenere la sterilità, solo le punte degli strumenti chirurgici dovrebbero entrare nel campo chirurgico sterile.
   8. Mentre si ritrae il PA lontano dal bronco, passare con attenzione la pinza ultrafine chiusa attraverso lo spazio tra il PA sinistro e il bronco. Quindi, usa queste pinze per tenere e tirare un 7-0 o 8-0 sutura di prolene attraverso lo spazio tra l'arteria polmonare sinistra (sopra) e il bronco (sotto).
   9. Circondare il PA sinistro legando un nodo per creare un'occlusione nel PA. L'interruzione del flusso sanguigno è facilmente visualizzabile al microscopio. Questo segna l'inizio del periodo ischemico.
   10. Esternare l'estremità libera del nodo attraverso un diverso punto di ingresso nel torace anteriore sinistro utilizzando un ago 24G-28G e fissare l'estremità della sutura con un piccolo pezzo di nastro adesivo per una più facile identificazione in seguito.
   11. Rigonfiare il polmone per espellere quanta più aria possibile dalla cavità toracica utilizzando una valvola / tubo PEEP sul ventilatore del roditore. Quindi, chiudere la gabbia toracica con due suture di nylon 4-0 interrotte.
   12. Chiudere lo strato muscolare e sottocutaneo con una sutura di nylon 4-0 in esecuzione. Quindi applicare due o tre gocce di bupivacaina topica (0,5%) all'incisione. Utilizzare una sutura di nylon 4-0 per chiudere lo strato di pelle con una sutura corrente.
3. Assistenza post-operatoria
   1. Quando la ventilazione spontanea è ripresa, scollegare il tubo endotracheale dal ventilatore ed estubare il topo.
   2. Posizionare il mouse sul pad riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante il recupero post-anestesia.
   3. Monitorare attentamente il mouse durante il recupero dall'anestesia generale. Tirare delicatamente lo slipknot esternalizzato alla fine del periodo ischemico (30 min o 1 h).
   4. Spostare il mouse dal pad riscaldante a una gabbia una volta che ha mostrato segni di recupero: auto-raddrizzamento e / o movimento.
   5. Dopo il periodo di riperfusione (1 ora o 3 ore), eutanasia l'animale e raccogliere il sangue mediante puntura cardiaca e tessuto polmonare per ulteriori analisi. Per 1 ora di riperfusione, raccogliere plasma per ELISA, tessuto per RNA e analisi delle proteine; Per 3 ore di riperfusione, raccogliere inoltre il tessuto per l'istologia.

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Risultati

Infiammazione generata da lesione unilaterale ventilata da ischemia polmonare sterile (IR): dopo 1 ora di ischemia, abbiamo osservato un aumento dei livelli di citochine nel siero e all'interno del tessuto polmonare sia mediante ELISA che qRT-PCR che hanno raggiunto il picco a 1 ora dopo la riperfusione e sono tornati rapidamente al basale entro 12-24 ore dopo la riperfusione¹³. Per i campioni raccolti a 3 ore dopo la riperfusione, abbiamo osservato un'intensa infiltrazione di neutrofili all'inter...

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Discussione

Questo manoscritto descrive in dettaglio i passaggi coinvolti nell'esecuzione del modello IR polmonare ventilato sviluppato da Dodd-o et ^al.9. Questo modello ha contribuito a identificare i percorsi molecolari coinvolti nella generazione e risoluzione dell'infiammazione da IR polmonare in isolamento 14,15,16,17, IR polmonare in combinazione con infezione coesistente 18 e IR polmonare in relazione all'asse intestino-polmone e al contributo del microbioma intestinale

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle